專利名稱：丙戊酸均相酶免疫快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于丙戊酸臨床樣本檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測丙戊酸濃度的試齊U盒。
背景技術(shù)：
在目前眾多的抗癲癇藥物中，丙戊酸是一個臨床應(yīng)用廣、療效高和安全性好的首選、廣譜藥物。丙戊酸不僅可以用于治療各類癲癇的全身性發(fā)作，尤其是失神發(fā)作和強直-陣攣發(fā)作，還可用于部分性發(fā)作。此外，丙戊酸很少影響患者的認(rèn)知功能，并極少引起癲癇的發(fā)作加重。在治療過程中由于患者個體藥物代謝動力學(xué)差異，造成丙戊酸給藥量與血藥濃度之間相關(guān)性較差。按常規(guī)劑量給藥測得的血藥濃度，通常有50%低于或超出丙戊酸的有效治療范圍(50 100 μ g/ml)，因此對患者的丙戊酸血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測，對及時調(diào)整劑量，提高丙戊酸治療癲癇的安全有效性具有重要的臨床指導(dǎo)意義。目前，國內(nèi)外運用于血藥濃度檢測的方法主要有色譜分析法和免疫分析法。色譜法包括高效液相色譜(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MSMQ等，該方法對待測物具有高度特異性， 但需要對樣品進(jìn)行前期處理，操作過程復(fù)雜、周期較長，儀器設(shè)備昂貴且對操作人員要求較高。而免疫分析法具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，國內(nèi)目前應(yīng)用于丙戊酸分析的免疫法主要有發(fā)光免疫、酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISAA)等。ELISA檢測法靈敏度高，但準(zhǔn)確度不足， 只能半定量。同時國內(nèi)目前尚無自主開發(fā)的發(fā)光免疫試劑，主要通過購買國外分析試劑盒在封閉型發(fā)光儀上進(jìn)行檢測。受儀器及試劑成本限制，該方法不利于在全國范圍內(nèi)推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于均相酶免疫法建立的丙戊酸藥物濃度檢測方法，提供一種簡便、快速、 高靈敏度、全自動化的檢測試劑盒，具有特異性強、精確度高和高通量檢驗等優(yōu)點。能夠彌補現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，滿足國內(nèi)丙戊酸藥物濃度檢測需要，具有重要的社會意義和應(yīng)用價值。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種丙戊酸均相酶免疫快速檢測試劑盒，其特征在于由以下幾種組分組成反應(yīng)液R1，為酶反應(yīng)底物稀釋的抗丙戊酸特異性抗體；反應(yīng)液R2，為丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物；定標(biāo)液，由丙戊酸校準(zhǔn)品溶于空白緩沖溶液中制得。所述抗丙戊酸特異性抗體為單克隆或多克隆體。所述反應(yīng)液Rl和反應(yīng)液R2的總量為75 150 μ 1，定標(biāo)液為5 20 μ 1。所述反應(yīng)液Rl的制備過程為先通過向丙戊酸衍生物溶液中加入1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDAc)以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-MB)使丙戊酸衍生物活化，隨后與載體蛋白質(zhì)在室溫下進(jìn)行偶聯(lián)制備免疫抗原；將制備的免疫抗原免疫動物后生產(chǎn)丙戊酸特異性抗體；最后用酶反應(yīng)底物按1 300 1 5000稀釋特異性抗體而制得。所述載體蛋白質(zhì)包括血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)或匙孔血藍(lán)蛋白 (KLH)。所述酶反應(yīng)底物含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和6磷酸葡萄糖(G6P)，兩者的濃度總量為2. 81 11. 25mmol/L0所述反應(yīng)液R2由葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)標(biāo)記的丙戊酸組成。所述反應(yīng)液R2的制備過程為先通過向丙戊酸衍生物溶液中加入三丁胺和氯甲酸異丁酯活化丙戊酸衍生物；隨后與葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)在-2 _8°C條件下進(jìn)行偶聯(lián)，利用凝膠層析柱進(jìn)行純化，得到丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物；最后用緩沖溶液按1 300 1 5000稀釋丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物制得。在對丙戊酸進(jìn)行測定的過程中，反應(yīng)體系在均一的液相中進(jìn)行，無需分離步驟。本發(fā)明提供的丙戊酸檢測試劑盒可應(yīng)用于血液丙戊酸濃度的精確定量分析，在臨床應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢。1、準(zhǔn)確度好、精密度高、特異性及靈敏度強。試劑驗證結(jié)果表明運用本發(fā)明提供的均相酶免疫檢測試劑盒進(jìn)行丙戊酸分析，樣品的平均回收率(Recovery)均為 95. 7士3. 2%，批內(nèi)、批間精密度相關(guān)系數(shù)偏差(CV)小于4. 7%，檢測靈敏度達(dá)到25ng/ml以下。