專利名稱：Sirt5調(diào)節(jié)劑及其篩選方法
Sirt5調(diào)節(jié)劑及其篩選方法交叉引用美國相關(guān)專利申請本發(fā)明要求美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)(申請?zhí)?N0.61/362，078，申請日:2010年7月7日)，在此將其作為參考文獻整體引用并到本發(fā)明中。關(guān)于美國聯(lián)邦資助研究的說明本發(fā)明得到美國政府的資助，獲得NIH基金，合同號為GM086703。因此政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
沉默信息調(diào)控蛋白2 (Sir2)或者叫去乙?；?Sirtuins)，是一個具有輔酶(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)依賴蛋白去乙?；钚缘倪M化保守的酶家方矣(A.A.Sauve, et al., Annu.Rev.Biochem.75:435 (2006) ；S.-1.1mai, et al., Trendsin Pharmacological Sciences 31:212(2010) ；M.C.Haigis, et al., Annual Reviewof Pathology:Mechanisms of Disease 5:253 (2010)).自從最初發(fā)現(xiàn) sirtuin 的去乙酸活性(S._1.1mai, et al., Nature 403:795 (2000) ；K.G.Tanner, et al., Proc Natl.Acad.Sc1.U.S.A.97:14178 (2000))，揭示了 sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很好的理解了 NAD 依賴的去乙酸機制(S.- 1.1mai, et al., Trends in PharmacologicalSciences 31:212 (2010) ；M.C.Haigis, et al., Annual Review of Pathology:Meehanismsof Disease 5:253(2010))?；谛蛄械南嗨菩?，sirtuins被分為不同的類型(R.A.Frye, Biochem, Biophys.Res.Commun.273:793 (2000))。哺乳動物有 7 種 sirtuins,Sirtsl-7。Sirtsl-3屬于第一類,Sirt4屬于第二類，Sirt5屬于第三類，Sirt6和Sirt7屬于第四類(R.A.Frye, Biochem.Biophys.Res.Commun.273:793 (2000))。研究sirtuin活性的一個主要障礙在于7種人類sirtuins中的4種(Sirt4_7)要么有非常弱的去乙?；钚?，要么沒有去乙?；钚?E.Michishita, et al.，Mol.Biol.Cell16:4623 (2005) ；M.C.Haigis et al., Cell 126:941 (2006) ;Α.Schuetz et al., Structure15: 377 (2007) ；G.Liszt, et al., J.Biol.Chem.280:21323(200 5) ；E.Michishita etal., Nature 452:492(2008))。這對研究Sirtuins和開發(fā)調(diào)節(jié)他們活性的小分子帶來了許多困難。比如，由于沒有強活性檢測方法，所以難以開發(fā)以Sirts4-7為靶點的抑制劑或激活劑。也難以確認以Sirtl、Sirt2和Sirt3為靶點的抑制劑或激活劑是否也同樣作用于Sirts4_70發(fā)明概沭Sirt5，一種線粒體去乙?；福话l(fā)現(xiàn)是一種有效的脫丙二酰和脫琥珀酰酶。這個發(fā)現(xiàn)證明了哺乳動物線粒體蛋白新的翻譯后進行修飾的過程，即賴氨酸殘基的丙二酰化和琥珀?；?。Sirt5去除線粒體蛋白賴氨酸殘基上的戊二酰，丙二酰和琥珀?；鶊F，這個過程被認為可以可逆的調(diào)節(jié)線粒體蛋白的活性。由于發(fā)現(xiàn)了這個強酶活性，使得能夠開發(fā)識別Sirt5調(diào)節(jié)劑的方法。Sirt5特異性的調(diào)節(jié)劑可被用于研究Sirt5的生物功能和革巴向Sirt5活性用于治療人類疾病。附圖簡沭


圖1:使用AMC-琥珀酰肽來測試Sirt5的熒光實驗。圖2A-2D:Sirt5的結(jié)構(gòu)揭示了一個不尋常的酰基袋。(A)Sirt5的?；籆HES的緩沖分子與Argl05和Tyrl02相互作用產(chǎn)生的硫酸鹽部分占據(jù)。所述硫酸酯距離硫代乙?；鶊F4.2A, (B)Sirt5-硫代乙酰肽結(jié)構(gòu)和Sir2Tm-乙酰肽結(jié)構(gòu)的對比。(C)理論預(yù)測丙二酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。(D) Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重結(jié)構(gòu)表明琥珀?；鶊F和Tyrl02和Argl05的相互作用。圖3A-3F:Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰賴氨酸的水解。純化的去乙?；?Sirtl
