專利名稱：液相均相測(cè)定的制作方法
液相均相測(cè)定
背景技術(shù)：
特異性結(jié)合測(cè)定是用于檢測(cè)物質(zhì)存在或含量的測(cè)試方法，并且是以特異性識(shí)別和與特異性結(jié)合伴侶結(jié)合一起為基礎(chǔ)的。免疫測(cè)定是特異性結(jié)合測(cè)定的實(shí)例，其中抗體可結(jié)合于特定的蛋白質(zhì)或化合物。在這些實(shí)例中，抗體是特異性結(jié)合配對(duì)成員中的成員。核酸結(jié)合性測(cè)定是另一種類型，其中互補(bǔ)核酸鏈?zhǔn)翘禺愋越Y(jié)合配對(duì)。特異性結(jié)合測(cè)定構(gòu)成了較寬的和正在發(fā)展的技術(shù)領(lǐng)域，其能夠精確地檢測(cè)疾病狀態(tài)、傳染性生物體和非監(jiān)管藥物。在過(guò)去的幾十年中，一直進(jìn)行這些工作，以便設(shè)計(jì)出具有所要求的靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍、實(shí)用性、 廣泛適用性和適合自動(dòng)化的分析和測(cè)定方法。這些方法能夠被大體分組為兩個(gè)類型。均相的方法利用特異性結(jié)合分析物的反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)或者產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，無(wú)需要求在對(duì)分析物特異的反應(yīng)物和非分析物特異性的反應(yīng)物之間的分離步驟。異相的形式則依賴于被分析物結(jié)合的和游離的(未被結(jié)合于分析物)的可檢測(cè)地標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶之間的物理分離。分離典型地要求關(guān)鍵的反應(yīng)物被固定化到一些類型的固體基材上，以使得一些類型的物理過(guò)程例如過(guò)濾、沉積、聚結(jié)或者磁力分離可以被采用；并且典型地還要求洗滌步驟，以便除去游離的可檢測(cè)地標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶。依賴于產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)并且與分析物含量相關(guān)聯(lián)的測(cè)定方法已經(jīng)經(jīng)歷提高的應(yīng)用。這些方法能夠使用相對(duì)簡(jiǎn)單的儀器進(jìn)行，仍然可顯示良好的分析特性。特別地，使用酶標(biāo)記的用于分析物的特異性結(jié)合伴侶和化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)用酶底物的方法已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。普通的標(biāo)記酶包括堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶。美國(guó)專利6，911，305公開(kāi)了一種方法，用于在第一薄膜上檢測(cè)結(jié)合于敏化劑、或用敏化劑標(biāo)記的探針的多聚核苷酸分析物。該薄膜和攜帶有固定化化學(xué)發(fā)光前體的第二薄膜相接觸。激發(fā)在夾心薄膜中的敏化劑可產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧可與化學(xué)發(fā)光前體反應(yīng)從而在第二薄膜上產(chǎn)生可引發(fā)的化學(xué)發(fā)光化合物。該可引發(fā)的化學(xué)發(fā)光化合物可與試劑起反應(yīng)從而在第二薄膜上產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，用于檢測(cè)分析物。這些方法并不依賴于用于使反應(yīng)物進(jìn)行接觸的特異性結(jié)合反應(yīng)；相反，第二薄膜用作試劑輸送裝置。美國(guó)專利6，406，913公開(kāi)的測(cè)定方法包括在一定條件下處理懷疑含有分析物的介質(zhì)，使得該分析物可以引起光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物獲得密切接近。該光敏劑當(dāng)用光源輻照時(shí)可產(chǎn)生單線態(tài)氧；單線態(tài)氧可通過(guò)溶液擴(kuò)散至化學(xué)發(fā)光化合物，并且當(dāng)密切接近化學(xué)發(fā)光化合物時(shí)，單線態(tài)氧可激活該化學(xué)發(fā)光化合物。被激活的化學(xué)發(fā)光化合物隨后產(chǎn)生光。產(chǎn)生的光量與介質(zhì)中的分析物含量有關(guān)。在一種實(shí)施方式中，至少一種光敏劑或化學(xué)發(fā)光化合物與懸浮的顆粒相關(guān)聯(lián)，并且特異結(jié)合性配對(duì)成員被與其相結(jié)合。美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)US2007(^64664和US2007(^64665公開(kāi)了用于進(jìn)行特異性結(jié)合配對(duì)分析的測(cè)定方法，涉及固定化化學(xué)發(fā)光化合物與活化劑化合物的反應(yīng)，所述活化劑化合物借助于特異性結(jié)合反應(yīng)而進(jìn)入反應(yīng)性構(gòu)造中。其不要求分離或者除去過(guò)量的未結(jié)合的化學(xué)發(fā)光化合物或者活化劑。與現(xiàn)有測(cè)定技術(shù)相比，這些測(cè)定形式提供了優(yōu)良的操作便利性和在自動(dòng)化中的靈活性。盡管具有這些優(yōu)點(diǎn)，在測(cè)定方法設(shè)計(jì)和性能中附加的改進(jìn)始終是分析方法開(kāi)發(fā)人員的目標(biāo)。本發(fā)明公開(kāi)的測(cè)定方法通過(guò)提供簡(jiǎn)單的靈敏度改進(jìn)的測(cè)定法而滿足了這些需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)懷疑含有反應(yīng)物的樣品中反應(yīng)物的方法、試劑、試劑盒和系統(tǒng)， 其中所有的試劑皆可溶于水溶液。一種測(cè)定方法包括在反應(yīng)物存在的條件下，處理懷疑含有反應(yīng)物的樣品，使活化劑達(dá)到反應(yīng)構(gòu)型，化學(xué)發(fā)光化合物將其激活。樣品還被處理以減少與分析物不相關(guān)的信號(hào)。最后，用引發(fā)劑溶液處理該樣品，借此由被激發(fā)的化學(xué)發(fā)光化合物產(chǎn)生光。沒(méi)有試劑與某一表面或其他固相相連接。
具體實(shí)施例方式
定義烷基一含有1-20個(gè)碳的支鏈、直鏈或者環(huán)烷基團(tuán)，其可以用1個(gè)以上除H之外的取代基取代。在此使用的低級(jí)烷基是指含有8個(gè)以下碳原子的那些烷基。分析物一測(cè)定中在待檢測(cè)樣品中的物質(zhì)。一種以上具有對(duì)分析物的特異性結(jié)合親合力的物質(zhì)將被用于檢測(cè)分析物。該分析物可以是蛋白質(zhì)、肽、抗體、或半抗原，與這些分析物結(jié)合的抗體可以被制備。該分析物可以是核酸或低聚核苷酸，其可以被互補(bǔ)的核酸或低聚核苷酸結(jié)合。該分析物可以是任何其他可形成特異性結(jié)合配對(duì)成員的物質(zhì)。其他示例性的分析物類型包括藥物比如留族化合物、激素、蛋白質(zhì)、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、非監(jiān)管藥物、維生素、抗菌藥物、抗真菌藥物、抗病毒藥物、嘌呤、抗腫瘤藥試劑、安非他明、氮雜化合物、核苷酸、和前列腺素、以及所有這些藥物的代謝產(chǎn)物、殺蟲劑和殺蟲劑的代謝產(chǎn)物、以及受體。分析物還包括細(xì)胞、病毒、細(xì)菌和真菌?；罨瘎┮灰环N化合物，還可被認(rèn)為是標(biāo)記，其具有活化化學(xué)發(fā)光化合物的功能以使得在存在的條件下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。被活化劑標(biāo)記sbm或者活化劑特異性的結(jié)合成員共軛物--在測(cè)定混合物中的反應(yīng)物，該混合物至少包括連接構(gòu)造中的下述物質(zhì)a)用于分析物的特異性結(jié)合成員；和b) 具有活化化學(xué)發(fā)光化合物效果的活化劑化合物或標(biāo)記。
