專利名稱：一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤也稱為癌癥，是目前威脅人類生命和健康的主要疾病之一。癌癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其是70年代以后，癌癥發(fā)病數(shù)以年均3 % 5 %的速度遞增，不僅如此，癌癥的發(fā)病年齡還趨于年輕化，已成為人類第二大死因。為此，醫(yī)學(xué)界一直努力探尋對其進(jìn)行有效的診治。經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展和完善，外科手術(shù)、放療、化療等方法已經(jīng)成為惡性腫瘤綜合治療的主要手段，但在臨床應(yīng)用時常常引起嚴(yán)重的毒副作用，其治療效果并不是很好，治愈率通常較低。大量臨床事實(shí)證明，癌變初期的治愈率是相當(dāng)高的。因此，治療癌癥的關(guān)鍵在于有效的早期診治。目前診斷惡性腫瘤最有效的手段是病理診斷，但準(zhǔn)確性往往受限于操作醫(yī)生的工作經(jīng)驗(yàn)，早期病變?nèi)菀茁┰\、誤診。X線、B超、CT、NMRI是臨床常用的檢測診斷技術(shù)，但是也都存在分辨率不夠高的缺點(diǎn)。尋找方便、快捷、準(zhǔn)確的癌癥早期診斷方法意義重大，所以研究更先進(jìn)的手段或者儀器來實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、及時的癌癥早期診斷一直是人們努力的方向，也是廣大醫(yī)藥工作者研究的熱門課題。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(0. 1 IOOnm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的具有特殊性能的材料。納米材料自從被發(fā)現(xiàn)和合成以來就一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。由于其自身具備一些特殊性質(zhì)為生物醫(yī)學(xué)的研究提供了良好的平臺，因此在最新的研究中，納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用備受矚目。納米技術(shù)是研究納米材料性質(zhì)和應(yīng)用的一門技術(shù)。目前科研人員通過該技術(shù)制成了藥物、基因、生物大分子等載體， 稱之為納米載體。納米載體是一種新型、高效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的靶向載體，主要應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。納米載體具有多種形態(tài)納米微球(納米粒)、納米管、納米片以及納米多邊形等。其中，納米微球(納米粒)是一種應(yīng)用較為廣泛的納米載體。由于腫瘤所特有的病理生理變化，在腫瘤的診斷治療中，納米技術(shù)能更好地檢測疾病所導(dǎo)致的分子和細(xì)胞改變。近年來，研發(fā)的納米載體多用于癌癥的靶向治療，如靶向藥物的運(yùn)載，而在早期診斷方面的研發(fā)甚少，這也是目前相關(guān)生物技術(shù)領(lǐng)域中的研究前沿。流式細(xì)胞術(shù)是借助流式細(xì)胞儀通過抗原抗體反應(yīng)和熒光標(biāo)記法完成對細(xì)胞各種特性進(jìn)行定性定量的一種分析技術(shù)。自1977年Horan首次利用流式細(xì)胞儀將納米高分子微球應(yīng)用于免疫學(xué)檢測以來，以納米微球作為載體的生物檢測技術(shù)已經(jīng)滲透到細(xì)胞生物學(xué)、 分子生物學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。由于流式細(xì)胞儀具有可根據(jù)微球粒徑及所帶特征熒光信號對微球進(jìn)行特異性識別的能力，因此可利用納米微球結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)建立特異分子的檢測技術(shù)。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)納米粒具有生物發(fā)光特性，可以此作為標(biāo)記載體，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤，但是該方法只能檢測出細(xì)胞表面特異性分子。二氧化硅納米粒是極其重要的高科技超微細(xì)無機(jī)新材料之一，因其粒徑很小、微孔多、比表面積大、表面吸附
4力強(qiáng)、分散性能好、穩(wěn)定性佳等方面具有特異的性能，在眾多學(xué)科及領(lǐng)域內(nèi)獨(dú)具特性，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的無機(jī)納米粒子。為此，本發(fā)明選用二氧化硅納米粒子結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)建立腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，尤其是檢測與腫瘤相關(guān)的胞內(nèi)蛋白的方法，其包括如下步驟1. 二氧化硅納米粒的制備(1)表面氨基化二氧化硅納米粒的制備先采用St0ber法制備粒徑為100 120nm的二氧化硅納米粒，然后用、-氨基丙基三乙氧基硅烷對二氧化硅納米粒進(jìn)行了表面修飾，得到表面氨基化的二氧化硅納米粒；(2)表面羧基化二氧化硅納米粒的制備先采用St0ber法制備粒徑為100 120nm的二氧化硅納米粒，然后用硅烷偶聯(lián)劑和丁二酸酐對二氧化硅納米粒表面進(jìn)行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅納米粒；2.具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性二氧化硅納米粒的制備(1)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備首先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液活化步驟1中制備的100 120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒，再將活化后的納米粒經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，NaCl 0. 8g,KC10. 