0.75μΜ或Sirt53.3μΜ)和0.3mM的?；囊黄鸱跤?，1.0mM NAD加到含有ImM DTT的60 μ L的20mM Tris-HCl緩沖液中(ρΗ7.5)，在37°C反應(yīng)2小時。反應(yīng)用60 μ L10%TFA終止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反應(yīng)混合物。灰色曲線表明?；牡馁|(zhì)量(乙酰肽，m/zl274.0 ;丙二酰肽，m/zl318.0 ;琥珀酰肽，m/zl332.0)和脫乙酰肽的質(zhì)量(m/zl232.0)的離子峰強度(IOx放大)。黑色曲線表明所有從100-2000的質(zhì)量(總離子數(shù)或者TIC)的離子峰強度。對于Sirtl，當H3K9乙酰肽(A)作為底物時可檢測出脫乙酰產(chǎn)物，當使用H3K9丙二酰(B)和琥珀酰(C)肽時沒有水解產(chǎn)物被檢出。對于Sirt5，脫乙酰產(chǎn)物很少被檢出(D)，而脫丙二酰(E)和脫琥珀酰(F)產(chǎn)物可以被檢出。圖4A-4B:㈧琥珀酰賴氨酸殘基存在于牛肝臟線粒體中。使用32P-NAD可以檢出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P標記的O-Ma-ADPR(條帶2)和O-Su-ADPR(條帶3)。用乙酰肽則沒有反應(yīng)發(fā)生(條帶I)。當組蛋白被用作乙酰賴氨酸(條帶8)或H3K9乙酰肽(條帶4)的來源時，Sirtl催化的O-Ac-ADPR的形成可以被檢測出來。當用32P-NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝臟線粒體肽時形成O-Su-ADPR(條帶9)，但用Sirtl則不能形成(條帶10)，這表明琥珀酰賴氨酸殘基存在于牛肝臟線粒體肽提取物中。作為對照組的用BSA肽和Sirt5的反應(yīng)不會產(chǎn)生0-Su-ADPR(條帶12)。⑶38能水解NAD產(chǎn)生ADPR，它被用來產(chǎn)生在第13條帶上的標準32P-ADPR點。(B) Sirt5的缺失可以增加老鼠肝臟部位的C PSl琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝臟中免疫沉淀出CPS1，用32P-NAD檢測出琥珀酰化水平。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用來分別產(chǎn)生對照點 0-Ac-ADPR，O-Ma-ADPR 和 O-Su-ADPR。圖5A-5C =Sirtl和Sirt5催化的H3K9肽(A)脫乙?；敲摫；?C)脫琥珀?；ㄟ^HPLC被檢測(檢測波長為215nm)。一個更長的HPLC柱被用于更好地分離?；暮兔擋；摹＝Y(jié)果進一步表明Sirtl有更好的脫乙?；钚裕鳶irt5有更好的脫丙二酰和脫琥珀?；钚浴D6A-6B: (A)表示Sirtuin催化的NAD依賴的脫?；磻?yīng)，這個反應(yīng)產(chǎn)生O-?；?ADP-核糖。(B) sirtuin催化的NAD依賴的脫乙?；臋C理。圖7A-7D:0-丙二酰-ADPR的⑷和O-琥珀酰-ADPR⑶的HPLC純化及MS確認(C和D)。在A和B中的黑色曲線是Sirt5催化的H3K9?；拿摫；兔撶牾；腍PLC曲線(檢測波長為260nm)。用Sirtl孵育的肽沒有產(chǎn)生相同的產(chǎn)物(灰色曲線)。O-丙二酰-ADPR(C)和O-琥珀酰-ADPR(D)進一步通過MALD1-MS分析。O-丙二酰-ADPR和O-琥珀酰-ADPR的形成表明Sirt5催化的反應(yīng)機制和第一類的脫乙?；傅拿撘阴；瘷C制相同。圖8:Sirt5催化的脫丙二酰和脫琥珀酰反應(yīng)。
圖9:受保護的硫代琥珀酰賴氨酸化合物的合成，被用于制備H3K9TSU肽。圖10:AMC_琥珀酰肽的合成。圖 11:1SGASE (SuK) -AMC 是 Sirt5 的底物。ISGASE (SuK) -AMC 肽在有或沒有 Sirt5下孵育4小時，然后加Iyg胰蛋白酶孵育3小時。與沒有Sirt5的陰性對照相比，1，2，和5μΜ的Sirt5使熒光分別增加11，20，和26倍。圖 12:SGASE (SuK) -AMC 不是 Sirtl, 2,和 3 的底物。ISGASE (SuK) -AMC 肽用 I μ M不同的去乙?；阜跤?小時，然后用I μ g胰蛋白酶孵育3小時。與沒有去乙?；傅年幮詫φ障啾龋挥惺褂肧irt5的熒光才增強。 圖13:使用熒光底物ISGASE(SuK)-AMC篩選Sirt5抑制劑。沒有Sirt5和有Sirt5，但是不加小分子的反應(yīng)做對照組。所有小分子的濃度為30 μ M。H3K9TSU和suramin表現(xiàn)出顯著的Sirt5抑制活性。圖14:1SGASE (AcK)-AMC 是 Sirt2 底物。ISGASE (AcK)-AMC 肽用 ΙμΜ 不同的去乙?；阜跤?0小時，然后加入I μ g胰蛋白酶孵育3小時。與沒有去乙?；傅年幮詫φ障啾龋琒irt2增強熒光最多，但Sirt5和Sirt3沒有顯著增強熒光。圖15:使用 ISGASE (AcK)-AMC和 Sirt2 篩選發(fā)現(xiàn)H3K9TSU而不是蘇拉明(suramin)是Sirt5特異性的抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