該試劑盒中提供的丙戊酸抗體的特異性強，藥物交叉反應(yīng)試驗中，對測試的32種常見藥物和化合物無任何交叉反應(yīng)，適合臨床檢驗丙戊酸的血藥濃度。2、操作簡便、自動化快速檢測、對檢測儀器要求較低。檢測試劑盒針對國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院檢驗設(shè)備較差的現(xiàn)狀而設(shè)計，在一般的生化分析儀上即能進(jìn)行。在已經(jīng)設(shè)置好運行參數(shù)的分析儀上，將定標(biāo)液、樣本及試劑放入相應(yīng)的樣品盤及試劑盤中，點擊運行程序即可自動完成檢測。排除人為操作造成的實驗誤差，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。3、節(jié)約試劑成本。丙戊酸檢測試劑盒可運用于開放性生化分析儀，實現(xiàn)檢測試劑自主化生產(chǎn)。初步估計實現(xiàn)生化檢驗從封閉型向開放型轉(zhuǎn)變，至少降低50%的試劑成本費用。


圖1為丙戊酸免疫快速檢測試劑盒定標(biāo)曲線。圖2為丙戊酸均相酶免疫檢測與免疫熒光偏振方法比對。
具體實施例方式本發(fā)明基于均相酶免疫法建立丙戊酸檢測方法，其原理主要運用了競爭性免疫反應(yīng)原理，反應(yīng)過程為液體樣本中游離的丙戊酸與偶聯(lián)在G6PDH上的丙戊酸競爭性結(jié)合特異性抗體。G6PDH-丙戊酸偶聯(lián)物具有免疫反應(yīng)和酶催化活性，能夠催化氧化還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)還原生成NADH。這個過程導(dǎo)致吸光度的變化，可以在340nm波長光源下被檢測到。一旦偶聯(lián)物與抗體結(jié)合，偶聯(lián)物的酶催化活性即被抑制，因此液體樣本中丙戊酸含量越多，使更多的G6PDH-丙戊酸偶聯(lián)物游離出來，導(dǎo)致吸收值上升。為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖予以說明。
一、反應(yīng)液Rl試劑的制備1、丙戊酸免疫抗原合成首先制備BSA溶液將20mg BSA溶解于5ml磷酸緩沖液(0. 2mo 1/LNa2HPO4, pH8. 5) 中；同時制備丙戊酸衍生物溶液，將20mg丙戊酸衍生物、350μ 1 二甲基甲酰胺(DMF)、 350 μ 1 乙醇、7. Oml (10mmol/L, pH 5. 0)磷酸鉀緩沖液、40mg 的 EDAc、5mg 的 Sulfo-NHS 力口入燒杯中攪拌溶解，攪拌溶解反應(yīng)30min ；將制備好的丙戊酸溶液滴加到BSA溶液中于2 8°C溫度下持續(xù)攪拌12小時，隨后經(jīng)過透析進(jìn)行純化，得到丙戊酸免疫抗原。2、抗丙戊酸特異性抗體的制備用PBS磷酸緩沖液將合成的丙戊酸免疫原稀釋至1. Omg/ml，然后用1. Oml的抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對家兔進(jìn)行注射；14 21天后，再用1. Oml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對家兔注射一次，之后每隔四周一次，4個月后獲得的抗體約為1 300 1 5000。3、反應(yīng)液Rl試劑的配制量取IL三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(55mmol/L Tris, 0. 1% BSA, 145. 4mmol/ L NaCl,3mmol/L MgCl2, pH8. 0)，依次加入 2. 02 8. 07gNAD 和 0. 86 3. 42gG6P,在室溫下攪拌lOmin。然后將丙戊酸特異性抗體按稀釋比例添加到上述溶液中，稀釋比例為 1 300 1 5000。二、反應(yīng)液R2試劑的制備1、丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物的合成G6PDH溶液制備將IOmg的G6PDH溶解于12ml Tris緩沖液(pH7. 5)中，然后依次加入150mg的NADH、90mg G6P及0. 5ml卡必醇，隨后逐滴加入1. 5ml 二甲亞砜(DMSO)。丙戊酸衍生物溶液制備將8mg丙戊酸衍生物溶解于600μ 1 二甲基甲酰胺(DMF)，然后將溶液冷卻至-2 -8°C后，加入4μ1三丁胺和2μ1氯甲酸異丁酯， 在-2 _8°C下持續(xù)攪拌30min ；最后將制備好的丙戊酸衍生物溶液逐滴加入G6PDH溶液中在-2 -8°C下持續(xù)攪拌1小時。將偶聯(lián)物過凝膠層析柱進(jìn)行純化，得到了丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物。2、反應(yīng)液R2試劑的配制將丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物按稀釋比例添加到IL Tris緩沖液(pH8. 0)中，稀釋比例為 1 300 1 5000。三、定標(biāo)液的制備定標(biāo)液為6種不同丙戊酸質(zhì)量濃度的溶液，由丙戊酸校準(zhǔn)品溶于空白緩沖溶液中制得。定標(biāo)液中的丙戊酸質(zhì)量濃度分別為0μ g/ml、12. 5μ g/ml、25. 0μ g/ml、50. 0μ g/ ml、100.0 μ g/ml>150. 0 μ g/ml。四、丙戊酸檢測試劑盒在全自動生化分析儀上的使用1、設(shè)置儀器的運行參數(shù)反應(yīng)液Rl和反應(yīng)液R2試劑的總體積為75 150 μ 1，樣本及定標(biāo)液的總體積為5 20 μ 1，分析方法為兩點速率法，檢測主波長為340nm、副波長為 405nm，測光范圍為10至20點。指定反應(yīng)液Rl及反應(yīng)液R2試劑位置、丙戊酸定標(biāo)液的位
置及對應(yīng)質(zhì)量濃度。
