本發(fā)明屬于抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種十色的抗體組合物及其在白血病和淋巴瘤分型中的應(yīng)用及分型試劑盒等。

背景技術(shù)：

白血病、淋巴瘤等血液腫瘤近年已經(jīng)上升為最威脅人類健康的幾大疾病之一。白血病的免疫分型在疾病的診斷中占有非常重要的地位。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)白血病淋巴瘤等進(jìn)行免疫分型，是血液腫瘤診斷的重要手段之一。我公司專利CN 105606797 B中公開了一種四色流式抗體組合物及其在白血病淋巴瘤分型中的應(yīng)用，其包含了7種熒光標(biāo)記的單克隆抗體，盡管利用較少的抗體對(duì)多方面的白血病進(jìn)行了較全面的檢測(cè)，但是需要使用兩次上樣。專利CN 103675277 A公開了一種流式細(xì)胞術(shù)鑒別診斷橫紋肌肉瘤與神經(jīng)母細(xì)胞瘤骨髓轉(zhuǎn)移及白血病的熒光探針及試劑盒，包含四種熒光抗體GD2-FITC、CD90-PE、CD45-PerCP、CD56-APC。我們檢索到的最多種抗體組合物出現(xiàn)在專利CN 103018463 A中，其公開了一種檢測(cè)急性B淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)免疫表型的試劑盒，包含七種單克隆抗體CD58、CD10、CD34、CD123、CD38、CD19、CD45。

大量抗體的組合使用，除了需避免互相之間的干擾，還需要高效地進(jìn)行白血病/淋巴瘤細(xì)胞檢測(cè)。目前尚未發(fā)現(xiàn)有“單管十色”組合(十種抗體組合)的白血病/淋巴瘤檢測(cè)及其試劑盒。然而，本發(fā)明人沒有在前人無(wú)法突破的困難面前退縮，根據(jù)十余年臨床實(shí)踐和研究的經(jīng)驗(yàn)，令人意外地篩選出10種抗體的組合，只需要一次上樣，就可有效進(jìn)行多種血液腫瘤的免疫分型(特別是初篩)，而且節(jié)約了成本、操作更趨簡(jiǎn)單、快速，尤其是能區(qū)分多種相近的腫瘤(或發(fā)展階段)，并可實(shí)現(xiàn)MDS流式積分的計(jì)算。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供新的抗體組合物及包括它們的試劑盒，用于進(jìn)行白血病和淋巴瘤分型。另外，本發(fā)明還提供了使用它們進(jìn)行白血病和淋巴瘤分型的方法和應(yīng)用等。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了抗體組合物，其包括抗CD71抗體、抗CD7抗體、抗CD13抗體、抗CD33抗體、抗CD19抗體、抗CD117抗體、抗CD34抗體、抗CD10抗體、抗HLA-DR抗體和抗CD45抗體。

優(yōu)選本發(fā)明第一方面的抗體組合物由抗CD71抗體、抗CD7抗體、抗CD13抗體、抗CD33抗體、抗CD19抗體、抗CD117抗體、抗CD34抗體、抗CD10抗體、抗HLA-DR抗體、抗CD45抗體組成。

抗體(優(yōu)選是單克隆抗體)組合物，其包括抗CD71抗體、抗CD7抗體、抗CD13抗體、抗CD33抗體、抗CD19抗體、抗CD117抗體、抗CD34抗體、抗CD10抗體、抗HLA-DR抗體和抗CD45抗體，優(yōu)選其由抗CD71抗體、抗CD7抗體、抗CD13抗體、抗CD33抗體、抗CD19抗體、抗CD117抗體、抗CD34抗體、抗CD10抗體、抗HLA-DR抗體和抗CD45抗體組成。

在本文中，抗體本身是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其特異結(jié)合(抗)相應(yīng)抗原?？贵w可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，優(yōu)選是單克隆抗體?？贵w可以是鼠源的，也可以是人源的。在本文中，如沒有相反的指示，各抗體的抗原，即各細(xì)胞表面抗原(CD71、CD7、CD13、CD33、CD19、CD117、CD34、CD10、HLA-DR和CD45)，均為人細(xì)胞表面抗原。

