專利名稱：一種檢測巴曲酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品、生物制品產(chǎn)品領(lǐng)域，具體涉及一種利用生色底物法測定巴曲酶活性的方法。
背景技術(shù)：
蛇毒血凝酶是從蝰蛇毒中提取并利用現(xiàn)代生物技術(shù)分離純化精制而成。它是一種以止血作用為主的酶制劑，含有兩種可促進(jìn)血液凝固的成分，分別為蝰蛇巴曲酶(Batroxobin)和磷脂依賴性凝血因子X激活物(簡稱FXA)。其中，對于巴曲酶的研究已有七十多年的歷史，早在1936年Van Klobusitzky等就從巴西矛頭蛇的毒液中純化出一種酶性止血?jiǎng)〣atroxobin,在國內(nèi)又稱“巴曲酶”。巴曲酶屬于絲氨酸蛋白酶類分子,是一種單鏈糖蛋白，它能專一作用于纖維蛋白原分子A a鏈N末端的Argl6-Glyl7肽鍵，釋放血纖維蛋白肽A，生成不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白I單體，進(jìn)而交聯(lián)聚合成纖維蛋白I多聚體，促進(jìn)出血部位血小板聚集產(chǎn)生止血效應(yīng)，并激活血管內(nèi)皮釋放組織型纖維蛋白溶酶原激活物(t-PA)，發(fā)揮抗血栓的作用。據(jù)報(bào)道，巴曲酶在臨床上已被廣泛應(yīng)用于不穩(wěn)定性心絞痛、高黏血癥等多種疾病的治療和閉塞性心腦血管血栓性疾病的預(yù)防，療效確切，不良反應(yīng)低微。迄今為止，巴曲酶活性測定主要有兩種方法國家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定巴曲酶原料及制劑酶活性的測定方法均采用凝固法，在體外將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白后生成凝塊時(shí)，根據(jù)凝塊生成的快慢判定巴曲酶的效價(jià)，此方法靈敏度可達(dá)到2. 5Bu/ml，重現(xiàn)性較好，但該法操作需目測判斷纖維蛋白原凝固時(shí)間，受檢測者主觀干擾較大；第二種為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，其原理是利用抗原抗體反應(yīng)，將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，經(jīng)底物顯色后用分光光度計(jì)判定結(jié)果，基于酶的高催化效率，反應(yīng)過程可被無限放大，具有很高的靈敏度和強(qiáng)特異性，但需要高純度的抗體，成本很高，制約其廣泛應(yīng)用。鑒于上述方法的局限性，尋找一種高效、經(jīng)濟(jì)的活性測定方法成為巴曲酶應(yīng)用研究的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、可靠、準(zhǔn)確的巴曲酶活性測定方法。本發(fā)明中的巴曲酶或降纖酶在檢測過程中可解離發(fā)色物質(zhì)S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 2HC1)，釋放出在405nm波長處有特定吸光值的黃色產(chǎn)物對硝基苯胺(PNA)，通過檢測405nm處PNA的吸光度，即可對巴曲酶活性進(jìn)行測定，在這一波長下，其它物質(zhì)對光的吸收小于PNA對光吸收的I %，隨著酶活性梯度變化，吸光度也呈現(xiàn)梯度變化，在一定時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物吸光度與酶的活性線性相關(guān)。據(jù)此可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算待測巴曲酶樣品的活性。該方法包括以下步驟(I)配制 pH = 7. 5，濃度為 0. 02M 的 Tris-HCl 緩沖液 A ；(2)用(I)步制備的緩沖液將巴曲酶生色底物S-2238配制成溶液B ；(3)用(I)步制備的緩沖液將降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列不同活性單位的母液C ；
(4)用(I)步制備的緩沖液將待測巴曲酶樣品稀釋成溶液D ;(5)將系列不同活性單位的標(biāo)準(zhǔn)品母液C與待測樣品溶液D分別加到酶標(biāo)板不同孔中，再向每孔中補(bǔ)充溶液A和相同體積的溶液B，保持每孔溶液的總體積一致，孔內(nèi)溶液混合混勻，放入預(yù)熱至37°C的酶標(biāo)儀中反應(yīng)，分別測定每孔中酶解產(chǎn)物對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，并根據(jù)測定得到的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品母液吸光度A405值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位-吸光度線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述標(biāo)準(zhǔn)品母液C及待測巴曲酶樣品溶液D活性單位為Bu ；(6)將測定的巴曲酶樣品的吸光度A405值，代入(5)步得到的酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測巴曲酶樣品的酶活性。其中，優(yōu)選地，上述(2)步中溶液B的濃度為3mM，( 3)步使用的降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品活性濃度為16Bu/ml，制成的系列不同活性單位的母液C活性是1. 