02g,Na2HPO4 · 12H20 2. 9g， KH2PO4 0. 02g, H2O 100ml, pH 8.0)清洗后重懸于 PBS(pH 8.0)中形成 2. 5mg/ml 的納米粒懸液；然后將上述納米粒懸液與抗某種胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology,來源于小鼠，如 β -actin、Akt2、p-Akt 1/2/3 等，抗體PBS 體積比= 1 200 1000)混合，在4°C輕輕攪拌過夜，真空凍干后得到具有結(jié)合蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒，其中納米粒懸液與抗體溶液的體積比為2 5 1 ；(2)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒的制備首先將步驟 1制備的100 120nm表面羧基化的二氧化硅納米粒用PBS重懸形成濃度為2. 5mg/ml的懸液，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)對納米粒進(jìn)行活化；然后再將活化后的納米粒懸液與抗某種胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于小鼠，如 β-actin、Akt2、p-Aktl/2/3 等，抗體:PBS 體積比 =1 200 1000)在4°C輕輕攪拌池，真空凍干后得到具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒，其中活化后的納米粒懸液與抗體溶液的體積比為2 5 1 ；3.腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的提取將體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞(如肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞或?qū)m頸癌細(xì)胞)通過超聲破碎裂解法獲得腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白溶液，濃度為100 200 μ g/ml ；4.與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的結(jié)合將具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的二氧化硅納米粒與獲得的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白溶液混合(Img 200 400μ 1)，4°C孵育30 60min，然后用 PBS清洗2 3次，最后4°C、12000rpm離心5 IOmin得到與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白結(jié)合的納米粒子；
5.在步驟4中加入與步驟2中等濃度和體積的另一不同來源的抗同一胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于兔，如β-actin、Akt2、 p-Akt 1/2/3等)，4°C孵育30 60min ；然后用PBS (pH 8. 0)清洗2 3次，最后用PBS (pH 8. 0)重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其濃度為5mg/ml ；6.在步驟5中加入熒光素標(biāo)記的二抗(如FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG)，其中加入的熒光素標(biāo)記的二抗溶液與步驟5中反應(yīng)后納米粒懸液的體積比為1 200 500，4°C避光孵育30 60min ；然后用PBS(pH 8. 0)清洗2 3次，之后用PBS (pH 8.0)重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其終濃度約為IX IO5個/ml，從而制備得到“二氧化硅納米粒-抗體(鼠源)_腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白-抗體(兔源)_熒光素標(biāo)記二抗(FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG)”的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物；7.以lmg/ml牛血清白蛋白溶液替代步驟3中的腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白，重復(fù)步驟 2 6，從而制備“ 二氧化硅納米粒子-抗體(鼠源)-牛血清白蛋白-抗體(兔源)-熒光素標(biāo)記二抗(FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG) ”作為對照組復(fù)合物；8.利用流式細(xì)胞術(shù)對步驟6制備的“二氧化硅納米粒-抗體(鼠源)_腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白-抗體(兔源)_熒光素標(biāo)記二抗(FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG)”復(fù)合物及步驟7 制備的對照組復(fù)合物進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞特異性胞內(nèi)蛋白的定性檢測。由于抗體與抗原的結(jié)合具有特異性，為此抗體可與實(shí)驗(yàn)組中的某種細(xì)胞胞內(nèi)蛋白結(jié)合，而不與對照組中的牛血清白蛋白結(jié)合，表現(xiàn)為利用流式細(xì)胞術(shù)檢測的結(jié)果是實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物的熒光強(qiáng)度大于對照組復(fù)合物的熒光強(qiáng)度。因此，本發(fā)明中二氧化硅納米粒子與待測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的抗體結(jié)合后具有主動靶向性，根據(jù)與二氧化硅納米粒子結(jié)合的抗體的種類不同，能夠靶向各種不同的細(xì)胞胞內(nèi)蛋白，尤其適用于靶向腫瘤細(xì)胞特異性胞內(nèi)蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的定性檢測。