抗體包括全長(zhǎng)免疫球蛋白及天然或基因工程化的片段。芳烷基--用芳基取代的烷基。例子包括苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、和苯乙基。芳基一含有芳香環(huán)的基團(tuán)，該基團(tuán)含有1至5個(gè)碳環(huán)的芳香環(huán)，其可以用1個(gè)以上除H之外的取代基取代。生物材料一包括，例如全血、抗凝血的全血、血漿、血清、組織、動(dòng)植物細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)容物、病毒、以及真菌?；瘜W(xué)發(fā)光化合物一一種化合物，其還可以被稱為標(biāo)記，其可例如通過(guò)被轉(zhuǎn)化為另一種在電子激發(fā)態(tài)下形成的化合物而參與引起光輻射的反應(yīng)。該激發(fā)態(tài)可以是單線激態(tài)或三重激態(tài)。該激發(fā)態(tài)可以剛一衰減成基態(tài)就直接發(fā)光，或者可以將激發(fā)能傳遞至發(fā)射能受體，借此返回到基態(tài)。在該過(guò)程中，能量受體躍遷至激發(fā)態(tài)并發(fā)光。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的固定化sbm-在測(cè)定混合物中的反應(yīng)物，該混合物至少包括連接構(gòu)造中的下述物質(zhì)a)用于分析物的特異性結(jié)合成員；b)化學(xué)發(fā)光化合物或標(biāo)記；和c)固相。
連接一在此使用的該術(shù)語(yǔ)是指兩個(gè)以上化學(xué)物種或者支持材料被通過(guò)化學(xué)法連接，例如通過(guò)一個(gè)以上共價(jià)鍵，或者被動(dòng)地附著例如通過(guò)吸附、離子吸引，或者特異性結(jié)合過(guò)程比如親合性結(jié)合。當(dāng)這些物種或者材料彼此相連接時(shí)，能夠涉及一種以上連接類型。劑量反應(yīng)一信號(hào)比如測(cè)定反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光，其與樣品中分析物的含量相關(guān)。雜烷基一一種烷基，其上至少一個(gè)環(huán)或非末端鏈中的碳原子被選自N、0、或S的雜原子取代。雜芳基一一種芳基，其上1至3個(gè)的環(huán)中碳原子被選自N、0、或S的雜原子取代。 例舉的基團(tuán)包括批啶基、批咯基、噻吩基、呋喃基、喹啉基和吖啶基。樣品一在測(cè)定中含有或者懷疑含有待測(cè)分析物的混合物。分析物包括，例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、激素、抗體、藥物、和甾族化合物?？梢栽诒竟_(kāi)的方法中使用的典型樣品包括身體的液體，比如血液，其可以是當(dāng)收集血液標(biāo)本時(shí)通常見(jiàn)到的抗凝血的血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織提取液等等。其他類型的樣品包括溶劑、海水、工業(yè)用水樣品、食品樣品和環(huán)境樣品比如土壤或水、植物材料、真核生物、細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒、真菌、以及源于原核生物的細(xì)胞。sbp (特異性結(jié)合伴侶)一特異性結(jié)合配對(duì)成員或特異性結(jié)合伴侶是包括生物分子在內(nèi)的一種分子，具有針對(duì)另一種物質(zhì)(比如分析物)的特異性結(jié)合親合性。用于分析物的兩個(gè)特異性結(jié)合伴侶，最好是在分析物上具有不同的結(jié)合位點(diǎn)，可以稱為特異性結(jié)合配對(duì)。SSIA (Selective Signal Inhibiting Agent，選擇性信號(hào)抑制劑)一一種在本公開(kāi)的測(cè)定反應(yīng)混合物中提供的化合物，其使得非專一性信號(hào)或者背景信號(hào)與從測(cè)定反應(yīng)混合物的化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生反應(yīng)所產(chǎn)生的對(duì)分析物特異的信號(hào)相比會(huì)以更大量降低。固體支持物一一種大小至少為1微米的材料，具有一個(gè)其上能固定測(cè)定成分的表面。材料可以呈如下形式顆粒、微粒、納米顆粒、金屬膠體、纖維、紙張、珠子、膜片、濾紙及其他支撐物比如試管、微孔板、芯片、載玻片、和微陣列?？扇苄缘?、溶解性、增溶一一種物質(zhì)與另一種物質(zhì)均勻混合的能力或者趨勢(shì)。在本公開(kāi)中，溶解性和相關(guān)術(shù)語(yǔ)一般指的是固體在液體中的特性，例如在緩沖水溶液中的 SSIA。固體的可溶性是指它們?cè)谌軇?例如液體)中喪失它們的結(jié)晶形狀并變成呈分子狀態(tài)或呈離子狀態(tài)溶解或者分散、從而形成真溶液的程度。相反二相系統(tǒng)，其中一個(gè)相由分布在整個(gè)一體物質(zhì)內(nèi)的小顆粒(包括微粒或者膠體大小的顆粒)組成，不論是否被穩(wěn)定化以阻止沉淀、還是未被穩(wěn)定化。取代一是指基團(tuán)上至少一個(gè)氫原子被非氫基團(tuán)置換。應(yīng)該注意，關(guān)于被取代基團(tuán)，本文中指的是可以存在多個(gè)置換位點(diǎn)，除非另有明確說(shuō)明。反應(yīng)容器一一種容納樣品和其他根據(jù)本發(fā)明測(cè)定法的成分的容器或裝置。包括例如，不同大小和形狀的試管、微孔滴定板。
公開(kāi)本發(fā)明公開(kāi)提供了均相測(cè)定方法，特別是在分析物結(jié)合化學(xué)發(fā)光標(biāo)記特異性結(jié)合伴侶和活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶共軛物(conjugate)結(jié)合后，使用分析物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的均相測(cè)定方法。均相測(cè)定及其方法的進(jìn)行可以不需要使游離的特異性結(jié)合伴侶與復(fù)合體中已被結(jié)合的特異性結(jié)合伴侶相分離的步驟。本發(fā)明公開(kāi)提供了快速簡(jiǎn)單的均相測(cè)定法，其利用特異性結(jié)合配對(duì)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)物質(zhì)的存在、位置和含量。該測(cè)定要求使用在液相中的連接于第一個(gè)特異性結(jié)合伴侶的化學(xué)發(fā)光化合物(化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(的)sbp，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(的)特異性結(jié)合伴侶)、共軛于第二個(gè)特異性結(jié)合配體的活化劑化合物(活化劑標(biāo)記(的)特異性結(jié)合伴侶)、選擇性信號(hào)抑制劑(SSIA)、增強(qiáng)劑、以及引發(fā)劑溶液。與其他均相測(cè)定相比，本公開(kāi)的基本實(shí)施方式，包括活化劑標(biāo)記特異性結(jié)合伴侶和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記特異性結(jié)合伴侶在內(nèi)的所有反應(yīng)物皆可溶于水溶液。實(shí)際上，本發(fā)明的測(cè)定不需要或不使用固相。本測(cè)定方法與其他均相測(cè)定法不同的另一點(diǎn)是，不需要特殊化的構(gòu)造物一也就是設(shè)計(jì)成帶有可檢測(cè)成分的被標(biāo)記的特異性結(jié)合配對(duì)成員，該配對(duì)成員不被活化或者只有在與另一成分在一個(gè)復(fù)合體中結(jié)合后才能產(chǎn)生某種可檢測(cè)信號(hào)。與本發(fā)明公開(kāi)的測(cè)定系統(tǒng)相比，其他均相測(cè)定系統(tǒng)的制備是復(fù)雜、困難或昂貴的，因?yàn)槟切┓椒ㄐ枰@種特殊化的成分。而本發(fā)明的測(cè)定法提供了一種使測(cè)定設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)單、更靈活的方法，并更容易應(yīng)用于較寬范圍的分析物。不同于常規(guī)的異相或基于分離的測(cè)定方法，本發(fā)明的測(cè)定方法不采用分離步驟或工藝將游離的特異性結(jié)合伴侶與已結(jié)合在復(fù)合體中的特異性結(jié)合伴侶區(qū)分開(kāi)來(lái)。通過(guò)使用避免分離步驟的本測(cè)定方法，使得測(cè)定的控制簡(jiǎn)化了，測(cè)定時(shí)間得以縮短，自動(dòng)化變得更容易。在本發(fā)明公開(kāi)的測(cè)定方法中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和選擇性信號(hào)抑制劑(SSIA)被一同加入到含有樣品的水溶液中。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)可被特異性結(jié)合伴侶成員識(shí)別的分析物存在于樣品中時(shí)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶各自結(jié)合于分析物上的不同區(qū)域。