去乙酰化酶(Sirtuins)是一類進化保守的酶,與很多生物功能有關(guān)。Sirtsl-3被認為有強的脫乙?；钚?，但是在本發(fā)明公開之前，Sirts4-7沒有被發(fā)現(xiàn)有強的酶活性。比如，Sirt5的脫乙?；钚匀酰涿撘阴５男ЯΡ萐irtl低500倍。本發(fā)明第一次發(fā)現(xiàn)Sirt5對丙二酰和琥珀酰肽比對乙酰肽具有更顯著的水解活性。進一步說，本發(fā)明表明在哺乳動物細胞中存在蛋白賴氨酸琥珀酰化和丙二?；Ａ硗?，在Sirt5敲除的小鼠組織中，觀察到CPSl (—個已知的Sirt5靶蛋白)的賴氨酸琥珀?；皆龈?。因此，可以認為Sirt5在體內(nèi)的主要活性是脫琥珀酰和脫丙二酰，而不是脫乙酰。本發(fā)明的研究者發(fā)現(xiàn)了 Sirt5的強酶活性，使開發(fā)鑒別Sirt5特異性調(diào)節(jié)劑的方法成為可能。Sirt5特異性調(diào)節(jié)劑可被用于研究Sirt5的生物功能,可以祀向Sirt5活性用于治療人類疾病。Sirt5 活性本發(fā)明中使用的“Sirt5活性”包括酶去除賴氨酸殘基上的酰基(丙二酰，琥珀酰，戊二酰和乙酰)。所以，Sirt5活性包括賴氨酸殘基的脫丙二酰，脫琥珀酰，脫戊二酰和脫乙酰。在本發(fā)明的一些實施例中，公開了 Sirt5獨特的脫琥珀酰和脫丙二酰活性?！癝irt5脫琥珀酰活性”是指Sirt5酶去除賴氨酸殘基上的琥珀?；！癝irt5脫丙二?；钚浴笔侵窼irt5酶去除賴氨酸殘基上的丙二?；irt5能作用于孤立的帶有?；馁嚢彼釟埢蛘呤亲饔糜谠陔幕虻鞍字械孽；馁嚢彼釟埢?。Sirt5活性，比如，脫琥珀酰和脫丙二?；钚钥梢园l(fā)生在體內(nèi)作為對含有琥珀酰或丙二酰賴氨酸的蛋白翻譯后進行修飾，使得下游生理反應(yīng)的產(chǎn)生?！癝irt5調(diào)節(jié)劑”或“Sirt5調(diào)控劑”或“Sirt5調(diào)控化合物”是可以激活或抑制Sirt5活性的底物。“Sirt5抑制劑”是可以降低或阻止Sirt5活性的底物?！癝irt5激活劑”是可以提高或促進Sirt5活性的底物。檢測Sirt5活性的方法一方面，本發(fā)明公開了一種在樣本中檢測Sirt5脫丙二酰，脫琥珀?；蛎撐於；钚运降膶嶒?。
上述實驗基于含有丙二酰，琥珀酰，或戊二酰賴氨酸的底物。所述賴氨酸連接指示劑部分，所述賴氨酸和指示劑部分間的連接可以被裂解劑裂解，所述裂解劑對賴氨酸殘基的丙二?；?，琥珀酰化或戊二?；癄顟B(tài)敏感。因此，當所述底物在能被Sirt脫丙二?；撶牾；蛎撐於；沫h(huán)境下與Sirt5接觸時，?；娜コ?可能導(dǎo)致裂解部位的暴露)允許裂解劑作用于裂解部位，然后釋放指示劑部分，產(chǎn)生可檢測的信號。用于在實驗中檢測Sirt5活性的合適底物可以是任何含有琥珀酰，丙二?；蛭於Ｙ嚢彼釟埢姆肿?，包括孤立的賴氨酸殘基或者是含有賴氨酸的肽。在具體的實施例中，用于實驗的底物是含有琥珀酰或丙二酰賴氨酸殘基的肽，并連接有指示劑部分。本發(fā)明所使用的術(shù)語“肽”包括通過肽鍵相連的2個或者更多氨基酸。對肽的鏈長沒有特別限制。所述肽鏈短到可以是4到5個氨基酸，也可以長到50個氨基酸或者更長。在一些實施例中，被用于方法的肽的長度是15到25個氨基酸。除了肽一般在C端包括琥珀酰，丙二?；蛭於Ｙ嚢彼嵬?，對肽的氨基酸序列也沒有特別的限制。優(yōu)選的，所述肽底物在丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼釟埢皼]有賴氨酸或者精氨酸殘基，這樣一旦去除琥珀?；虮；?，在琥珀?；虮Ｙ嚢彼岷椭甘緞┎糠珠g的連接(比如酰氨鍵)可以被裂解劑有效地作用。在一個具體實施例中，所述肽鏈具有序列異亮氨酸-絲氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸(ISGASEK，SEQ ID NO:1)，其中所述的賴氨酸是?；?琥珀?；?，丙二?；蛭於；?。不管是孤立的還是作為肽的一部分，所述丙二酰，琥珀酰或戊二酰賴氨酸和指示劑部分連接。所述連接是共價連接，在賴氨酸的?；蝗コ罂梢员涣呀鈩┝呀?。比如，所述共價連接是一個酰胺鍵，形成于丙二酰，琥珀?；蛭於Ｙ嚢彼狒然椭甘緞┗衔锏陌被g，在賴氨酸的?；蝗コ?比如，導(dǎo)致所述肽鍵向蛋白水解酶暴露)易被蛋白水解酶裂解。所述裂解劑可以是任何能可預(yù)見性地裂解在特定氨基酸殘基之間肽的試劑(t匕如蛋白水解的裂解方式)，但是在賴氨酸被琥珀酰化，丙二?；蛘呶於；瘯r不能裂解肽鍵。如一個實施例所述，裂解劑是蛋白水解酶，比如可以水解肽鍵的酶(也指肽酶)。