5Bu、l. 2Bu、0. 9Bu、0. 6Bu、0. 3Bu、0. 15Bu, (5)步中加入的溶液B體積為49. 5 u 1，每孔溶液總體積為300 yl。上述(5)步中的混合溶液在酶標(biāo)儀預(yù)熱時(shí)間為4分鐘，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，測定405nm波長處每孔酶解產(chǎn)物對硝基苯胺(PNA)的吸收值A(chǔ)405。本發(fā)明中需加入過量生色底物S-2238，因酶量一定時(shí)，酶反應(yīng)隨著底物濃度不斷增加到一定程度將表現(xiàn)為0級反應(yīng)，即酶反應(yīng)速率不再受底物濃度的影響。因此，在底物遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的情況下，酶反應(yīng)速率對酶濃度呈線性關(guān)系。優(yōu)選地，上述酶標(biāo)板中每孔溶液總反應(yīng)體積為300 ill時(shí)，加入降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品母液活性單位< 3Bu/孔，生色底物S-2238溶液濃度彡 0.149mM。本發(fā)明反應(yīng)需預(yù)熱4分鐘，然后再37°C反應(yīng)15分鐘的原因主要在于，未預(yù)熱時(shí)，反應(yīng)體系里的底物分子和酶分子不能完全接觸，易造成局部反應(yīng)，預(yù)熱可以加速分子混勻，保證整個(gè)體系都能在37°C以最大反應(yīng)速度反應(yīng)，容易得到線性反應(yīng)曲線。與現(xiàn)有測定方法相比，本發(fā)明中整個(gè)反應(yīng)過程在96孔板中進(jìn)行，體系體積小，效率高，酶標(biāo)儀的使用也大大減少了吸光度的讀數(shù)時(shí)間。因此，本方法過程簡單，便于控制，易于操作，重復(fù)性很好。本發(fā)明中，酶與底物生色反應(yīng)無終止劑，為取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，整個(gè)操作過程需緊湊，以免人為造成標(biāo)準(zhǔn)曲線有較大誤差。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例I中酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉的具體實(shí)施方式
。I、儀器與試藥巴曲酶生色底物S_2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 2HC1)(購于 Lexington 公司)，降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品白色粉末(購于中國藥品生物制品檢定所、規(guī)格為64Bu/瓶)，0. 02MTris-HCl緩沖液(pH7. 5)，待測巴曲酶/蛇毒血凝酶樣品。酶標(biāo)儀(型號Biorad 680)。2、實(shí)驗(yàn)方法
(I)實(shí)施例 I①用0. 02M Tris-HCl緩沖液，該溶液的pH = 7. 5，配制3mM的S-2238底物溶液和16Bu/ml的降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品母液；②隨機(jī)選取兆科藥業(yè)(合肥)有限公司生產(chǎn)留樣的、批號為20100409的蛇毒血凝酶制劑作為測試樣品，標(biāo)記量為lKu/ml ；
③酶標(biāo)板中每孔加入活性單位分別為I. 5、I. 2,0. 9,0. 6,0. 3,0. 15Bu的降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品母液，用0. 02M Tris-HCl緩沖液，pH = 7. 5，補(bǔ)足至250. 5 yl，再加入49. 5 u I 3mM生色底物S-2238溶液，混勻，每個(gè)活性單位標(biāo)準(zhǔn)品母液3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系如表I ;表I降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品活降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品Tris-HCl生色底物
性單位(Bu)_母液(u I)_緩沖液Ul)_S-2238溶液(u I)_
Ti93.75156.7549^5
1.275175.549.5
0.956.25194.2549.5
0.637.5 21349.5
0.318.75231.7549.5
0. 159.45241.0549.5
0 0250.549.5④酶標(biāo)板孔中加入0. 2Ku蛇毒血凝酶制劑，體積200 U 1,49. 5u I 3mM生色底物S-2238 和 50. 5u I 0. 02M Tris-HCl 緩沖液，pH = 7. 5，混勻；⑤將上述③、④制備的酶標(biāo)板放入預(yù)熱4分鐘至37°C的酶標(biāo)儀中反應(yīng)15分鐘后，分別平行測定405nm波長處每孔酶解產(chǎn)物對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405。以降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位Bu為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的對硝基苯胺(PM)的吸光度A405為縱坐標(biāo)，制作酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 0. 