本發(fā)明能夠快速有效地檢測腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白樣品， 可用于胞內(nèi)腫瘤標(biāo)志物的快速檢測，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷提出了一種新型、有效的方法，為臨床腫瘤診斷奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的優(yōu)勢在于1.本發(fā)明所采用的二氧化硅納米粒具有粒徑小、微孔多、比表面積大、表面吸附力強(qiáng)、分散性能好、穩(wěn)定性佳等優(yōu)點(diǎn)，且成本低，制備相對簡單。2.本發(fā)明利用流式技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)能夠快速有效地檢測出細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白，尤其是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的胞內(nèi)蛋白，如蛋白激酶B(Akt)、人類白細(xì)胞抗原 G(HLA-G)、人黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)等。3.為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷提出了一種新型、有效的方法，為臨床腫瘤診斷奠定了基石出。


圖A和B為實(shí)施例1流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果A圖為表面氨基化二氧化硅納米粒- β -actin抗體(鼠源)_!fepG2細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 β -actin- β -actin抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG (實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)分析圖；其中，綠色曲線(曲線1)代表對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，紫色曲線(曲線2)代表實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；FITC代表形成復(fù)合物中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度。B圖為表面羧基化二氧化硅納米粒- β -actin抗體(鼠源)_!fepG2細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 β -actin- β -actin抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG (實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)分析圖；其中，綠色曲線(曲線3)代表對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，黑色曲線(曲線4)代表實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；FITC代表形成復(fù)合物中 FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度。從圖中可以看出，無論是表面氨基化二氧化硅納米粒還是表面羧基化二氧化硅納米粒的實(shí)驗(yàn)組中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度均顯著大于對照組，表明抗β -actin抗體與實(shí)驗(yàn)組腫瘤IfepG2細(xì)胞胞內(nèi)蛋白β-actin發(fā)生了特異性的結(jié)合，而未與對照組牛血清白蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合。β-actin是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。通過上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明的方法可定性檢測出細(xì)胞胞內(nèi)蛋白β-actin的表達(dá)，從而表明本發(fā)明方法對于檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白是有效的。圖C和D為實(shí)施例2流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果C圖為表面氨基化二氧化硅納米粒_Akt2抗體(鼠源)_MCF7細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 Akt2-Akt2抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG (實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)分析圖；其中，綠色曲線(曲線5)代表對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，紅色曲線(曲線6)代表實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；FITC代表形成復(fù)合物中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度。D圖為表面羧基化二氧化硅納米粒_Akt2抗體(鼠源)_MCF7細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 Akt2-Akt2抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG (實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)分析圖；其中，綠色曲線(曲線7)代表對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，粉色曲線(曲線8)代表實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；FITC代表形成復(fù)合物中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度。