2、將試劑盒按分類放入生化儀中，運行儀器進(jìn)行自動測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，定標(biāo)結(jié)果存儲于儀器中。隨后將待測臨床血液樣本加入樣品杯并放入樣品盤中，樣品測試申請后運行儀器進(jìn)行自動測試，儀器將測得的吸光度變化率根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成藥物濃度， 并由終端顯示和打印。五、丙戊酸檢測試劑盒方法驗證1、精密度分析將丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于緩沖溶液中，分別制備濃度為37. 5μ g/ml (低)、75μ g/ ml (中)、125yg/ml (高)的樣品。將每種樣品分裝5份，用丙戊酸均相酶免疫試劑盒進(jìn)行測定，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差獲得批內(nèi)精密度(CV%)；同時取丙戊酸低、中、高樣品連續(xù)測定5 天，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差獲得批內(nèi)精密度。結(jié)果如表1所示，丙戊酸均相酶免疫檢測試劑盒具有良好的精密度，其中批內(nèi)、批間精密度CV均小于4. 7%。表1丙戊酸均相酶免疫檢測精密度分析
權(quán)利要求
1.一種丙戊酸均相酶免疫快速檢測試劑盒，其特征在于由以下幾種組分組成反應(yīng)液R1，為酶反應(yīng)底物稀釋的抗丙戊酸特異性抗體；反應(yīng)液R2，為丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物；定標(biāo)液，由丙戊酸校準(zhǔn)品溶于空白緩沖溶液中制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗丙戊酸特異性抗體為單克隆或多克隆體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液Rl和反應(yīng)液R2的總量為75 150 μ 1，定標(biāo)液為5 20 μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液Rl的制備過程為先通過向丙戊酸衍生物溶液中加入1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDAc) 以及N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-MB)使丙戊酸衍生物活化，隨后與載體蛋白質(zhì)在室溫下進(jìn)行偶聯(lián)制備免疫抗原；將制備的免疫抗原免疫動物后生產(chǎn)丙戊酸特異性抗體；最后用酶反應(yīng)底物按1 300 1 5000稀釋特異性抗體而制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白質(zhì)包括血清白蛋白 (BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測試劑盒，特征在于，所述酶反應(yīng)底物含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和6磷酸葡萄糖(G6P)，兩者的濃度總量為2. 81 11. 25mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的丙戊酸均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液R2由葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)標(biāo)記的丙戊酸組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的丙戊酸均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液R2 的制備過程為先通過向丙戊酸衍生物溶液中加入三丁胺和氯甲酸異丁酯活化丙戊酸衍生物；隨后與葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)在-2 _8°C條件下進(jìn)行偶聯(lián)，利用凝膠層析柱進(jìn)行純化，得到丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物；最后用緩沖溶液按1 300 1 5000稀釋丙戊酸酶標(biāo)偶聯(lián)物制得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，在對丙戊酸進(jìn)行測定的過程中，反應(yīng)體系在均一的液相中進(jìn)行，無需分離步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于丙戊酸血藥濃度監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種丙戊酸均相酶免疫快速檢測試劑盒，通過合成衍生物將丙戊酸連接到小牛血清白蛋白(BSA)上制得免疫抗原，獲得的多克隆抗體具有丙戊酸特異性。實驗數(shù)據(jù)表明利用該試劑檢測丙戊酸與其他常用藥物無交叉反應(yīng)；分析靈敏度達(dá)到25ng/ml以下；批間精密度、批內(nèi)精密度變異系數(shù)(CV)均小于4.7％；與免疫熒光偏振法(FPIA)進(jìn)行方法比對，R2值達(dá)到0.98?？蛇\用于多種常規(guī)分析儀，由于操作簡便、快速、成本低、靈敏度高，該試劑盒易于實現(xiàn)自動化檢測，可指導(dǎo)臨床個性化用藥，降低藥物的毒副作用，達(dá)到療效最優(yōu)化。
文檔編號G01N33/535GK102507917SQ201110340440
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者梁耀銘, 王文峰, 王金文, 虞留明, 陳美才 申請人:四川金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司