所述的蛋白水解酶包括但不限于胰蛋白酶，鈣蛋白酶，賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，賴氨酸-C蛋白內(nèi)切酶，金屬肽鏈內(nèi)切酶，血纖維蛋白溶酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，凝血酶，彈性蛋白酶，gluc-C, endo Iys-C或者蛋白酶K,半胱天冬酶-1，半胱天冬酶_2，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶_7，半胱天冬酶_8，MetAP-2,腺病毒蛋白酶，HIV蛋白酶等。 在一個具體的實施例中，所述裂解劑是胰蛋白酶。胰蛋白酶水解肽鍵，所述肽鍵的羧基來自賴氨酸和精氨酸殘基；因此，胰蛋白酶可以裂解Sirt5底物的賴氨酸殘基的羧基末端的肽。另外一種合適的裂解劑是胃蛋白酶，它能水解在丙基苯氨酸，色氨酸和酪氨酸殘基的氨基末端的肽鍵。因此，所述胃蛋白酶可以裂解賴氨酸殘基和鄰近的丙基苯氨酸，色氨酸或酪氨酸殘基之間的底物肽。在這些實驗中，Sirt5酶活性是通過蛋白水解消化，用裂解劑從肽上裂解指示劑部分，產(chǎn)生一個可檢測的信號?！爸甘緞┎糠帧笔悄軝z測到Sirt5活性的分子或Sirt5底物的組分。指示劑部分或許可以是，比如，熒光或其他標記分子，比如 -氨基-4-甲基香豆素(AMC)，F(xiàn)LAG，或聚組氨酸抗體標簽。在具體實施例中，所述指示劑部分具有熒光性質(zhì)。在一個實施例中，所述指示劑部分是單獨的熒光小分子或熒光團。所述“熒光團”是指能引起分子發(fā)出熒光的分子組分。它是分子中的功能性基團，能吸收特定波長的能量，并再以特定波長發(fā)射能量。通常的熒光團是異硫氰酸酯的熒光素(FITC)，羅丹明的衍生物(TRITC)，香豆素，芘，青色素，馬來酰亞胺的衍生物染料，CF染料，熒光探針染料，DyLightFluors, Oyester 染料，Atto 染料，HiLyte Fluors,螢光素和 Alexa Fluors0 突光素酶，比如螢火蟲熒光素，當用螢火蟲熒光素酶和ATP孵育時可以發(fā)光。所發(fā)射的光可被用于檢測Sirt5活性。在本發(fā)明的一些實施例中，所使用的熒光團產(chǎn)生的熒光強度或者發(fā)射波長會隨著熒光團和肽之間連接的存在或消失而變化，而且所述熒光強度或發(fā)射波長的改變可以被熒光分光光度計檢測出來。在一個實施例中，所述指示劑部分是氨基甲基香豆素。在一個優(yōu)選的實施例中，所述指示劑部分是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。因此，Sirt5脫琥珀酰活性的熒光底物的一個優(yōu)選的例子是AMC-琥珀酰肽，比如，ISGASE (SuK) -AMC (其中SuK代表琥珀酰賴氨酸)，來自谷氨酸脫氫酶的肽序列。相似的，Sirt5脫丙二?；钚缘臒晒獾孜锏囊粋€例子是AMC-丙二酰肽，比如ISGASE (MaK) -AMC (其中MaK代表丙二酰賴氨酸)。

在另一個實施例中，所使用的熒光團產(chǎn)生的熒光強度或者發(fā)射波長不必須隨著熒光團和肽之間連接的存在或 消失而變化，但是，底物肽也被淬火基團標記。比如，所述熒光團可以和?；嚢彼犭牡聂然┒讼噙B，而所述淬火基團可以和含有?；嚢彼岬碾逆溨械牟煌被嵯噙B。由于底物中存在淬火基團，這些底物的熒光強度較弱。但是，當裂解劑把所述肽賴氨酸殘基的C末端裂解時，所述熒光強度提高。這個可以檢測裂解的底物肽的量。本發(fā)明中適宜的淬火基團包括DNP，Black Hole Quencher 部分，和DABCYL。另外一個實施例中，所述指示劑部分是熒光小分子或熒光團，且屬于供體-受體對熒光團對中的一個。在這個實施例中，所述指示劑熒光團連接于酰化賴氨酸肽的羧基末端(在“FRET”實施例中所述肽典型地包括在?；嚢彼岬腃末端有一個或多個氨基酸)，供體-受體對熒光團對中的另一個分子位于附近，比如與所述肽底物的另一個氨基酸相連。因此，在賴氨酸和指示劑部分之間的連接被裂解之前，所述鄰近的供體-受體熒光團從供體和受體間進行能量轉(zhuǎn)移，所述能量轉(zhuǎn)移可以被FRET檢測。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一個非輻射性的途徑，在電子激發(fā)狀態(tài)的分子通過FRET可以釋放能量返回到更穩(wěn)定的基態(tài)。所述能量的轉(zhuǎn)移發(fā)生于偶極-偶極相互作用的空間:如果兩熒光團處于合適的距離，能量能從激發(fā)態(tài)分子(供體熒光團)轉(zhuǎn)移到鄰近的分子(受體熒光團)。在這個實施例中，Sirt5作用后，蛋白水解作用導(dǎo)致熒光團對中的一個分子對從底物上釋放，使得熒光團分離，降低了 FRET信號強度，這與Sirt5活性具有相關(guān)性。為完成檢測Sirt5活性實驗，首先將含有Sirt5的樣品與本發(fā)明所述合適的底物接觸，并在合適的條件下孵育。所述“樣品”是指任何含有純化，部分純化或沒有純化的目標Sirt5，而且可以是從細胞或組織中的溶解產(chǎn)物，或者Sirt5蛋白的產(chǎn)物(純化自細胞或組織或者是重組的表達系統(tǒng))。