從圖中可以看出，無論是表面氨基化二氧化硅納米粒還是表面羧基化二氧化硅納米粒的實(shí)驗(yàn)組中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度均顯著大于對照組，表明抗Akt2抗體與實(shí)驗(yàn)組腫瘤MCF-7細(xì)胞胞內(nèi)蛋白Akt2發(fā)生了特異性的結(jié)合，而未與對照組牛血清白蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合。Akt2是腫瘤標(biāo)志蛋白Akt中的一種，在腫瘤細(xì)胞中具有特異性表達(dá)。通過實(shí)例 1與本實(shí)例可以看出，利用本發(fā)明的方法不僅能夠定性檢測出非腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)， 還能夠定性檢測出腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，從而表明本發(fā)明方法對于檢測腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白是有效的。圖E和F為實(shí)施例3流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果E圖為表面氨基化二氧化硅納米粒-p-Aktl/2/3抗體(鼠源)-Hela細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 p-Aktl/2/3-p-Aktl/2/3抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG (實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)分析圖；其中，綠色曲線(曲線9)代表對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，藍(lán)色曲線(曲線10)代表實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；FITC代表形成復(fù)合物中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度。F圖為表面羧基化二氧化硅納米粒-p-Aktl/2/3抗體(鼠源)-Hela細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 p-Aktl/2/3-p-Aktl/2/3抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG (實(shí)驗(yàn)組)及其相應(yīng)對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)分析圖；其中，綠色曲線(曲線11)代表對照組復(fù)合物的流式細(xì)胞術(shù)
7檢測結(jié)果，黃色曲線(曲線12)代表實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；FITC代表形成復(fù)合物中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度。從圖中可以看出，無論是表面氨基化二氧化硅納米粒還是表面羧基化二氧化硅納米粒的實(shí)驗(yàn)組中FITC標(biāo)記的二抗熒光強(qiáng)度均顯著大于對照組，表明抗p-Aktl/2/3抗體與實(shí)驗(yàn)組腫瘤Hela細(xì)胞細(xì)胞胞內(nèi)蛋白p-Aktl/2/3發(fā)生了特異性的結(jié)合，而未與對照組牛血清白蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合。Akt是腫瘤標(biāo)志蛋白，其磷酸化蛋白p-Akt在腫瘤中也具有特異性表達(dá)。通過實(shí)例1、2與本實(shí)例可以看出，利用本發(fā)明的方法不僅能夠定性檢測出非腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，還能夠定性檢測出腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步表明本發(fā)明方法對于檢測腫瘤相關(guān)胞內(nèi)蛋白是有效的。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 以肌動蛋白(β -actin)在人肝癌H印G2細(xì)胞系的表達(dá)為例加以說明。1. 二氧化硅納米粒的制備(1)表面氨基化二氧化硅納米粒的制備先采用st0ber 法(st0ber W，F(xiàn)ink A, Bohn E.J Colloid Interface Sci, 1968, 26 62.)制備100 120nm 二氧化硅納米粒；然后將約Ig 二氧化硅納米粒加入到30ml無水甲苯中，室溫攪拌均勻，然后緩慢滴加2. 5ml γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(ATEQ，繼續(xù)攪拌Ih后，升溫至95°C，回流10h，再用異丙醇超聲洗滌3次，在60°C真空干燥10h，得約Ig 表面氨基化二氧化硅納米粒；(2)表面羧基化二氧化硅納米粒的制備先采用St0ber 法(St0ber W，F(xiàn)ink A, Bohn E.J Colloid Interface Sci, 1968, 26 62.)制備100 120nm 二氧化硅納米粒；然后將0. OlM硅烷偶聯(lián)劑(KH-550)和等摩爾的丁二酸酐均勻分散在約100ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，120°C下磁力攪拌池，再加入 20ml 二氧化硅DMF懸液，使整個反應(yīng)體系中二氧化硅納米粒子的濃度約為10mg/ml，同時加入2ml去離子水。在相同溫度下繼續(xù)磁力攪拌證后，12000rpm離心IOmin分離出反應(yīng)后的納米粒，經(jīng)5次乙醇洗滌離心分離后，90°C干燥，即得到約1. 2g表面羧基化二氧化硅納米粒；2.具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的納米粒的制備(1)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備首先將 100 120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒懸浮于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液中，使其終濃度為lmg/ml，室溫攪拌過夜對粒子進(jìn)行活化；第二天用:3ml PBS (pH 8. 