更優(yōu)選本發(fā)明第一方面的抗體組合物中的每種抗體被標(biāo)記不同(即檢測(cè)波長(zhǎng)不同)的熒光標(biāo)記，優(yōu)選每種抗體分別被標(biāo)記的熒光標(biāo)記選自包括但不限于以下熒光標(biāo)記：FITC、AlexaFluor 488、PE、ECD、PerCP、PerCP-cy5.5、PerCP-cy7、APC、AlexaFluor647、Alexa Fluor 680or 700、APC-Alexa Fluor700、APC-Alexa Fluor750、APC-cy7、APC-H7、PacificBlue、Horizon V450、AmCyan、PacificOrange、KromeOrange、Brilliant Violet 421(BV421)、Brilliant Violet 510(BV510)、Brilliant Violet 570(BV570)、Brilliant Violet 605(BV605)、Brilliant Violet 650(BV650)、Brilliant Violet 711(BV711)、Brilliant Violet 785(BV785)等。這些熒光標(biāo)記、甚至是連接了熒光標(biāo)記的抗體通常是可通過(guò)商業(yè)渠道獲得，例如，AlexaFluor系列可購(gòu)自Invitrogen,Inc.，Brilliant Violet系列可購(gòu)自Sirigen Group Ltd.，ECD和KromeOrage可購(gòu)自Beckman Coulter，APC-H7和Horizon可購(gòu)自BD Biosciences。

通過(guò)十色流式細(xì)胞儀，本發(fā)明第一方面的抗體組合物單管單次上機(jī)即可檢測(cè)出抗CD71抗體、抗CD7抗體、抗CD13抗體、抗CD33抗體、抗CD19抗體、抗CD117抗體、抗CD34抗體、抗CD10抗體、抗HLA-DR抗體、抗CD45抗體的結(jié)果。

在第二方面，本發(fā)明提供了用于白血病和淋巴瘤分型的試劑盒，其包括第一容器，其中，第一容器包括本發(fā)明第一方面的抗體組合物。本發(fā)明第二方面的試劑盒采用包括抗CD71抗體在內(nèi)的10種抗體，互相之間沒有產(chǎn)生干擾，只需要一次上樣，就可有效進(jìn)行多種血液腫瘤的免疫分型(特別是初篩)，尤其是能區(qū)分多種相近的腫瘤(或發(fā)展階段)，并可實(shí)現(xiàn)MDS流式積分的計(jì)算，在血液腫瘤免疫分型中應(yīng)用前景廣闊。

本發(fā)明第二方面的試劑盒還可以包括其他參與進(jìn)行白血病和淋巴瘤分型的試劑和設(shè)備。優(yōu)選本發(fā)明第二方面的試劑盒還包括第二容器，其中，第二容器包括紅細(xì)胞裂解液(如，10×紅細(xì)胞裂解液)。本發(fā)明第二方面的試劑盒中還可以包括緩沖液(如，磷酸鹽緩沖液)、與流式細(xì)胞儀配套使用的流式管、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、移液器、離心機(jī)等，尤其是流式管、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等耗材。

在本文中，第一容器和第二容器中的標(biāo)號(hào)僅僅為表示不同容器，并不對(duì)容器本身的材質(zhì)、形狀構(gòu)成限制，只要容器能容納并保存本發(fā)明的抗體組合物即可。容器可以是管、瓶，其材質(zhì)可以是塑料或玻璃。其中，裝有本發(fā)明第一方面的抗體組合物的第一容器優(yōu)選能避光。

另外，本發(fā)明第三方面的試劑盒還可以包括知道進(jìn)行白血病和淋巴瘤分型的說(shuō)明書或手冊(cè)。

第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的抗體組合物在制備白血病和淋巴瘤分型的試劑盒中的應(yīng)用。

優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，試劑盒是本發(fā)明第二方面的試劑盒。

還優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，白血病和淋巴瘤包括MDS轉(zhuǎn)化的急性髓細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病M3、骨髓增生異常綜合征(MDS)、正常骨髓伴反應(yīng)性B細(xì)胞增生、急性髓細(xì)胞白血病M5型、邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)和Castleman病。

也優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，白血病和淋巴瘤分型的方法包括：

(1)處理骨髓或外周血樣品，使呈單個(gè)細(xì)胞懸液狀態(tài)；

(2)將步驟(1)處理的樣品與本發(fā)明第一方面的抗體組合物混合加入流式管，混勻后孵育15分鐘；

(3)向步驟(2)孵育的流式管中加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后孵育10分鐘，500×g離心5分鐘，去上清并重懸；和

(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)步驟(3)得到的流式管，并計(jì)算結(jié)果。

