專(zhuān)利名稱(chēng)：特應(yīng)性皮炎的檢查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷特應(yīng)性皮炎、判定其治療效果的檢查方法。
背景技術(shù)：
特應(yīng)性皮炎是ー種表現(xiàn)為皮膚炎癥或斑疹、濕疹的疾病。特應(yīng)性皮炎一般被認(rèn)為是由容易引起特應(yīng)型支氣管哮喘過(guò)敏性鼻炎、皮炎蕁麻疹的過(guò)敏體質(zhì)(特應(yīng)性素質(zhì))，再加上各種刺激而產(chǎn)生的伴有瘙癢的慢性皮膚疾病。約8成患者是在5歲以前的幼兒時(shí)期發(fā)病。先前認(rèn)為到了學(xué)齡兒童期就會(huì)自然治愈，然而近年來(lái)，一直持續(xù)到成年的病例、或成年后發(fā)病或復(fù)發(fā)的病例持續(xù)增加。其通常是ー種難以治愈的疾病，并且在早期階段可能會(huì)被混同 為其他皮炎的患者。特應(yīng)性皮炎(過(guò)敏性皮炎)的治療方法除了類(lèi)固醇、抗組織胺劑以及其他藥物療法之外，還有照射UVA (紫外線A波)的PUVA療法等。由于特應(yīng)性皮炎會(huì)反復(fù)惡化、緩解，因此，難以判定治療效果或判斷治療進(jìn)展，期望能夠開(kāi)發(fā)出ー種新的診斷法。近年來(lái)，提出了ー種著眼于特應(yīng)性皮炎患者的皮膚中的各種基因表達(dá)的變化或各種免疫相關(guān)物質(zhì)的變化從而進(jìn)行特應(yīng)性皮炎診斷的方法。例如，在專(zhuān)利文獻(xiàn)I中，提出一種測(cè)定人的角質(zhì)層的白介素I、白介素I的受體或拮抗劑的變化從而進(jìn)行診斷的方法。在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中，提出ー種測(cè)定臂板蛋白(Semaphorin) 3A的基因表達(dá)從而進(jìn)行診斷的方法，其中，臂板蛋白3A是抑制神經(jīng)軸突的伸長(zhǎng)的因子。在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中，通過(guò)分析在特應(yīng)性皮炎患者的皮膚中異常増加或異常減少的蛋白質(zhì)，確定了 23種蛋白質(zhì)，提出了一種通過(guò)分析這些蛋白質(zhì)的表達(dá)或基因變化，從而對(duì)特應(yīng)性皮炎進(jìn)行診斷的方法。目前各種診斷方法或檢查方法仍在探索中。[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)](專(zhuān)利文獻(xiàn))專(zhuān)利文獻(xiàn)I :日本特開(kāi)平10-2213400號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2008-107275號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 國(guó)際公開(kāi)第2007/046463號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
[發(fā)明所要解決的問(wèn)題]本發(fā)明的目的在于提供一種可以準(zhǔn)確地對(duì)特應(yīng)性皮炎的診斷或進(jìn)展進(jìn)行診斷的檢查方法。[解決問(wèn)題的技術(shù)手段]本發(fā)明人著眼于熱休克蛋白中的ー種熱休克蛋白27(HSP27)，測(cè)定健康者的皮膚及特應(yīng)性皮炎患者的疾患處、非疾患處中的HSP27表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康者相比，特應(yīng)性皮炎患者的HSP27表達(dá)水平較高，并且，在特應(yīng)性皮炎患者未顯現(xiàn)特應(yīng)癥狀的部位中的HSP27表達(dá)水平較少?；谶@種認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)測(cè)定皮膚樣本中的HSP27，即可診斷特應(yīng)性皮炎的診斷或治療進(jìn)展等，從而完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，本發(fā)明為如下構(gòu)成(I) 一種特應(yīng)性皮炎的檢查方法，其特征在于測(cè)定皮膚樣本中的熱休克蛋白27，并與事先測(cè)定的正常皮膚樣本的熱休克蛋白27的測(cè)定值進(jìn)行對(duì)比。