產(chǎn)生與分析物相關(guān)的特異性信號(hào)，在剛一加入引發(fā)劑溶液就開(kāi)始檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供分析物的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記類似物比便應(yīng)用于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定模式中。分析物和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合于活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶。在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定的一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物和活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的復(fù)合體可以被預(yù)先形成，加入分析物以取代被標(biāo)記的類似物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物、分析物、活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶在未預(yù)先形成結(jié)合性復(fù)合體的情況下被混合一起。產(chǎn)生與分析物相關(guān)的特異性信號(hào)，在剛一加入引發(fā)劑溶液就開(kāi)始檢測(cè)。信號(hào)與測(cè)定模式中的分析物濃度逆向相關(guān)。作為特異性結(jié)合伴侶與分析物結(jié)合的結(jié)果，使活化劑與化學(xué)發(fā)光化合物呈可操作地接近，這樣活化劑可有效地地活化反應(yīng)，在剛一加入引發(fā)劑溶液時(shí)就產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?；罨瘎┡c化學(xué)發(fā)光化合物的反應(yīng)可活化或改變化學(xué)發(fā)光化合物，使得用引發(fā)劑溶液處理導(dǎo)致進(jìn)一步生成光的反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“可操作地接近”是指，化學(xué)發(fā)光化合物和活化劑足夠接近，包括并且直至物理接觸，這樣它們能夠進(jìn)行反應(yīng)。相對(duì)于檢測(cè)分析物濃度所需的量，可以向系統(tǒng)中提供過(guò)量的活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和/或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶。在加入引發(fā)劑溶液和檢測(cè)之前不除去多余的未結(jié)合的活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、未結(jié)合的化學(xué)發(fā)光共軛物，因?yàn)樗鼈兊拇嬖诤蜏y(cè)定系統(tǒng)中固相的缺乏并不會(huì)抑制化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)與分析物的量之間精確地建立關(guān)聯(lián)。因?yàn)槲唇Y(jié)合的被標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶能夠經(jīng)受相同的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)反應(yīng)，并且反應(yīng)物不與固相連接(沒(méi)有有用的相關(guān)性，即使最好的情況)，所以信號(hào)與反應(yīng)物的相關(guān)性也非常有限，這是期望的。按照經(jīng)驗(yàn)，這個(gè)特點(diǎn)通常將導(dǎo)致測(cè)定失敗。令人驚訝的是，這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)在這本發(fā)明的方法中使用選擇性信號(hào)抑制劑而被克服。在本方法中，溶液中不與固相連接的反應(yīng)物、未被去除的多余活化劑的存在、多余化學(xué)發(fā)光化合物的存在并不喪失進(jìn)行靈敏的、特異性的、分析物濃度依賴性的結(jié)合測(cè)定的能力。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是不可預(yù)知的或預(yù)料不到的。特別是當(dāng)活化劑是催化劑比如酶時(shí)(當(dāng)分子在溶液中游離反應(yīng)時(shí)，酶通常每秒可以誘導(dǎo)數(shù)百數(shù)千倍的反應(yīng))，預(yù)料不到的是已被結(jié)合的活化劑可以有效地區(qū)別排除于游離的活化劑反應(yīng)，以便在整個(gè)較寬的分析物濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生劑量反應(yīng)信號(hào)。而且，發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，極好的區(qū)別性源于特定的SSIA化合物的加入。通過(guò)使用SSIA，在化學(xué)發(fā)光標(biāo)記與活化劑標(biāo)記(兩者通過(guò)被標(biāo)記的特異性結(jié)合配對(duì)成員與分析物的復(fù)合體而呈反應(yīng)構(gòu)型)之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)與來(lái)自存在的(但并不存在于該復(fù)合體中)標(biāo)記物的信號(hào)的比率被戲劇化地提高。參考示意

圖1，可以理解SSIA在改進(jìn)的測(cè)定靈敏度中的功能。游離(未與分析物結(jié)合)的和被復(fù)合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(的)特異性結(jié)合伴侶(CLsbp)與活化劑標(biāo)記(的)特異性結(jié)合配對(duì)(ALsbp)有多種不同的組合方式，當(dāng)加入引發(fā)劑溶液時(shí)，這些方式都可能對(duì)所觀察的化學(xué)發(fā)光信號(hào)有貢獻(xiàn)。四種建議的反應(yīng)圖列于如下
1被結(jié)合的ALsbp+被結(jié)合的CLsbp —特異性信號(hào) 2被結(jié)合的ALsbp+游離的CLsbp —非特異性信號(hào) 3游離的ALsbp+被結(jié)合的CLsbp —非特異性信號(hào) 4游離的ALsbp+游離的CLsbp —非特異性信號(hào)如上所示，四種不同類型的化學(xué)發(fā)光化合物與活化劑的配對(duì)能在混合反應(yīng)中反應(yīng)；但只有第一種類型產(chǎn)生了與測(cè)定中分析物的含量相關(guān)的信號(hào)。SSIA取得了令人驚訝的作用，相對(duì)于1反應(yīng)所產(chǎn)生信號(hào)，它選擇性地抑制2-4反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)量。在一些實(shí)施方式中，四種反應(yīng)都會(huì)減弱，但2-4反應(yīng)的信號(hào)相應(yīng)地減少更多，即SSIA取得了同樣的作用。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供了通過(guò)分析物與用于分析物的特異性結(jié)合伴侶之間的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)分析所樣品中所關(guān)注的分析物的方法，其中，一個(gè)特異性結(jié)合伴侶被用活化劑化合物標(biāo)記，該活化劑可以催化劑比如酶、尤其是過(guò)氧化氫酶。另一個(gè)用于分析物的特異性結(jié)合伴侶被化學(xué)發(fā)光化合物標(biāo)記。標(biāo)記的Sbp與分析物的結(jié)合生成帶標(biāo)記的復(fù)合體?；瘜W(xué)發(fā)光化合物經(jīng)受被活化劑誘導(dǎo)的在加入引發(fā)劑溶液后引起的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光的結(jié)果與樣品中分析物的含量有關(guān)。特異性結(jié)合配對(duì)反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)由所有溶解在溶液中的成分完成，典型的溶液是水溶液。顯著地，提供的被標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的含量相對(duì)于樣品中分析物的量是過(guò)量的，從而使得不是所有的標(biāo)記Sbp都與分析物生成復(fù)合體。即使多余的標(biāo)記Sbp能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，但并不從反應(yīng)溶液中去除。未在復(fù)合體中、 也未被按常規(guī)除去的標(biāo)記Sbp的反應(yīng)性會(huì)阻止這種均相測(cè)定的進(jìn)行，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生不可接受的高信號(hào)，這種高信號(hào)不是由于存在分析物介導(dǎo)的復(fù)合體形成而產(chǎn)生的。