在Sirt5樣品和底物的孵育階段后，將裂解劑同合適的反應(yīng)緩沖液加入反應(yīng)中。在第二次孵育階段以后，用水或其它中性PH緩沖液稀釋，使用熒光檢測器在對所用熒光團所適宜的激發(fā)和檢測波長下記錄熒光。所述的信號強度與Sirt5具有相關(guān)性。所述實驗可以在微型板中進行。比如，將底物肽加到反應(yīng)緩沖液中，隨后將溶液加入到可用于檢測熒光的微型板的孔中，將板孵育。隨后，將一小份Sirt5樣品加入每個孔中，在給定的時間內(nèi)去酰化。然后，將一小份蛋白水解酶和合適的反應(yīng)緩沖液加入到每個孔，使用熒光酶標儀定時檢測所述溶液的熒光強度。在一些實施例中，為避免與預(yù)測的Sirt5酶活性相關(guān)的底物肽不足，在實驗中使用過量的底物肽。優(yōu)選的，為了在普通的生物樣品中檢測Sirt5活性，比如細胞核的提取物，在反應(yīng)中底物的濃度通常是I到200 μ Μ,更優(yōu)選的，20到50 μ M0另一方面，所述裂解劑的濃度可以主要根據(jù)所用底物肽的量進行調(diào)整。通常，所述裂解劑的量根據(jù)預(yù)測產(chǎn)生底物肽的數(shù)量而調(diào)整，使在給定的條件下實現(xiàn)所述底物肽的充分裂解。優(yōu)選的，所述裂解劑活性要能夠保證，比如即使所有使用的底物肽都脫乙?；伎梢员涣呀鈩┝呀鈺r，在反應(yīng)給定的實驗條件下在反應(yīng)孵育中肽被充分裂解。優(yōu)選的，當?shù)孜镫囊?.01到ImM濃度被用于反應(yīng)時，所用的胰蛋白酶數(shù)量，比如，每60 μ I反應(yīng)液中通常為0.2到5 μ g。更優(yōu)選的，為每60 μ I反應(yīng)液中I到2μ g。關(guān)于第一個反應(yīng)(Sirt5引起的脫酰基化)，反應(yīng)的pH可以考慮選擇Sirt5適宜的pH值。例如，所述pH通?？梢哉{(diào)整到6.0到8.5，優(yōu)選的，pH6.8到8.5。反應(yīng)緩沖液可以從能夠提供上述給定的pH的緩沖液中進行選擇。例如，Tris-HCl, Hepes-KOH,等可以被用于本發(fā)明的方法中。更優(yōu)選的，例如，可以使用20mMTris-HCl，pH7.4。NAD是Sirt5需要的共同底物，通常使用的濃度為0.5mM。優(yōu)選的，在反應(yīng)液中加鹽和防腐劑。例如，往反應(yīng)中加ImM 二硫蘇糖醇(DTT)。第一個反應(yīng)(Sirt5引起的脫?；?在35_40°C之間孵育2_20小時。優(yōu)選的孵育條件包括，例如，在37°C下，于含有NAD (0.5mM)和DTT (ImM)的Tris-HCl緩沖液(PH7.4，20mM)中孵 育含有Sirt5的樣品和底物的液體混合物4小時。使用裂解劑進行第二個反應(yīng)，所述裂解劑和合適的反應(yīng)緩沖液加入反應(yīng)中。例如，胰蛋白酶(Iug)和CaCl2(ImM)加入到反應(yīng)中，在37°C下孵育大約3小時。胰蛋白酶孵育后，用水或其它中性的pH緩沖液稀釋反應(yīng)，使用熒光檢測器在對所用熒光團所適宜的激發(fā)和檢測波長下記錄熒光。所述的信號強度與Sirt5活性具有相關(guān)性。篩選SIRT5調(diào)節(jié)劑的方法另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選Sirt5脫丙二酰，脫琥珀?；蛎撐於；钚缘恼{(diào)節(jié)劑的方法。所述篩選方法主要基于前面描述的評價Sirt5活性的實驗，除了在有候選化合物或者沒有候選化合物的情況下進行實驗。與沒有候選化合物時的Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚韵啾?，在存在候選化合物時，如果Sirt5脫丙二酰或脫琥珀?；钚詼p弱，此候選化合物被鑒定為Sirt5抑制劑。在存在候選化合物時，與沒有候選化合物時的Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚韵啾龋绻鸖irt5脫丙二?；蛎撶牾；钚栽鰪?，此候選化合物被鑒定為Sirt5激活劑。在所述篩選方法中被使用的測試化合物包括，例如，合成或重組的肽；低分子量的合成化合物(小分子)；來源于動物，植物或細菌的細胞提取物；細胞培養(yǎng)上清液。脫丙二?；蛎撶牾；瘜嶒灪兔撘阴；瘜嶒灺?lián)合使用來提高特異性如上所述的篩選Sirt5調(diào)節(jié)劑的實驗可以包括一個補充的第二步脫乙酰活性的實驗，用來鑒別化合物可以調(diào)節(jié)Sirt5但不能調(diào)節(jié)Sirtsl-3或其它有脫乙?；钚缘娜ヒ阴；?。在這個第二部分實驗中，例如，使用AMC-乙酰肽來鑒定被確認為是Sirt5調(diào)節(jié)劑的化合物其調(diào)節(jié)Sirtsl/2/3的能力。在一個具體的實施例中，AMC-乙酰肽是ISGASE (AcK)-AMC肽，其中AcK是乙酰賴氨酸。通過使用底物ISGASE (AcK)-AMC和Sirtsl-3任意一個，對被確認為是Sirt5調(diào)節(jié)劑的化合物進一步進行測試。