0)清洗3次，除去過量的戊二醛溶液；然后重懸于PBS (pH 8. 0)中形成2. 5mg/ml的納米粒子懸液；取100 μ 1 的抗 β -actin 抗體溶液(購于 Santa Cruz Biotechnology，來源于小鼠，抗體PBS體積比=1 1000)加入到上述400 μ 1納米粒子懸液中，4°C輕輕攪拌過夜； 第二天用:3ml PBS(pH 8. 0)清洗3次，真空凍干得到約Img具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化納米粒；(2)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒的制備首先將 100 120nm表面羧基化的二氧化硅納米粒懸浮于400 μ 1 PBS (pH 8. 0)中形成2. 5mg/ml 的懸液；加入4. 5yg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺鹽酸鹽(EDC)和等質(zhì)量的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫輕輕攪拌混勻，再加入100 μ 1抗β -actin抗體溶液(購于 Santa Cruz Biotechnology，來源于小鼠，抗體:PBS體積比=1 1000)，4°C輕輕攪拌2h， 之后用:3ml PBS(pH 8. 0)清洗3次，真空凍干得到約Img具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化納米粒；3.腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的提取將體外培養(yǎng)的人肝癌H印G2細(xì)胞(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，370C ,5% CO2條件下培養(yǎng))用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶液消化制成單細(xì)胞懸液，用4°C預(yù)冷的PBS (pH 8. 0)清洗2次，之后重懸于PBS (pH 8. 0)中使細(xì)胞濃度為IX IO6個/ml ；取Iml移入離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清液，估計細(xì)胞體積， 向沉淀中加入約2倍細(xì)胞體積含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的細(xì)胞裂解液(1M Tris-HCl pH 8. 05ml,NaCl 150mM，體積分?jǐn)?shù)1 % NP-40，蒸餾水定容至IOOml ；細(xì)胞裂解液PMSF體積比 =870 50)，混勻，冰浴超聲破碎細(xì)胞(70W，超聲3s，間隙5s，共15次)，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清液，上清液中腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的濃度約為150μ g/ml ；4.與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白β-actin的結(jié)合將步驟2中具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的納米粒Img與步驟3中提取的300 μ 1腫瘤胞內(nèi)蛋白液混合，4°C孵育40min ；然后用2ml PBS (pH 8. 0)清洗3次，最后4°C 12000rpm離心IOmin得約Img結(jié)合后的納米粒子；5.在步驟4中加入100μ 1抗β -actin抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于兔，抗體PBS體積比=1 1000)，4°C孵育40min，隨之用^il PBS (pH 8. 0)洗3次，最后將反應(yīng)后的納米粒重懸于200 μ 1 PBS (ρΗ8. 0)中；6.接著在步驟5中加入0. 5μ 1 FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG，4°C避光孵育30min ； 然后用aiil PBS (pH 8.0)清洗3次，之后用PBS (pH 8.0)重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其濃度約為IX IO5個/ml，得到“二氧化硅納米粒-β-actin抗體(鼠源)_ifepG2細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 β -actin-β-actin抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG”實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物；7.用BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測分析；8.同時設(shè)定以lmg/ml牛血清白蛋白溶液替代步驟3中的人肝癌!fepG2細(xì)胞總蛋白，得到“二氧化硅納米粒-β -actin抗體(鼠源)-牛血清白蛋白-β -actin抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG”對照組復(fù)合物。實(shí)施例2 以蛋白激酶B(Akt2)在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系的表達(dá)為例加以說明。1. 二氧化硅納米粒的制備(同實(shí)施例1)2.具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的納米粒的制備(1)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備首先將 100 120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒懸浮于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液中，使其終濃度為lmg/ml，室溫攪拌過夜對粒子進(jìn)行活化；第二天用:3ml PBS (pH 8.0)清洗3次，除去過量的戊二醛溶液；然后重懸于PBS (pH 8. 