在許多情況下，這種如此多的“背景”信號(hào)的產(chǎn)生使得無(wú)法得到有用的劑量反應(yīng)關(guān)系。為了能夠進(jìn)行均相的非分離式測(cè)定，當(dāng)所有為化學(xué)信號(hào)產(chǎn)生所必需的反應(yīng)成分呈結(jié)合性復(fù)合物形式和游離或未結(jié)合形式這兩種形式存在時(shí)，必須提供除物理分離之外的某種手段來(lái)區(qū)分已被結(jié)合的和未被結(jié)合的標(biāo)記sbp。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)期被追求的溶液，提供了所有成分都在溶液中的測(cè)定方法，不進(jìn)行分離。不同于已知的均相測(cè)定方法，本方法不需要或不使用特別設(shè)計(jì)的標(biāo)記結(jié)合伴侶，這些結(jié)合性伴侶能夠不經(jīng)受產(chǎn)生信號(hào)的反應(yīng)，除非它們被帶入在結(jié)合性復(fù)合體中。在發(fā)明實(shí)施的測(cè)定方法中，被結(jié)合于具有分析物的復(fù)合體中的標(biāo)記sbp成員與游離的標(biāo)記Sbp成員的必要區(qū)分是通過(guò)向反應(yīng)溶液中提供選擇性信號(hào)抑制劑(SSIA)而實(shí)現(xiàn)的。向反應(yīng)溶液中加入有效量的SSIA可導(dǎo)致來(lái)自已結(jié)合的標(biāo)記sbp成員的信號(hào)超過(guò)包括來(lái)自任何未結(jié)合的標(biāo)記sbp成員的信號(hào)在內(nèi)的背景信號(hào)，相比未使用SSIA的情況超過(guò)程度極其明顯。當(dāng)信號(hào)對(duì)背景關(guān)系的這一改進(jìn)被實(shí)現(xiàn)時(shí)，測(cè)定的效用得以增強(qiáng)，包括更高程度的檢測(cè)靈敏度。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供的測(cè)定方法尤其是特異性測(cè)定方法中，由于分析物的存在，使得化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的sbp和活化劑標(biāo)記的sbp經(jīng)由至少一個(gè)特異性結(jié)合反應(yīng)而得以可操作地接近，其中已結(jié)合的活化劑標(biāo)記的sbp可激活一旦加入引發(fā)劑溶液就產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)，該反應(yīng)用以檢測(cè)分析物的存在、位置和量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的測(cè)定方法還與傳統(tǒng)測(cè)定方法不同的是，不去除存在的未結(jié)合的活化劑標(biāo)記的sbp，這些未結(jié)合的活化劑標(biāo)記的Sbp在測(cè)定中相對(duì)于與分析物特異結(jié)合的量大量剩余，不要求洗滌或分離多余的未結(jié)合的活化劑標(biāo)記的sbp。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法也不用除去相對(duì)于與分析物特異結(jié)合的量有剩余的未結(jié)合的化學(xué)發(fā)光共軛物，不需要洗滌或分離未結(jié)合的化學(xué)發(fā)光共軛物的步驟。測(cè)定組成，即含有分析物的樣品、活化劑標(biāo)記的sbp，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的sbp，選擇性信號(hào)抑制劑及引發(fā)劑溶液可以被陸續(xù)加入試管，不需要洗滌或分離，并且讀取發(fā)光。除了最后加入的引發(fā)劑溶液之外的測(cè)定組成可以以任何次序或組合加入試管中。在一個(gè)實(shí)施方式中，在注入引發(fā)劑溶液前，樣品和活化劑標(biāo)記Sbp可以被預(yù)先混合并加入含有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記Sbp的試管中。使用化學(xué)發(fā)光底物和酶標(biāo)記的結(jié)合物的常規(guī)測(cè)定法要提供大大過(guò)量于標(biāo)簽酶的量的化學(xué)發(fā)光底物。通常，底物/酶的摩爾比率可以超過(guò)十的九次冪，即，過(guò)量十億倍。據(jù)相信，在常規(guī)的測(cè)定中有必要供應(yīng)這樣極大過(guò)量的化學(xué)發(fā)光化合物，以便確保充分的底物供應(yīng)，用于連續(xù)的酶法轉(zhuǎn)化，并且該過(guò)程確保在測(cè)定中足夠的檢測(cè)靈敏度。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，有可能設(shè)計(jì)出高靈敏度的測(cè)定方法，其將化學(xué)發(fā)光化合物對(duì)活化劑的比率減小了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 就這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，在此描述的這些方法本質(zhì)上不同于已知的酶聯(lián)測(cè)定方法。通過(guò)省去如上所述和如下所述示例性測(cè)定法顯示的洗滌和分離步驟，提供了使測(cè)定方案設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單化的機(jī)會(huì)。操作步驟數(shù)量的減少可以降低測(cè)定次數(shù)、由不完全的洗滌帶來(lái)的內(nèi)測(cè)定變化性、以及成本。同時(shí)，增強(qiáng)了自動(dòng)化和小型化測(cè)定性能的能力，具有自動(dòng)化和小型化伴隨的所有固有優(yōu)點(diǎn)。按本發(fā)明方法進(jìn)行的測(cè)定法包括提供特異性結(jié)合伴侶(sbp)來(lái)特異性地結(jié)合或捕捉所關(guān)注的分析物。特異性結(jié)合伴侶能直接或間接地結(jié)合待檢測(cè)的分析物。隨后進(jìn)一步向特異性結(jié)合伴侶提供直接或間接地附著于其上的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記可以由如下所詳述的不同途徑得到。各個(gè)情況下，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記穩(wěn)定地、或不可逆地被直接或間接地以可維持“化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp”水溶性的方式與特異性結(jié)合伴侶相連接。術(shù)語(yǔ)“不可逆地”是指在待進(jìn)行的測(cè)定中的使用條件下，基本上不從化學(xué)發(fā)光標(biāo)記Sbp中除去化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。倘若在使用條件下標(biāo)記被穩(wěn)定附著、且仍保持在化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp上，則被動(dòng)或非共價(jià)附著也是可以考慮的。該測(cè)定法進(jìn)一步包括提供具有分析物的活化劑標(biāo)記sbp和與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp連接的用于分析物的特異性結(jié)合伴侶，并且允許這些組成形成特異性結(jié)合復(fù)合體。樣品、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp、催化劑標(biāo)記Sbp可以被以任意次序分別加入、或者以組合形式陸續(xù)或同時(shí)加入，也可以提前混合作為組合物加入。分析物與標(biāo)記的Sbp成員的結(jié)合一般要求一段時(shí)間。 在一些實(shí)施方式中，可以如此進(jìn)行為使結(jié)合反應(yīng)發(fā)生，結(jié)合成分經(jīng)可選的延遲時(shí)間被陸續(xù)加入。當(dāng)結(jié)合性復(fù)合體形成后，加入引發(fā)劑溶液以產(chǎn)生用來(lái)檢測(cè)分析物的化學(xué)發(fā)光，并且檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。典型地，光強(qiáng)度水平的峰值或光強(qiáng)度以固定的時(shí)間間隔積分，或測(cè)量所有積分的光強(qiáng)度。所產(chǎn)生光的量與反應(yīng)試管中樣品含有的分析物的量相關(guān)。通過(guò)按通常已知方法建立校準(zhǔn)曲線，光的量可以被用來(lái)確定反應(yīng)物的數(shù)量。