625x+0. 091，R2 = 0. 999。測定得到的蛇毒血凝酶制劑吸光度A405值為0. 529，將該值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的該制劑中巴曲酶活力單位為0. 7Bu。由于加入反應(yīng)體系中體積為200 ii I，故該批蛇毒血凝酶制劑中巴曲酶活力為3. 5Bu/ml o(2)實(shí)施例 2選取兆科藥業(yè)(合肥)有限公司生產(chǎn)的四批蛇毒血凝酶制劑，批號分別為20100315、20100206和20091217，規(guī)格均為lKu/ml。酶標(biāo)板中，標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系同實(shí)施例1，各3個(gè)復(fù)孔。該三批待測樣品反應(yīng)體系均為200 u I制劑(酶量為0. 2Ku/孔)、50. 5 illTris-HCl溶液和49. 5 ill S-2238底物，每個(gè)樣品各5個(gè)復(fù)孔。將制備好的酶標(biāo)板，放入預(yù)熱4分鐘至37°C的酶標(biāo)儀中反應(yīng)15分鐘后，分別平行測定405nm波長處每孔酶解產(chǎn)物對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定待測樣品吸光度A405值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的待測樣品活性單位見表2。表2實(shí)施例2樣品的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測巴曲酶活性的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)配制pH= 7. 5，濃度為0. 02M的Tris-HCl緩沖液A ； (2)用(I)步制備的緩沖液將巴曲酶生色底物S-2238配制成溶液B; (3)用(I)步制備的緩沖液將降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列不同活性単位的母液C; (4)用(I)步制備的緩沖液將待測巴曲酶樣品稀釋成溶液D; (5)將系列不同活性単位的標(biāo)準(zhǔn)品母液C與待測樣品溶液D分別加到酶標(biāo)板不同孔中，再向每孔中補(bǔ)充溶液A和相同體積的溶液B，保持每孔溶液的總體積一致，孔內(nèi)溶液混合混勻，放入預(yù)熱至37°C的酶標(biāo)儀中反應(yīng)，分別測定每孔中酶解產(chǎn)物對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，井根據(jù)測定得到的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品母液吸光度A405值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位-吸光度線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述標(biāo)準(zhǔn)品母液C及待測巴曲酶樣品溶液D活性單位為Bu ； (6)將測定的巴曲酶樣品吸光度A405值，代入(5)步得到的酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測巴曲酶樣品的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，⑵步中溶液B的濃度為3mM，(3)步中使用的降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品活性濃度為16Bu/ml，制成的系列不同活性単位的母液C活性是I.5Bu、l. 2Bu、0. 9Bu、0. 6Bu、0. 3Bu、0. 15Bu, (5)步中加入的溶液 B 體積為 49. 5 U 1，每孔溶液總體積為300 yl。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述酶標(biāo)板中每孔溶液總反應(yīng)體積為300 ill時(shí)，加入降纖酶標(biāo)準(zhǔn)品母液活性く 3Bu/孔，生色底物S-2238溶液B濃度≥ 0.149mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于，所述(5)步中酶標(biāo)儀預(yù)熱時(shí)間為4分鐘，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速、特異性地測定巴曲酶活性的方法，采用生色底物法，使用酶標(biāo)儀，在一定反應(yīng)時(shí)間和一定活力的標(biāo)準(zhǔn)品范圍內(nèi)獲得線性反應(yīng)曲線，建立產(chǎn)物吸光值和巴曲酶量的線性關(guān)系，據(jù)此計(jì)算樣品的相應(yīng)酶活。此外，還對該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回收率和精密度做了仔細(xì)研究，該方法準(zhǔn)確度高，步驟簡單，成本較低，適用于巴曲酶原料及蛇毒血凝酶類制劑的質(zhì)量控制。
文檔編號G01N21/78GK102798632SQ20111013604
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者戴向榮, 劉娟娟, 方麗, 楊中強(qiáng), 李小羿, 張國輝 申請人:兆科藥業(yè)(合肥)有限公司