0)中形成2. 5mg/ml的納米粒子懸液；取100 μ 1的抗Akt2抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于小鼠，抗體PBS體積比=1 800)加入到上述400 μ 1納米粒子懸液中，4°C輕輕攪拌過夜；第二天用:3ml PBS(pH 8. 0)清洗3次，真空凍干得到約Img具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化納米粒；(2)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒的制備首先將 100 120nm表面羧基化的二氧化硅納米粒懸浮于400 μ 1 PBS (pH 8. 0)中形成2. 5mg/ml的懸液；加入4.5yg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺鹽酸鹽(EDC)和等質(zhì)量的 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫輕輕攪拌混勻，再加入100 μ 1抗Akt2抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于小鼠，抗體PBS體積比=1 800)，4°C輕輕攪拌2h，之后用 3ml PBS(pH 8. 0)清洗3次，真空凍干得到約Img具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化納米粒；3.腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的提取將體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，370C ,5% CO2條件下培養(yǎng))用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶液消化制成單細(xì)胞懸液，用4°C預(yù)冷的PBS (pH 8. 0)清洗2次，之后重懸于PBS (pH 8. 0)中使細(xì)胞濃度為IX IO6個/ml ；取Iml移入離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清液，估計細(xì)胞體積，向沉淀中加入約2倍細(xì)胞體積含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的細(xì)胞裂解液(1M Tris-HCl pH 8. 05ml, NaCl 150mM，體積分?jǐn)?shù)1% NP-40，蒸餾水定容至IOOml ；細(xì)胞裂解液PMSF體積比=870 50)，混勻，冰浴超聲破碎細(xì)胞(70W,超聲3s,間隙5s，共15次)，4°C 12000rpm 離心lOmin，取上清液，上清液中腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的濃度約為150μ g/ml ；4.與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白Akt2的結(jié)合將步驟2中具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的納米粒Img與步驟3中提取的300 μ 1腫瘤胞內(nèi)蛋白液混合，4°C孵育40min ；然后用2ml PBS (pH 8. 0)清洗3次，最后4°C 12000rpm離心IOmin得約Img結(jié)合后的納米粒子；5.在步驟 4 中加入 100 μ 1 抗 Akt2 抗體溶液(購于 Santa Cruz Biotechnology, 來源于兔，抗體PBS體積比=1 800)，41孵育401^11，隨之用&11 PBS (pH 8.0)洗3次， 最后將反應(yīng)后的納米粒重懸于200 μ 1 PBS (ρΗ8. 0)中；6.接著在步驟5中加入0. 5μ 1 FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG，4°C避光孵育30min ；然后用aiil PBS (pH 8.0)清洗3次，之后用PBS (pH 8.0)重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其濃度約為IX IO5個/ml，得到“二氧化硅納米粒-Akt2抗體(鼠源)-MCF7細(xì)胞胞內(nèi)蛋白Akt2_Akt2 抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG”實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物；7.用BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測分析；8.同時設(shè)定以lmg/ml牛血清白蛋白溶液替代步驟3中的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞總蛋白，得到“二氧化硅納米粒_Akt2抗體(鼠源)牛血清白蛋白-Akt2抗體(兔源)_FITC 標(biāo)記的小鼠抗兔IgG”對照組復(fù)合物。實(shí)施例3 以磷酸化的蛋白激酶B(p_Aktl/2/3)在人宮頸癌Hela細(xì)胞系的表達(dá)為例加以說明。1. 二氧化硅納米粒的制備(同實(shí)施例1)2.具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的納米粒的制備(1)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備首先將 100 120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒懸浮于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液中，使其終濃度為lmg/ml，室溫攪拌過夜對粒子進(jìn)行活化；第二天用:3ml PBS (pH 8.0)清洗3次，除去過量的戊二醛溶液；然后重懸于PBS (pH 8. 0)中形成2. 5mg/ml的納米粒子懸液；取100 μ 1 的抗 p-Akt 1/2/3 抗體溶液(購于 Santa Cruz Biotechnology,來源于小鼠，抗體PBS體積比=1 600)加入到上述400μ1納米粒子懸液中，4°C輕輕攪拌過夜；第二天用:3ml PBS (pH 8. 0)清洗3次，真空凍干得到約Img具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化納米粒；