當(dāng)光的發(fā)射在繼引發(fā)劑溶液加入后迅速發(fā)生時(shí)，期望的是，或者用機(jī)械方法測(cè)量開(kāi)始用合適的注射器添加的時(shí)間、或者用已經(jīng)置于檢測(cè)中的反應(yīng)試管進(jìn)行添加步驟。反應(yīng)物的適宜量、容積、稀釋度、特異性結(jié)合配對(duì)反應(yīng)的溫育時(shí)間、反應(yīng)物濃度等，可以由常規(guī)測(cè)定法事先確定，參考進(jìn)行特異性結(jié)合測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)論述，之后詳述的實(shí)施例可以作為指南。本測(cè)定和方法中所用sbp成員的濃度和含量將取決于如下這些因素分析物濃度、所期望的結(jié)合速度/測(cè)定時(shí)間、共軛物的成本和可用性、Sbp成員的非特異性結(jié)合度等。 通常Sbp成員以至少等于最低的預(yù)期分析物的濃度存在，更常見(jiàn)的是，以等于至少最高的期望的分析物濃度存在。并且，對(duì)于非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，濃度可以是分析物最高濃度的10倍到 IO6倍。通常sbp成員的濃度小于10_4M，更多的情況是小于10_6M，經(jīng)常是在10_"到1(ΓΜ之間。與sbp成員連接的活化劑或化學(xué)發(fā)光化合物的含量通常是至少1個(gè)分子/每sbp成員，可以高到IO2或更高。在許多實(shí)施方式中，與sbp成員連接的活化劑或化學(xué)發(fā)光化合物的量是1-20個(gè)分子。例舉的活化劑對(duì)化學(xué)發(fā)光化合物的比率被提供于工作實(shí)施例中。
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(的)sbp本方法需要使用與第一個(gè)特異性結(jié)合伴侶相連接的化學(xué)發(fā)光化合物(化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp)，在本發(fā)明公開(kāi)的測(cè)定和方法中，化學(xué)標(biāo)記sbp可溶于水溶液。在本公開(kāi)的測(cè)定和方法中，不同于在其他親合性測(cè)定和方法中看到的那樣，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物未被固定在諸如微粒、多孔板膜片、濾紙、試管、試紙、移液吸頭等固體表面?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物和特異性結(jié)合配對(duì)中的一個(gè)成員。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括一個(gè)以上化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括特異性結(jié)合配對(duì)中一個(gè)成員的一個(gè)以上拷貝。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物直接與特異性結(jié)合配對(duì)中一個(gè)成員的一個(gè)以上拷貝連接。在另一些實(shí)施方式中，一個(gè)以上化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物被直接地連接于特異性結(jié)合配對(duì)中一個(gè)成員的一個(gè)拷貝。直接連接，也稱為直接標(biāo)記，包括共價(jià)結(jié)合作用、離子結(jié)合作用、以及疏水作用。在一種實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記與分析物特異性結(jié)合伴侶共價(jià)連接。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物被間接地連接于特異性結(jié)合配對(duì)中一個(gè)成員的一個(gè)以上拷貝。在另一些實(shí)施方式中，一個(gè)以上化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物被間接地連接于特異性結(jié)合配對(duì)中一個(gè)成員的一個(gè)拷貝。間接連接除化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物和特異性結(jié)合配對(duì)成員之外還可包括一種或多種輔助物。輔助物可溶于水溶液，含有一種以上輔助物的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp可溶于水溶液。在不同的實(shí)施方式中，輔助物包括可溶性蛋白質(zhì)(例如鏈霉親合素、親合素、中性親合素、生物素、陽(yáng)離子化牛血清白蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片斷或部分)、可溶性的合成樹(shù)狀聚體(如PAMAM)、可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶性的天然聚合物(如功能化的右旋糖苷、氨基右旋糖苷的多糖、低聚核苷酸、蛋白質(zhì)、及其組合物)、脂質(zhì)體、膠束、泡囊、及一種以上可溶合成聚合物、 可溶天然聚合物和可溶性蛋白質(zhì)的組合物(如免疫球蛋白G/生物素/鏈霉親合素/PAA)。 其他可溶于水溶液、并能使一個(gè)以上化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物sbp附著的輔助物，預(yù)想可以應(yīng)用在本發(fā)明和方法中。在一些的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物是蛋白質(zhì)或肽。例舉的可溶蛋白質(zhì)包括白蛋白、親合素、鏈霉親合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jun蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白 “KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它們的任意組合物。在一種實(shí)施方式中，輔助物是通用抗體比如IgG，其中化學(xué)發(fā)光標(biāo)記與通用抗體通過(guò)可維持分析物特異性捕捉抗體的結(jié)合親合力的方式共價(jià)連接。在另一個(gè)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光化合物經(jīng)由生物素-鏈霉親合素或生物素-中性親合素的結(jié)合而連接一個(gè)以上sbp。當(dāng)化學(xué)發(fā)光化合物處于鏈霉親合素共軛時(shí)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp與鏈霉親合素-生物素的結(jié)合或相當(dāng)?shù)倪B接例如可以使特異性結(jié)合伴侶成為一個(gè)生物素共軛物。生物素-鏈霉親合素的選擇性排列(arrangement)及類似的連接已為人所知。作為選擇，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp與鏈霉親合素-生物素的結(jié)合或相當(dāng)?shù)倪B接可以利用用于sbp或化學(xué)發(fā)光化合物與一個(gè)以上附加的輔助物之間附著的連接。在另一種實(shí)施方式中，與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物質(zhì)是合成聚合物。。使用聚合物輔助物用于連接化學(xué)發(fā)光化合物的測(cè)定形式能夠通過(guò)共價(jià)鍵比如生物素-親合素共軛物而連接于分析物特異性結(jié)合伴侶，，或者通過(guò)使用通用捕捉成分比如種類特異性免疫球蛋白的間接附著來(lái)連接。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括輔助物，該輔助物選自多糖或可溶性自組裝(self-assembling)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些實(shí)施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有IOkDa到500kDa的平均分子量。在另外一些實(shí)施方式中，有25 150kDa的平均分子量。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括平均分子量為50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp包括平均分子量為70kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。