在第二部分實驗中，化合物被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)Sirt5活性，也可以調(diào)節(jié)Sirtsl-3任意一個活性,則其不被認為是Sirt5特異性調(diào)節(jié)齊U。然而，一個化合物被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)Sirt5活性，但不能調(diào)節(jié)Sirtsl-3任意一個活性，其被認為是Sirt5特異性調(diào)節(jié)劑。因此，例如，使用AMC-琥珀酰肽的Sirt5實驗，聯(lián)合使用AMC-乙酰肽的Sirtl/2/3實驗，能用來篩選選擇性調(diào)節(jié)Sirt5活性的化合物。所有實驗都可以微型化，自動化以便用于高通量分析。所述實驗?zāi)茉谝粋€或多個分離的容器中進行；但是，本發(fā)明公開的實驗的一個優(yōu)點在于，能在一個容器中進行，比如，微型板孔，其使用容易而且可以自動操作。如果需要的話，所述底物可以選擇性地固定化在固體介質(zhì)上，比如通過生物素-鏈霉親和素連接。本發(fā)明描述的合成底物的方法為現(xiàn)有技術(shù)。例如，在后續(xù)實施例中會描述在上述公開的熒光實驗中所用底物的合成方法。其它的檢測方法本發(fā)明提供了另一個檢測方法是質(zhì)譜檢測。這個實驗中，Sirt5的活性是通過和Sirt5接觸后，測定底物肽的質(zhì)量來鑒別的。比較起始物質(zhì)(琥珀酰，丙二?；蛭於ｋ?和產(chǎn)物(比如脫琥珀酰，脫丙二?；蛎撐於ｋ?的數(shù)量，這與底物上的Sirt5活性的量相關(guān)。在這個實驗中，產(chǎn)物的增加表明有Sirt5活性，產(chǎn)物很少或沒有產(chǎn)物則表明Sirt5活性很小或沒有活性。通過使用質(zhì)譜實驗，候選化合物可以如下被鑒定為Sirt5抑制劑或Sirt5激動劑。相對于沒有候選化合物時產(chǎn)生的產(chǎn)物，當存在候選化合物時，產(chǎn)物減少(比如，脫琥珀?；?，脫丙二?；?，或脫戊二酰化肽)，則候選化合物被鑒別為Sirt5抑制劑。相對于沒有候選化合物時產(chǎn)生的產(chǎn)物，當存在候選化合物時，產(chǎn)物增加(比如，脫琥珀?；?，脫丙二?；?，或脫戊二酰化肽)，則候選化合物被鑒別為Sirt5激動劑。存在和不存在有調(diào)節(jié)作用的化合物產(chǎn)生的活性的差異應(yīng)該至少是 20%，30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%,500%或更多。IC50 和 EC50候選化合物抑制Sirt5活性的能力可以通過確定其IC5tl來表示。候選化合物激活Sirt5活性的能力可以通過確定其EC5tl來表示。本發(fā)明所使用的“IC50”或者“一半最大抑制濃度”是表示抑制一半的活性所需的化合物的量?？梢酝ㄟ^構(gòu)建劑量響應(yīng)曲線，檢測不同濃度的化合物在降低或阻止酶活作用來確定化合物的IC50。對于一個給定的抑制劑，IC5tl可以通過測定抑制一半最大酶活所需的濃度來計算。所述濃度的檢測一般會形成S形曲線，即在濃度相對較小的改變會造成快速增加。隨著濃度增加效力減慢的點即為IC5(I。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所知，可以通過對最佳擬合線求導(dǎo)來從數(shù)學(xué)上確定這個點。本發(fā)明進一步所使用的，“EC5(I”或“一半最大有效濃度”是指引起基線和最大活性之間的中點的強度反應(yīng)時的化合物濃度。因此，遞增的劑量響應(yīng)曲線的EC5tl表示其達到最大作用50%時的化合物的濃度。優(yōu)選的,本發(fā)明Sirt5抑制劑抑制Sirt5的活性的IC5tl小于或等于5 μ M。更優(yōu)選的，Sirt5抑制劑抑制Sirt5脫丙二酰化和脫琥珀?；幕钚缘腎C5tl小于或等于5 μ M，而且抑制Sirtsl-3脫乙?；钚缘腎C5tl大于或等于100 μ Μ?；衔镆种芐irt5脫丙二?；兔撶牾；幕钚缘腎C5tl小于或等于5 μ Μ，而且抑制Sirtsl-3脫乙?；钚缘腎C5tl大于或等于100 μ Μ，則被認為是Sirt5特異性抑制劑。本發(fā)明Sirt5激動劑優(yōu)選地激活Sirt5的活性的EC5tl小于或等于5 μ M。更優(yōu)選地，Sirt5激活劑激活Sirt5脫丙二?；兔撶牾；幕钚缘腅C5tl小于或等于5 μ M，而且激活Sirtsl-3脫乙?；钚缘腅C5tl大于或等于100 μ Μ。化合物激活Sirt5脫丙二?；兔撶牾；幕钚缘腅C5tl小于或等于5 μ Μ，而且激活Sirtsl-3脫乙?；钚缘腅C5tl大于或等于100 μ Μ，則被認為是Sirt5 特異性激動劑。 可用于開展實驗的試劑盒另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中Sirt5活性的試劑盒，可篩選上述抑制或增強Sirt5活性的化合物。