(2)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒的制備首先將 100 120nm表面羧基化的二氧化硅納米粒懸浮于400 μ 1 PBS (pH 8. 0)中形成2. 5mg/ml 的懸液；加入4. 5yg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺鹽酸鹽(EDC)和等質(zhì)量的 N-羥基琥珀酰亞胺(MB)，室溫輕輕攪拌混勻，再加入100 μ 1抗p-Aktl/2/3抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于小鼠，抗體PBS體積比=1 600)，4°C輕輕攪拌池，之后用:3ml PBS (pH 8.0)清洗3次，真空凍干得到約Img具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化納米粒；3.腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的提取將體外培養(yǎng)的人宮頸癌Hela細(xì)胞(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37V,5% CO2條件下培養(yǎng))用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶液消化制成單細(xì)胞懸液，用4°C預(yù)冷的PBS (pH 8. 0)清洗2次，之后重懸于PBS (pH 8. 0)中使細(xì)胞濃度為IX IO6個/ml ；取Iml移入離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清液，估計細(xì)胞體積，向沉淀中加入約2倍細(xì)胞體積含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的細(xì)胞裂解液(1M Tris-HCl pH 8. 05ml, NaCl 150mM，體積分?jǐn)?shù)1% NP-40，蒸餾水定容至IOOml ；細(xì)胞裂解液PMSF體積比=870 50)，混勻，冰浴超聲破碎細(xì)胞(70W,超聲3s,間隙5s，共15次)，4°C 12000rpm 離心lOmin，取上清液，上清液中腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的濃度約為150μ g/ml ；4.與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白p-Aktl/2/3的結(jié)合將步驟2中具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的納米粒Img與步驟3中提取的300μ 1腫瘤胞內(nèi)蛋白液混合，4°C孵育40min;然后用2ml PBS (pH 8. 0)清洗3次，最后40C 12000rpm離心IOmin得約Img結(jié)合后的納米粒子；5.在步驟4中加入100 μ 1抗p-Aktl/2/3抗體溶液(購于Santa Cruz Biotechnology，來源于兔，抗體PBS體積比=1 600)，4 °C孵育40min，隨之用^il PBS (pH 8. 0)洗3次，最后將反應(yīng)后的納米粒重懸于200 μ 1 PBS (ρΗ8. 0)中；6.接著在步驟5中加入0. 5μ 1 FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG，4°C避光孵育30min ； 然后用aiil PBS (pH 8.0)清洗3次，之后用PBS (pH 8.0)重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其濃度約為IX IO5個/ml，得到“二氧化硅納米粒-p-Aktl/2/3抗體(鼠源)-Hela細(xì)胞胞內(nèi)蛋白 P-Aktl/2/3-p-Akt 1/2/3抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG”實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物；7.用BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測分析；8.同時設(shè)定以lmg/ml牛血清白蛋白溶液替代步驟3中的人宮頸癌Hela細(xì)胞總蛋白，得到“二氧化硅納米粒-p-Aktl/2/3抗體(鼠源)牛血清白蛋白-p-Aktl/2/3抗體(兔源)-FITC標(biāo)記的小鼠抗兔IgG”對照組復(fù)合物。
1權(quán)利要求
1.一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其步驟如下(1)制備粒徑為100 120nm的表面氨基化或表面羧基化的二氧化硅納米粒；(2)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性二氧化硅納米粒的制備(a)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒的制備首先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液活化步驟(1)中制備的100 120nm表面氨基化的二氧化硅納米粒， 再將活化后的納米粒經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗后重懸于磷酸鹽緩沖液中形成2. 5mg/ml的納米粒懸液；然后將上述納米粒懸液與來源于小鼠的抗胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液混合，再在4°C 輕輕攪拌過夜，真空凍干后得到具有結(jié)合蛋白特異性的表面氨基化二氧化硅納米粒，其中納米粒懸液與抗體溶液的體積比為2 5 1 ；(b)具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒的制備首先將步驟(1) 制備的100 120nm表面羧基化的二氧化硅納米粒用磷酸鹽緩沖液重懸形成濃度為2. 