由于是對(duì)已經(jīng)診斷出白血病和淋巴瘤的病人樣品進(jìn)行分型，不再出具有診斷信息的結(jié)果(如果混有健康人的樣品，反而干擾分型的準(zhǔn)確性)，而且也沒有樣品的獲取步驟，甚至可以是使用教學(xué)用樣品來(lái)進(jìn)行教授白血病和淋巴瘤分型的方法，因此上述方法可以是非診斷的免疫分型方法。優(yōu)選上述方法是非診斷方法。

更優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，計(jì)算結(jié)果是計(jì)算抗以下細(xì)胞表面抗原的抗體對(duì)的熒光結(jié)果表達(dá)強(qiáng)度：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，CD19vs HLA-DR，CD71vs CD117，CD19vs CD10，CD34vs CD117，CD7vs CD13，CD45vs CD34，CD19vs CD33，和/或CD19vs CD117。在本文中，如無(wú)相反指示，檢測(cè)均是以CD45vs SSC(即CD45/SSC)設(shè)門。

進(jìn)一步優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，對(duì)以下所述疾病計(jì)算抗以下所述細(xì)胞表面抗原的抗體對(duì)的熒光表達(dá)情況，包括但不限于以下組合：

(1)MDS轉(zhuǎn)化的急性髓細(xì)胞白血?。篊D117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，和CD19vs HLA-DR；

(2)急性髓細(xì)胞白血病M3：CD7vs CD34，CD71vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；

(3)骨髓增生異常綜合征：CD7vs CD13，CD71vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，CD117vs HLA-DR，CD45vs CD34，和CD19vs CD33；

(4)正常骨髓伴反應(yīng)性B細(xì)胞增生：CD7vs CD13，CD71vsCD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD19vs CD10，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；

(5)急性髓細(xì)胞白血病M5型：CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，CD19vs CD117，和CD117vs HLA-DR；

(6)邊緣區(qū)淋巴瘤：CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD10vs CD34，CD34vs CD117，和CD117vs HLA-DR；和/或，

(7)Castleman?。篊D7vs CD34，CD71vs CD 117，CD10vs CD19，CD33vs CD13，和CD117vs HLA-DR。

上述檢測(cè)和計(jì)算可以單獨(dú)針對(duì)其中的某一疾病進(jìn)行，例如在僅在制備鑒定MDS轉(zhuǎn)化的急性髓細(xì)胞白血病的試劑盒中的應(yīng)用中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式管的以下抗原的抗體的熒光，并計(jì)算相應(yīng)抗體對(duì)的熒光結(jié)果：CD117vs HLA-DR，CD7vs CD34，CD7vs CD117，CD33vs CD13，CD19vs CD34，CD34vs CD10，和CD19vs HLA-DR。

本發(fā)明的有益效果在于：突破了現(xiàn)有技術(shù)的限制，只需要一次上樣，就可有效進(jìn)行多種血液腫瘤的免疫分型(特別是初篩)，而且節(jié)約了成本、操作更趨簡(jiǎn)單、快速，尤其是能區(qū)分多種相近的腫瘤(或發(fā)展階段)，并可實(shí)現(xiàn)MDS流式積分的計(jì)算。

為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了MDS轉(zhuǎn)化的急性髓細(xì)胞白血病的檢測(cè)圖，其中原始髓系細(xì)胞群約占總數(shù)的13.38％(伴CD10dim)。

圖2顯示了急性髓細(xì)胞白血病M3型的檢測(cè)圖，其中異常幼稚粒細(xì)胞群約占總數(shù)的93.55％。

圖3顯示了骨髓增生異常綜合征(MDS)的檢測(cè)圖，其中異常中性粒細(xì)胞群約占總數(shù)的38.16％(桿分為主，部分中晚幼)，CD33/CD13分化軌跡異常，伴CD19少量表達(dá)，流式MDS積分2分。

圖4顯示了(正常骨髓的)B細(xì)胞反應(yīng)性增生的檢測(cè)圖，其中可見4類細(xì)胞，A群(中性粒細(xì)胞，中晚幼和桿分為主)約占總數(shù)的74.02％，B群(單核細(xì)胞)約占總數(shù)的5.01％，C群(淋巴細(xì)胞，T為主，少量B和NK)約占總數(shù)的5.27％，D群(早、中期B淋巴細(xì)胞)約占總數(shù)的6.28％。