所述試劑盒包括含有上述酰化賴氨酸的底物肽?！獋€實施例提供了一種檢測Sirt5活性的試劑盒，包括:(a)底物肽；(b)裂解劑，它裂解底物肽的活性會隨著底物肽的酰化水平的變化而變化。另一個實施例提供了一種能篩選抑制或提高Sirt5活性的化合物的試劑盒，包括:(a)底物肽；(b)Sirt5 ； (c)裂解劑,它裂解底物肽的活性會隨著底物肽的?；降淖兓兓Ｍǔ?，每個組分，(a)底物肽，(b)Sirt5，和(c)裂解劑是分開包裝的。本發(fā)明中的試劑盒分開的組分通過組合實現(xiàn)最終適合反應(yīng)的濃度。進一步說，除了上述組分，所述試劑盒還可以包括提供合適反應(yīng)條件的緩沖液。酶制劑和底物肽可以和其它穩(wěn)定蛋白的組分組合在一起。例如，優(yōu)選的在制備液中加入使最終濃度是1%的BSA和多元醇，比如蔗糖和果糖，其最終濃度達0.2到10%，優(yōu)選的，1%，作為防止蛋白在凍干后失活的成分。根據(jù)本發(fā)明所述試劑盒的每個組分可以是液體或干燥形式。本領(lǐng)域中常用的洗滌劑，防腐劑，緩沖液等，可以加到上述組分中，只要他們不會阻礙脫酰化活性的檢測。候選抑制劑的合成硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽通過形成停滯的共價中間體抑制Sirt5脫琥珀酰和脫丙二?；钚?。所述硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽參與Sirt5催化反應(yīng)的第一步，形成不能進一步反應(yīng)的共價中間體。因為其它去乙?；覆荒茏R別琥珀酰和丙二酰賴氨酸肽，所以硫代琥珀酰和硫代丙二酰肽是Sirt5特異性抑制劑。在一個實施例中，所述候選化合物是小分子。所述的“小分子”是指小分子有機化合物，比如，雜環(huán)，肽，糖類，留體之類的。優(yōu)選的，所述小分子調(diào)節(jié)劑的分子量小于1500道爾頓，1000道爾頓，，800道爾頓，或者甚至小于500道爾頓。所述化合物可以被修飾以提高其性質(zhì)，比如有效性，穩(wěn)定性或者藥學(xué)上的兼容性。在一個具體的實施例中，所述Sirt5抑制劑是H3K9硫代琥珀酰(H3K9TSU)肽。硫代琥珀酰優(yōu)選于硫代丙二酰是因為琥珀酰賴氨酸比丙二酰賴氨酸具有更低的對Sirt5的Km值。SIRT5特異性抑制劑本發(fā)明提供了抑制Sirt5脫琥珀酰或脫丙二?；钚缘幕衔铩Ｋ鯯irt5抑制劑
被描述具有下列通式:
權(quán)利要求
1.一種識別Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚缘恼{(diào)節(jié)劑的方法，包括: 提供候選化合物； 提供底物，所述底物包含與指示劑部分連接的丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼?； 在上述候選藥物存在的情況下，將底物和Sirt5接觸，使底物被Sirt5脫丙二酰和脫琥珀?；?； 用裂解劑接觸所述脫丙二?；蛎撶牾；牡孜铮隽呀鈩┝呀馑鲑嚢彼岷退鲋甘緞┎糠珠g的連接，以釋放出所述指示劑部分，從而產(chǎn)生可檢測的信號；以及 建立信號強度和Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚蚤g的相關(guān)性；其中，存在所述候選化合物時Sirt5脫丙二酰或脫琥珀?；钚韵鄬τ诓淮嬖谒龊蜻x化合物情況時Sirt5脫丙二酰或脫琥珀?；钚缘淖兓瘜⑺龊蜻x化合物識別為Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚缘恼{(diào)節(jié)劑。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其中所述底物是肽，所述肽包含丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼?，所述丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼嵬ㄟ^肽鍵與所述指示劑部分共價連接。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其中所述裂解劑是蛋白水解酶。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其中所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其中所述指示劑部分有熒光性質(zhì)。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述指示劑部分包含熒光團，所述熒光團在指示劑部分被裂解和釋放時會改變其發(fā)射波長。
7.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述指示劑部分包含熒光團，并且所述底物也用淬火基團標記，當所述指示劑部分從底物上裂解時，其會產(chǎn)生熒光信號。