(2)根據(jù)(I)所述的檢查方法，其中，皮膚樣本為皮膚角質(zhì)層。(3)根據(jù)(I)或(2)所述的檢查方法，其中，皮膚樣本是利用剝離操作由人的皮膚而得到的。(4)根據(jù)(I)至(3)中任一項(xiàng)所述的檢查方法，其中，熱休克蛋白27的測(cè)定采用蛋白質(zhì)印跡法。 [發(fā)明的效果]利用本發(fā)明的檢查方法，能夠正確判定反復(fù)惡化、緩解的特應(yīng)性皮炎的治療進(jìn)展、治療效果等。并且，可以預(yù)測(cè)發(fā)病。而且，也很容易采取檢查對(duì)象的皮膚樣本，可以減少患者的負(fù)擔(dān)，簡(jiǎn)便地進(jìn)行檢查。


圖I是將特應(yīng)性皮炎的癥狀與人的皮膚中的HSP27的量對(duì)應(yīng)表示的圖。表明HSP27隨著特應(yīng)性皮炎的癥狀的惡化而增加。
具體實(shí)施例方式已知HSP對(duì)細(xì)胞加熱產(chǎn)生反應(yīng)而進(jìn)行表達(dá)，并且已知這種表達(dá)是由對(duì)于例如細(xì)菌感染或炎癥、酒精、活性氧、重金屬、紫外線、饑餓及低氧等的細(xì)胞的各種應(yīng)激反應(yīng)而衍生出來(lái)的。核內(nèi)蛋白質(zhì)熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF)通過(guò)與DNA上的熱休克元件(HSE)結(jié)合，作為控制HSP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，然而關(guān)于因熱應(yīng)カ而誘導(dǎo)HSF的詳細(xì)機(jī)制并不十分明確。在與特應(yīng)性皮炎的關(guān)系中，已知HSP60或HSP70、HSP90等高分子HSP會(huì)發(fā)生變化，然而，卻完全不知低分子HSP、即本發(fā)明的HSP27也會(huì)涉及其中，也沒(méi)有任何啟發(fā)性資料。在本發(fā)明的檢查方法中，測(cè)定皮膚樣本中的HSP27的基因量或蛋白質(zhì)量。在此，皮膚樣本優(yōu)選包含人的表皮的皮膚樣本，可以通過(guò)活組織檢查由人的皮膚上采取。在皮膚上粘貼粘性膠帶，并剝離粘性膠帶時(shí)，將附著在膠帶上的角質(zhì)層作為樣本，是減少患者負(fù)擔(dān)的ー種方法，這種方法通常稱(chēng)為膠帶剝離法。在將皮膚樣本中的HSP27作為遺傳樣本進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可以采用諸如RT-PCR法等方法。并且，可以通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)進(jìn)行HSP27基因的定量。作為HSP27蛋白質(zhì)的測(cè)定手段，可以采用如免疫染色等方法?？梢允褂檬惺燮纷鳛榭笻SP27抗體及其標(biāo)記體用于測(cè)定。當(dāng)進(jìn)行免疫染色時(shí)，可以通過(guò)熒光免疫染色等進(jìn)行測(cè)定。HSP27的定量可以通過(guò)利用市售的測(cè)定裝置和軟件對(duì)熒光強(qiáng)度等進(jìn)行定量來(lái)實(shí)現(xiàn)。并且，在以本發(fā)明作為診斷用藥時(shí)，優(yōu)選含有上述抗HSP27抗體及其標(biāo)記體、第二抗體、標(biāo)記第二抗體等。而且，也可以是組合了用于分析的緩沖液等的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明人在測(cè)定健康者的皮膚中的HSP27時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有健康者的皮膚的值均較低。另ー方面，確認(rèn)了診斷為特應(yīng)性皮炎的患者的表現(xiàn)為皮炎的部位的皮膚中，與健康者相比，HSP27顯著增加。即使是同一患者，其未表現(xiàn)為皮炎的部位的皮膚的HSP27雖然低于患部，但高于健康者。因此，通過(guò)觀察皮膚、尤其是表皮的HSP27的變化量，即可診斷特應(yīng)性皮炎的進(jìn)展、治療效果及治療進(jìn)展等。[實(shí)施例]以下，通過(guò)列舉實(shí)施例來(lái)詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，然而，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。A.方法(I)皮膚角質(zhì)層采取方法對(duì)診斷為特應(yīng)性皮炎的4名女性患者，將其表現(xiàn)為皮炎的頸部皮膚，使用角質(zhì)測(cè)試儀(2. 5cmX2. 5cm :Asahibiomed公司制造)，進(jìn)行5張膠帶剝離,米取角質(zhì)層。并且,在從未表現(xiàn)為皮炎癥狀的上臂部皮膚上，同樣地進(jìn)行了取樣。