在許多實(shí)施方式中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp的平均直徑在5nM到SOOnM的區(qū)間內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含可溶性蛋白質(zhì)、或其他可溶性自然或合成聚合物、或它們的組合物，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記sbp的平均直徑在200nM到600nM的區(qū)間內(nèi)；在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在300nM 到500nM的區(qū)間內(nèi)。
活化劑標(biāo)記(的)sbp
本發(fā)明的方法要求使用連接于第一個(gè)特異性結(jié)合伴侶的活化劑化合物(活化劑標(biāo)記sbp) ο在本發(fā)明公開(kāi)的測(cè)定和方法中，活化劑標(biāo)記的sbp可溶于水溶液。在本公開(kāi)的測(cè)定和方法中，不同于在其他親合性測(cè)定和方法中看到的那樣，活化劑化合物不固定在諸如微粒、多微孔板、膜片、濾紙、試管、試紙、移液吸頭等固體表面。活化劑標(biāo)記sbp包括一個(gè)活化劑標(biāo)記化合物和一個(gè)特異性結(jié)合配對(duì)。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)活化劑標(biāo)記sbp中含有一個(gè)以上活化劑化合物。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)活化劑標(biāo)記sbp中含有一個(gè)以上特異性結(jié)合配對(duì)成員的拷貝。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)活化劑化合物直接連接一個(gè)以上特異性結(jié)合配對(duì)的拷貝。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)以上活化劑標(biāo)記化合物直接連接一個(gè)特異性結(jié)合配對(duì)成員的拷貝。直接連接，也稱為直接標(biāo)記，包括共價(jià)結(jié)合作用，離子結(jié)合作用，疏水作用。在一種實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記與分析物特異性結(jié)合伴侶共價(jià)連接
在一些實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記化合物間接連接一個(gè)以上特異性結(jié)合配對(duì)成員的拷貝。在另一些實(shí)施方式中，一個(gè)以上活化劑標(biāo)記化合物間接連接特異性結(jié)合配對(duì)成員的一個(gè)拷貝。間接連接在活化劑標(biāo)記化合物和特異性結(jié)合配對(duì)成員之外包括輔助物。輔助物通?？扇苡谒芤骸：幸粋€(gè)以上輔助物的活化劑標(biāo)記sbp可溶于水溶液。在不同的實(shí)施方式中，輔助物包括可溶性蛋白質(zhì)，例如鏈霉親合素，親合素，中性親合素，生物素，陽(yáng)離子化BSA，fos蛋白，jim蛋白，匙孔血藍(lán)蛋白〃 KLH"，合成或天然的免疫球蛋白及其片斷或部分，可溶的合成樹(shù)狀聚體(如PAMAM)，可溶的合成聚合物(如聚丙烯酸“PAA”)，可溶的天然聚合物，如功能化右旋糖苷，氨基右旋糖苷的多糖，低聚核苷酸，蛋白質(zhì)，及其組合物，脂質(zhì)體，膠束，泡囊，及一個(gè)以上可溶合成聚合物，可溶天然聚合物和可溶性蛋白質(zhì)的組合物(如免疫球蛋白G/生物素/鏈霉親合素/PAA)。其他可溶于水溶液并能使一個(gè)以上化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物，特異性結(jié)合伴侶附著的輔助物，預(yù)想可以應(yīng)用在本發(fā)明和方法中。在一些的實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物是蛋白質(zhì)或肽。例舉的可溶蛋白質(zhì)包括白蛋白、親合素、鏈霉親合素、α螺旋蛋白、fos蛋白、jim蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白“KLH”、合成或天然的免疫球蛋白及其片段或部分、及它們的任意組合物。在一種實(shí)施方式中，輔助物是通用抗體比如IgG，其中活化劑標(biāo)記與通用抗體通過(guò)可維持分析物特異性捕捉抗體的結(jié)合親合力的方式共價(jià)連接。在另一個(gè)活化劑標(biāo)記sbp實(shí)施方式中，活化劑經(jīng)由生物素-鏈霉親合素或生物素-中性親合素的結(jié)合而連接一個(gè)以上sbp。當(dāng)活化劑處于鏈霉親合素共軛時(shí)，活化劑標(biāo)記sbp與鏈霉親合素-生物素的結(jié)合或相當(dāng)?shù)倪B接例活化劑如可以使特異性結(jié)合伴侶成為一個(gè)生物素共軛物。生物素-鏈霉親合素的選擇性排列 (arrangement)及類似的連接已為人所知。作為選擇，活化劑標(biāo)記sbp與鏈霉親合素-生物素的結(jié)合或相當(dāng)?shù)倪B接可以利用用于sbp或活化劑與一個(gè)以上附加的輔助物之間附著的連接。在另一種實(shí)施方式中，與活化劑標(biāo)記共價(jià)連接的輔助物質(zhì)是合成聚合物。。使用聚合物輔助物用于連接活化劑化合物的測(cè)定形式能夠通過(guò)共價(jià)鍵比如生物素-親合素共軛物而連接于分析物特異性結(jié)合伴侶，，或者通過(guò)使用通用捕捉成分比如種類特異性免疫球蛋白的間接附著來(lái)連接。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記sbp包括輔助物，該輔助物選自多糖或可溶性自組裝(self-assembling)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記sbp包括多糖，比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在一些實(shí)施方式中，多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷有 IOkDa到500kDa的平均分子量。在另外一些實(shí)施方式中，有25 150kDa的平均分子量。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記sbp包括平均分子量為50-100kDa的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記sbp包括平均分子量為70kDa 的多糖比如氨基右旋糖苷、羧基右旋糖苷。平均分子量在70kDa。
在大部分實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記sbp的平均直徑在200kDa到3000kDa的范圍內(nèi)。在一些的實(shí)施方式中，活化劑標(biāo)記sbp的平均分子量在350kDa到1500kDa。 活化劑標(biāo)記活化劑化合物形成了被活化劑標(biāo)記的sbp的一部分，其還可以被認(rèn)為是活化劑特異性結(jié)合成員共軛物。被活化劑標(biāo)記的Sbp具有雙重作用1)在測(cè)定中，通過(guò)特異性結(jié)合伴侶部分直接地或者通過(guò)中間的特異性結(jié)合伴侶而特異性地經(jīng)受與分析物含量成比例的特異性結(jié)合反應(yīng)，和2~)通過(guò)活化劑部分激活化學(xué)發(fā)光化合物。被活化劑標(biāo)記的sbp的活化劑部分是具有活化化學(xué)發(fā)光化合物的效果的化合物，使得當(dāng)存在引發(fā)劑溶液時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。能夠用作活化劑標(biāo)記的化合物包括具有過(guò)氧化物酶類活性的含有過(guò)渡金屬鹽和復(fù)合物以及酶的化合物，尤其是含有過(guò)渡金屬的酶，更尤其是過(guò)氧化物酶。在活化劑化合物中有用的過(guò)渡金屬包括周期表中第3-12族的那些過(guò)渡金屬，尤其是鐵、銅、鈷、鋅、錳、鉻、以及釩。可以經(jīng)受化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的過(guò)氧化物酶包括，例如乳過(guò)氧化物酶、微小過(guò)氧化物酶、髓過(guò)氧化物酶、商素過(guò)氧化物酶、釩溴過(guò)氧化物酶、辣根過(guò)氧化物酶、真菌的過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和來(lái)源于Arthromyces ramosus的過(guò)氧化物酶、以及在白腐真菌中產(chǎn)生的Mn依賴性過(guò)氧化物酶、以及大豆過(guò)氧化物酶。其他已知并不是酶、但是具有過(guò)氧化物酶狀活性的仿過(guò)氧化物酶的化合物包括鐵復(fù)合物，比如亞鐵原卟啉、以及 Mn-TPPS4 (Y. -X. Ci, et al. , Mikrochem. J. ,52 :257-62 (1995))。上述這些物質(zhì)可催化底物的化學(xué)發(fā)光氧化，并且應(yīng)明確地認(rèn)為包含于在此使用的過(guò)氧化物酶含義的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，在用于產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法中，被活化劑標(biāo)記的sbp可以包括過(guò)氧化物酶和生物分子的共軛物或復(fù)合物，唯一的附帶條件是該共軛物可顯示出過(guò)氧化物酶活性或過(guò)氧化物酶狀活性。可以結(jié)合于一種以上過(guò)氧化物酶分子的生物分子包括 DNA、RNA、低聚核苷酸、抗體、抗體片段、抗體-DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質(zhì)、肽、凝集素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和生物素。還可以在本發(fā)明公開(kāi)的方法中使用包含或者結(jié)合過(guò)氧化物酶的復(fù)合物，比如脂質(zhì)體、膠束、泡囊和因連接生物分子而具功能化的聚合物。