8.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述指示劑部分包含熒光團，所述熒光團是供體-受體熒光團對中的一個，并且所述熒光團對中的一個和賴氨酸殘基的羧基末端相連，另一個直接或間接地和賴氨酸殘基的氨基末端相連。
9.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述指示劑熒光團從底物上裂解時會減弱基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的信號強度。
10.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述指示劑部分是7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)。
11.按權(quán)利要求10所述的方法，其中所述底物是ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID NO: 11)。
12.按權(quán)利要求1所述的方法，其中所述候選化合物是小分子。
13.按權(quán)利要求12所述的方法，其中所述候選化合物具有下式:
14.按權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括檢測候選分子影響Sirtl、2、或3中任何一個的脫乙酰活性的能力。
15.一種識別或測定Sirt5脫丙二酰和脫琥珀酰活性的方法，包括: 提供底物，所述底物包含與指示劑部分連接的丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼幔? 在有生物樣本存在的情況下，將底物和Sirt5接觸，使底物被Sirt5脫丙二酰和脫琥珀?；? 用裂解劑接觸所述脫丙二?；兔撶牾；牡孜?，所述裂解劑裂解所述賴氨酸和所述指示劑部分間的連接，以釋放出所述指示劑部分，從而產(chǎn)生可檢測的信號；以及 建立信號強度和Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚蚤g的相關(guān)性；其中信號強度的增加提示存在Sirt5脫丙二酰和脫琥珀酰活性。
16.一種用于Sirt5活性的底物，所述底物包含與指示劑部分連接的丙二酰賴氨酸，所述指示劑部分能產(chǎn)生指示Sirt5脫丙二?；钚缘目蓹z測信號。
17.按權(quán)利要求16所述的底物，其中所述底物是AMC-丙二酰肽。
18.一種用于Sirt5活性的底物，所述底物包含與指示劑部分連接的琥珀酰賴氨酸，所述指示劑部分能產(chǎn)生可檢測信號提示Sirt5琥珀?；幕钚浴?br> 19.按權(quán)利要求18所述的底物，其中所述底物是AMC-琥珀酰肽。
20.按權(quán)利要求19所述的底物，其中所述底物是ISGASE(SuK)-AMC(SEQ ID ΝΟ:11)肽。
21.一種抑制Sirt5脫丙二酰或脫琥珀?；钚缘幕衔?，所述化合物具有下式:
22.按權(quán)利要求21所述的化合物，其中所述化合物是硫代琥珀酰賴氨酸化合物。
23.按權(quán)利要求22所述的化合物，其中所述化合物是Η3Κ9硫代琥珀酰肽。
24.按權(quán)利要求21所述的化合物，其中所述化合物抑制Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚?，IC5tl小于或等于5 μ M。
25.按權(quán)利要求24所述的化合物，其中所述化合物抑制Sirtl、2、或3脫乙?；钚?，IC50 大于 100 μ Mo
26.一種治療或預(yù)防紊亂的方法，所述紊亂的特征在于，Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚援惓＃龇椒ò蛩鰧ο蠼o予藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物，以治療或預(yù)防所述紊亂。
27.一種識別Sirt5脫丙二?；蛎撶牾；钚缘脑噭┖?，包括: 底物，所述底物包含與指示劑部分連接的丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼?；以及 裂解劑，所述裂解劑裂解所述底物肽的活性的變化，取決于所述底物肽是否被?；?。
28.一種識別Sirt5脫丙二酰或脫琥珀?；钚缘恼{(diào)節(jié)劑的試劑盒，包括: 底物，所述底物包含與指示劑部分連接的丙二?；蜱牾Ｙ嚢彼?； Sirt5 ;以及 裂解劑，所述裂解劑裂解所述底物肽的活性的變化，取決于所述底物肽是否被酰化。
全文摘要
Sirt5，一種線粒體去乙?；?，在本發(fā)明中其被鑒定具有脫丙二酰和脫琥珀?；钚?。基于Sirt5強的酶活性，本發(fā)明公開了一種鑒定Sirt5調(diào)節(jié)劑的方法。特異性的Sirt5調(diào)節(jié)劑可以被用于Sirt5的生物功能的研究，也可以靶向Sirt5活性用于治療人類疾病。
文檔編號G01N33/15GK103097545SQ201180043047
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者林合寧 申請人:康奈爾大學(xué)