同樣地，從3名健康女性的頸部皮膚、上臂部皮膚上進(jìn)行取樣，作為對(duì)照。(2)皮膚角質(zhì)層中蛋白質(zhì)提取方法向均質(zhì)化用管中采取1% SDS/PBS(_)200ul，井向其中裝入進(jìn)行了上述膠帶剝離的角質(zhì)層檢測(cè)工具，通過(guò)使用均質(zhì)用研棒摩擦粘著面，從膠帶的角質(zhì)層中提取出蛋白質(zhì)。(3)皮膚角質(zhì)層蛋白質(zhì)的定量利用DC Protein Assay Kit (Bio-Rad制造)，對(duì)角質(zhì)層提取液中所含的蛋白質(zhì)量
進(jìn)行定量。(4)利用蛋白質(zhì)印跡法定量HSP27使用XP PANTERA Gel (5_20 % 梯度膠DRC 公司制造)通過(guò) SDS-PAGE 將 I. 5 μ g的角質(zhì)層蛋白質(zhì)分離，然后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄到PVDF膜上，通過(guò)StartingBlock BlockingBuffer (Thermo Scientific 公司制造)進(jìn)行了封閉。將一級(jí)抗體(Hsp27 PolyclonalAntibody Stressgen 公司制造)稀釋 1000 倍，將ニ級(jí)抗體(Goat anti-mouse IgG invitrogen公司制造)稀釋10000倍,并使其反應(yīng),然后，使用ECLplus(BD Bioscience公司制造)，在LAS-4000mini (富士膠片公司制造)中進(jìn)行檢測(cè)。利用Science Lab 2004Multi Gauge (富士膠片公司制造)對(duì)所獲得的波段的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行了數(shù)字化。將發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度作為HSP27的相對(duì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。B.結(jié)果將特應(yīng)性皮炎患者(AD)以及健康者皮膚角質(zhì)層的HSP27發(fā)光強(qiáng)度(AU)測(cè)定的結(jié)果顯不于表I、圖I。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種特應(yīng)性皮炎的檢查方法，其特征在于測(cè)定皮膚樣本中的熱休克蛋白27，并與事先或同時(shí)測(cè)定的正常皮膚樣本的熱休克蛋白27的測(cè)定值進(jìn)行對(duì)比。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢查方法，其特征在于，皮膚樣本為皮膚角質(zhì)層。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的檢查方法，其特征在于，皮膚樣本是利用剝離操作由從人體皮膚上得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至權(quán)利要求3中任一項(xiàng)所述的檢查方法，其特征在于，熱休克蛋白27的測(cè)定采用蛋白質(zhì)印跡法。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種進(jìn)行特應(yīng)性皮炎檢查的方法，該方法不會(huì)對(duì)使用者造成負(fù)擔(dān)。通過(guò)利用膠帶剝離法等，無(wú)創(chuàng)傷性地采取皮膚角質(zhì)層，并測(cè)定其中含有的HSP27的含量來(lái)診斷特應(yīng)性皮炎。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102650639SQ20121004138
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者石渡潮路 申請(qǐng)人:株式會(huì)社芳珂