5mg/ ml的懸液，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺對納米粒進(jìn)行活化；然后再將活化后的納米粒懸液與來源于小鼠的抗胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液混合，再在4°C輕輕攪拌池，真空凍干后得到具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的表面羧基化二氧化硅納米粒，其中活化后的納米粒懸液與抗體溶液的體積比為2 5 1 ；(3)腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的提取將體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞通過超聲破碎裂解法獲得腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白溶液，濃度為100 200μ g/ml ；(4)與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白的結(jié)合將具有結(jié)合胞內(nèi)蛋白特異性的二氧化硅納米粒與獲得的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白溶液混合，用量比例為Img 200 400μ 1，4°C孵育30 60min， 然后用磷酸鹽緩沖液清洗2 3次，最后4°C、12000rpm離心5 IOmin得到與腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白結(jié)合的納米粒子；(5)在步驟中加入與步驟O)中等濃度和體積的來源于兔的抗同一胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液混合，在4°C孵育30 60min ；然后用磷酸鹽緩沖液清洗2 3次，最后用磷酸鹽緩沖液重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其濃度為5mg/ml ；(6)在步驟(5)中加入熒光素標(biāo)記的二抗溶液，其中加入的熒光素標(biāo)記的二抗溶液與步驟(5)中反應(yīng)后納米粒懸液的體積比為1 200 500，4°C避光孵育30 60min ；然后用磷酸鹽緩沖液清洗2 3次，之后用磷酸鹽緩沖液重懸該反應(yīng)后的納米粒，使其終濃度約為1 X IO5個/ml，從而制備得到“二氧化硅納米粒-抗體(鼠源)-腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白-抗體(兔源)_熒光素標(biāo)記二抗”的實(shí)驗(yàn)組復(fù)合物；(7)以lmg/ml牛血清白蛋白溶液替代步驟3中的腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白，重復(fù)步驟 (2) (6)，從而制備“二氧化硅納米粒子-抗體(鼠源)-牛血清白蛋白-抗體(兔源)-熒光素標(biāo)記二抗”作為對照組復(fù)合物；(8)利用流式細(xì)胞術(shù)對步驟(6)制備的“二氧化硅納米粒-抗體(鼠源)_腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)蛋白-抗體(兔源)_熒光素標(biāo)記二抗”復(fù)合物及步驟(7)制備的對照組復(fù)合物進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞特異性胞內(nèi)蛋白的定性檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其特征在于 表面氨基化二氧化硅納米粒的制備是采用St0ber法制備粒徑為100 120nm的二氧化硅納米粒，然后用Y-氨基丙基三乙氧基硅烷對二氧化硅納米粒進(jìn)行了表面修飾，得到表面氨基化的二氧化硅納米粒。
3.如權(quán)利要求1所述的一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其特征在于 表面羧基化二氧化硅納米粒的制備是采用St0ber法制備粒徑為100 120nm的二氧化硅納米粒，然后用硅烷偶聯(lián)劑和丁二酸酐對二氧化硅納米粒表面進(jìn)行羧基化改性，得到表面羧基化的二氧化硅納米粒。
4.如權(quán)利要求1所述的一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其特征在于 來源于小鼠的抗胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液為β -actin, Akt2或p-Aktl/2/3抗體的磷酸鹽緩沖液溶液，抗體磷酸鹽緩沖液的體積比為1 200 1000。
5.如權(quán)利要求1所述的一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其特征在于 來源于兔的抗胞內(nèi)蛋白的特異性抗體溶液為β -actin, Akt2或p-Aktl/2/3抗體的磷酸鹽緩沖液溶液，抗體磷酸鹽緩沖液的體積比為1 200 1000。
6.如權(quán)利要求1所述的一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其特征在于 熒光素標(biāo)記的二抗為FITC標(biāo)記的小鼠抗兔。
7.如權(quán)利要求1所述的一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法，其特征在于 人腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞或?qū)m頸癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的方法。其是將100～120nm二氧化硅納米粒子表面的氨基或羧基官能團(tuán)與待測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的抗體的氨基通過共價鍵連接，進(jìn)而與經(jīng)超聲等方法得到的細(xì)胞胞內(nèi)蛋白共同孵育，再加入另一種不同來源靶向同一待測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的抗體進(jìn)行孵育，然后用熒光素標(biāo)記的二抗孵育，形成“二氧化硅納米粒子-抗體-細(xì)胞胞內(nèi)蛋白-抗體-熒光素標(biāo)記的二抗”復(fù)合物，最后運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對該復(fù)合物進(jìn)行定性檢測。二氧化硅納米粒子與待測細(xì)胞胞內(nèi)蛋白的抗體結(jié)合后具有主動靶向性，能夠靶向各種不同的細(xì)胞胞內(nèi)蛋白。
文檔編號G01N33/68GK102520188SQ201110403838
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者于洋, 施維, 曹秉振, 朱廣山, 李全順 申請人:吉林大學(xué)