選擇性信號(hào)抑制劑(SSIA)本發(fā)明的選擇性信號(hào)抑制劑是這樣的化合物當(dāng)其被包括在包含游離的和/或被分析物結(jié)合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的sbp、游離的和/或被分析物結(jié)合的被活化劑標(biāo)記的sbp、增強(qiáng)劑和引發(fā)劑溶液的測(cè)定反應(yīng)混合物中時(shí)，從被分析物結(jié)合的標(biāo)記Sbp成員得到的信號(hào)超過(guò)背景信號(hào)的程度顯著地大于沒(méi)有SSIA時(shí)發(fā)生的超出程度。反應(yīng)方法中存在的一種以上選擇性信號(hào)抑制劑的濃度在10_6M和IO4M之間、常常在lO—M和IOl之間、經(jīng)常在IOl和之間、有時(shí)在IOl和IO4M之間。在一些實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的反應(yīng)中選擇性信號(hào)抑制劑存在的濃度在和切10_%之間。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的反應(yīng)中選擇性信號(hào)抑制劑存在的濃度在 5x1 (T5M 禾口 5x104M 之間。選擇性信號(hào)抑制劑能夠被作為單獨(dú)的試劑或者濃度比在待進(jìn)入的反應(yīng)溶液中更高的溶液提供。本實(shí)施方式中，實(shí)測(cè)量的工作溶液被定量加入反應(yīng)溶液中，以達(dá)到期望的反應(yīng)濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，選擇性信號(hào)抑制劑被合并進(jìn)入含有一種或多種被標(biāo)記的sbp 成員的溶液中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，選擇性信號(hào)抑制劑被作為引發(fā)劑溶液的組分提供。選擇性信號(hào)抑制劑提高信噪比的程度將依據(jù)化合物的一致性和使用時(shí)的濃度、連同其它因素而改變。該程度能夠被作為提高倍數(shù)的術(shù)語(yǔ)，其中該倍數(shù)為在特定的分析物濃度下通過(guò)使用選擇性信號(hào)抑制劑而進(jìn)行的測(cè)定中的信噪比與在相同的分析物濃度下在不含選擇性信號(hào)抑制劑情況下進(jìn)行的測(cè)定中的信噪比相比較的倍數(shù)。提高倍數(shù)> 1是改進(jìn)的測(cè)定方法的量規(guī)和選擇性信號(hào)抑制劑的有益效果的證據(jù)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可取得至少2比如至少5、并包括至少10、或至少50的提高倍數(shù)。參照下述實(shí)施例，將可看到，提高倍數(shù)能夠在測(cè)定范圍內(nèi)作為分析物濃度的函數(shù)而改變。例如，提高倍數(shù)可以隨著分析物濃度增加而提高。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提高倍數(shù)隨濃度的變化可以導(dǎo)致較為線性的校準(zhǔn)曲線，即化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)分析物濃度的曲線。下面的表中列出了，但不限于，能夠有效地具有選擇性信號(hào)抑制劑功能的化合物。 利用本發(fā)明的公開(kāi)教導(dǎo)，包括測(cè)定法的常規(guī)應(yīng)用和在實(shí)施例中描述的篩選試驗(yàn)方法，能夠找到未明確敘述的另外的化合物。
表1.選擇性信號(hào)抑制劑
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定樣品中分析物的方法，該測(cè)定方法包括通過(guò)以任何次序或同時(shí)加入下列物質(zhì)，在水溶液中形成反應(yīng)混合物樣品，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶，活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶，和選擇性信號(hào)抑制劑，其中所有成分皆可溶于水溶液，其中所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和所述活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶可與樣品中的分析物相結(jié)合，形成結(jié)合性復(fù)合體。在反應(yīng)混合物中加入引發(fā)劑溶液，其中引發(fā)劑溶液可釋放出一種可檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，該信號(hào)與反應(yīng)混合物中與分析物結(jié)合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶及活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶的量相關(guān)。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定樣品中分析物的方法，其特征在于，以任何次序或同時(shí)加入從而形成反應(yīng)混合物的物質(zhì)進(jìn)一步包括增強(qiáng)劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述選擇性信號(hào)抑制劑可引起，在具有分析物的復(fù)合體中化學(xué)發(fā)光標(biāo)記與活化劑標(biāo)記之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)比率，超過(guò)不在這樣的復(fù)合體中時(shí)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記與活化劑標(biāo)記之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的信號(hào)比率。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述選擇性信號(hào)抑制劑選自下組在鄰位或?qū)ξ挥兄辽賰蓚€(gè)羥基的芳香化合物，在鄰位或?qū)ξ挥兄辽僖粋€(gè)羥基和一個(gè)氨基的芳香化合物，在C-C雙鍵上有至少兩個(gè)取代的羥基的化合物，以及氮雜環(huán)化合物。
5.如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述選擇性信號(hào)抑制劑選自下組抗壞血酸，異抗壞血酸，Trolox, L-抗壞血酸6-棕櫚酸酯，5,6-異亞丙基-L-抗壞血酸，BHT,谷胱甘肽，尿酸，生育酚，兒茶酚。
6.如權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包含直接或間接地連接于特異性結(jié)合配對(duì)成員的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物，其中所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記選自下組芳香環(huán)二酰基胼，三羥基芳香化合物，9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫代縮醛化合物，9，10- 二氫化吖啶酯，9，10- 二氫化吖啶硫酯，9，10- 二氫化吖啶磺胺，9， 10- 二氫化吖啶硫醇衍生物，以及下述化學(xué)式VI所示的化合物，其中R1選自烷基，鏈烯基，炔基，具有1到20個(gè)碳原子的芳烷基，其中任意一個(gè)碳可以被選自下組的1-3個(gè)基團(tuán)取代羰基，羧基，三(C1-C8烷基)甲硅烷基，SO3-基團(tuán)，0S03_2 基團(tuán)，糖基，PO3-基團(tuán)，OPCV2基團(tuán)，鹵素原子，羥基，硫醇基，氨基，季銨基，或季鱗基；X選自 C1-C8烷基，芳基，芳烷基，具有1-20個(gè)碳原子的烷基或芳基羧基，三(C1-C8燒基)甲硅烷基， SO3-基團(tuán)，糖基，三烷基甲硅烷基，堿金屬陽(yáng)離子，堿土金屬陽(yáng)離子，銨基，三烷基鱗陽(yáng)離子和由式P0(0R' ) (OR")所示的磷?；渲蠷'和R〃獨(dú)立地選自=C1-C8烷基，氰烷基，芳基和芳烷基；Z1和Z2分別選自0或S原子；R2和R3獨(dú)立地選自氫和C1-C8烷基。