圖5顯示了急性髓細(xì)胞白血病M5型的檢測(cè)圖，其中原始單核細(xì)胞群約占總數(shù)的63.87％，幼稚單核細(xì)胞群約占總數(shù)的19.31％。

圖6顯示了邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)的檢測(cè)圖，其中異常B淋巴細(xì)胞群約占總數(shù)的49.51％。

圖7顯示了Castleman病的檢測(cè)圖，其中淋巴結(jié)組織的活細(xì)胞占總數(shù)50％以上，8.66％異常淋巴細(xì)胞的表型為CD7++CD34++CD71－CD117－CD19－CD10－CD33+HLA-DRdim。

具體實(shí)施方式

以下本文將通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)、《免疫檢測(cè)技術(shù)》(科學(xué)出版社,北京,中國(guó),1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來(lái)實(shí)施。其中，所用的試劑原料均為市售品，可以通過(guò)公開渠道購(gòu)買獲得。

實(shí)施例1試劑的配制

本實(shí)施例使用抗體組合如下(其中的每種抗體以抗原和熒光標(biāo)記連字命名)：CD71-FITC、CD7-PE、CD13-ECD、CD33-PerCP-cy5.5(簡(jiǎn)稱為CD33 PC5.5)、CD19-PerCP-cy7(簡(jiǎn)稱為CD19PC7)、CD117-APC、CD34-APC-Alexa Fluor700(簡(jiǎn)稱為CD34 APC-A700)、CD10-APC-Alexa Fluor750(簡(jiǎn)稱為CD10 APC-A750)、HLA-DR-BV421、CD45-KromeOrange(簡(jiǎn)稱為CD45KO)，這些抗體均可直接通過(guò)公開渠道購(gòu)買獲得，本發(fā)明實(shí)施例的抗體均從上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。

對(duì)以上單克隆抗體分別取樣，梯度稀釋，分別在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，通過(guò)滴定確定每種抗體最佳用量，具體用量如下表所示。

取以上十種定量抗體試劑直接混合裝于同一個(gè)容器(第一容器)內(nèi)，任選再配以10×紅細(xì)胞裂解液裝于第二容器內(nèi)，即構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒。其中，10×紅細(xì)胞裂解液的配制方法如下：稱取80.2gNH₄Cl，8.4gNaHCO₃和3.7g EDTA-2Na，加水至900ml，混勻，調(diào)節(jié)pH至7.4，加水至1L。

實(shí)施例2樣品的處理

取肝素或EDTA抗凝的骨髓或外周血樣本，調(diào)整至細(xì)胞密度為1～5×10⁶/ml，然后通過(guò)200目工業(yè)篩網(wǎng)過(guò)濾，去除樣本中團(tuán)塊樣物質(zhì)，保證單個(gè)細(xì)胞懸液狀態(tài)，保存于2～8℃，即為處理好的標(biāo)本。

實(shí)施例3樣品的檢測(cè)

取流式管，加入實(shí)施例1試劑盒中的抗體混合物。再取50μl實(shí)施例2處理好的標(biāo)本，渦旋振蕩器震蕩混勻，室溫(25℃)避光孵育15分鐘。

用1×PBS緩沖液將10×紅細(xì)胞裂解液稀釋成1×紅細(xì)胞裂解液，然后向孵育后的上述流式管加入稀釋后的1×紅細(xì)胞裂解液2ml，用渦旋振蕩器震蕩混勻，室溫(25℃)避光靜置10分鐘。

將流式管以1500rpm離心5分鐘，棄去上清，加入200μl 1×PBS重懸。樣品處理完畢，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，以熒光標(biāo)記的十色波長(zhǎng)檢測(cè)。

大量不同來(lái)源的已知血液腫瘤的樣品進(jìn)行檢測(cè)，以CD45vs SSC設(shè)門，考察各種疾病的檢測(cè)結(jié)果，其能特異性表征相應(yīng)疾病的檢測(cè)結(jié)果如圖1-7所示。通過(guò)一次上樣即可檢測(cè)區(qū)分出MDS轉(zhuǎn)化的急性髓細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病M3型、骨髓增生異常綜合征(MDS)、(正常骨髓的)B細(xì)胞反應(yīng)性增生、急性髓細(xì)胞白血病M5型、邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)和Castleman病，尤其是能顯著區(qū)分出MDS、MDS轉(zhuǎn)化的急性髓細(xì)胞白血病和(正常骨髓的)B細(xì)胞反應(yīng)性增生等，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)MDS流式積分的計(jì)算。