7.如權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的固定化特異性結(jié)合成員包含直接或間接地連接于特異性結(jié)合成員的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物，其中所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記是下式所示的化合物，
8.如權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包含直接或間接連接于特異性結(jié)合配對(duì)成員的活化劑標(biāo)記，其中活化劑標(biāo)記選自下組過(guò)渡金屬鹽，過(guò)渡金屬絡(luò)合物和酶，所述活化劑標(biāo)記具有過(guò)氧化物酶活性。
9.如權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述活化劑標(biāo)記化合物是過(guò)氧化物酶。
10.如權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)伴侶中的至少一個(gè)包含選自下組的輔助物質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)，鏈霉親合素，親合素，中性親合素，生物素，陽(yáng)離子化牛血清白蛋白，fos蛋白，jim蛋白，可溶性合成樹(shù)狀聚合物，可溶性合成聚合物，可溶性天然聚合物，多糖，右旋糖苷，寡核苷酸，脂質(zhì)體，膠束，以及泡囊。
11.如權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，增強(qiáng)劑是促進(jìn)具有過(guò)氧化物酶活性的活化劑的催化周轉(zhuǎn)的一種化合物或多種化合物的混合物。
12.如權(quán)利要求11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述增強(qiáng)劑選自下組酚類化合物，芳族胺，苯丙唑，羥基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它們的混合物。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法中，其特征在于，所述引發(fā)劑溶液包含過(guò)氧化物化合物。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法中，其特征在于，所述引發(fā)劑溶液包含選自下組的增強(qiáng)劑酚類化合物，芳族胺，苯丙唑，羥基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它們的混合物。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法中，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶和活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶分別與樣品中的分析物結(jié)合。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶包括連接于分析物類似物的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，并且所述分析物和所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的類似物競(jìng)相與活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶結(jié)合。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所有成分皆可溶于水溶液。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，沒(méi)有成分直接或間接地共軛于微?；蚱渌滔?。
19.一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，其包括分析物的第一個(gè)特異性結(jié)合伴侶，共軛于所述第一個(gè)特異性結(jié)合伴侶的化學(xué)發(fā)光化合物，分析物的第二個(gè)特異性結(jié)合伴侶，和共軛于所述第二個(gè)特異性結(jié)合伴侶的活化劑化合物，選擇性信號(hào)抑制劑，以及引發(fā)劑溶液。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒中，其特征在于，所有的成分皆可溶于水溶液。
21.如權(quán)利要求19-20中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，沒(méi)有成分直接或間接地共軛于微粒或其他固相。
22.如權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述選擇性信號(hào)抑制劑選自下組在鄰位或?qū)ξ挥兄辽賰蓚€(gè)羥基的芳香化合物，在鄰位或?qū)ξ挥兄辽僖粋€(gè)羥基和一個(gè)氨基的芳香化合物，在C-C雙鍵上至少有兩個(gè)取代的羥基的化合物，以及氮雜環(huán)化合物。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光化合物選自下組芳香環(huán)二?；荩u基芳香化合物，9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫代縮醛化合物， 9，10- 二氫化吖啶酯，9，10- 二氫化吖啶硫酯，9，10- 二氫化吖啶磺胺，9，10- 二氫化吖啶硫醇衍生物，下式VI所示的化合物，
24.如權(quán)利要求19到23中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述活化劑化合物選自過(guò)渡金屬鹽、過(guò)渡金屬絡(luò)合物和酶，所述活化劑標(biāo)記具有過(guò)氧化物酶活性。
25.如權(quán)利要求19-24中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述引發(fā)劑溶液包含選自下組的過(guò)氧化物過(guò)氧化氫，過(guò)氧化脲，過(guò)硼酸鹽。
26.如權(quán)利要求19-25中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述引發(fā)劑溶液包含選自下組的增強(qiáng)劑酚類化合物，芳族胺，苯丙唑，羥基苯丙噻唑，芳基硼酸，及它們的混合物。
27. 一種用于進(jìn)行權(quán)利要求1所述測(cè)定方法的系統(tǒng)，其包括 將樣品輸送到反應(yīng)混合物中的液體處理系統(tǒng)，將化學(xué)標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、活化劑標(biāo)記的特異性結(jié)合伴侶、選擇性信號(hào)抑制劑輸送到反應(yīng)混合物中的液體處理系統(tǒng)，將引發(fā)劑溶液輸送到反應(yīng)混合物中以便釋放化學(xué)發(fā)光信號(hào)的液體處理系統(tǒng)，以及用以檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)，其中，用以輸送引發(fā)劑溶液的所述液體處理系統(tǒng)與所述檢測(cè)系統(tǒng)協(xié)調(diào)作用，以便在注入引發(fā)劑溶液時(shí)或注入后測(cè)量化學(xué)發(fā)光信號(hào)釋放。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)懷疑含有反應(yīng)物的樣品中反應(yīng)物的方法、試劑、試劑盒和系統(tǒng)，其中所有的試劑皆可溶于水溶液。一種測(cè)定方法包括在反應(yīng)物存在的條件下，處理懷疑含有反應(yīng)物的樣品，使活化劑達(dá)到反應(yīng)構(gòu)型，化學(xué)發(fā)光化合物將其激活。樣品還被處理以減少與分析物不相關(guān)的信號(hào)。最后，用引發(fā)劑溶液處理該樣品，借此由被激發(fā)的化學(xué)發(fā)光化合物產(chǎn)生光。沒(méi)有試劑與某一表面或其他固相相連接。
文檔編號(hào)G01N33/58GK102333886SQ201080009871
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者B·厄德戈德, D·賓格, H·阿哈萬(wàn)·塔夫狄, J·門多薩, M·薩爾瓦蒂, N·沙皮爾, R·德席爾瓦, T·麥克勒農(nóng), 謝文華, 陳英 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特公司