專利名稱：利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬木瓜蛋白酶純度測定領(lǐng)域，特別是涉及一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木 瓜蛋白酶純度的方法。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一類巰基蛋白酶，廣泛存在于番木瓜(Caricapapaya)的 根、莖、葉和果實內(nèi)，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)，如啤 酒的澄清和肉質(zhì)的嫩化以及皮革、紡織、日化和制藥工業(yè)。近年來科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋 白酶在醫(yī)藥工業(yè)中有著巨大的實用價值，含有木瓜蛋白酶的藥物能起到抗癌、抗腫瘤和淋 巴性白血病的作用。由于制藥工業(yè)對木瓜蛋白酶的純度要求比較高，如何建立一種快速、 高效又精確地測定木瓜蛋白酶純度的方法，是大家研究的熱點。
目前，最常用的測定木瓜蛋白酶純度的方法是分別測定樣品中木瓜蛋白酶的酶活力和 蛋白質(zhì)含量后計算樣品的比酶活，這種方法的缺點是酶活和蛋白質(zhì)含量測定都存在一定得 誤差，能夠測量的木瓜蛋白酶的濃度范圍有限，而且操作步驟繁瑣、重復(fù)性差，尤其是當(dāng) 木瓜蛋白酶濃度過高或過低時，都會產(chǎn)生很大的測量誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純 度的方法，該測定方法快速、操作簡單，耗時少，結(jié)果可信，重復(fù)性高，為精確測定木瓜 蛋白酶的純度提供依據(jù)，具有重要的學(xué)術(shù)價值和實際應(yīng)用意義。
本發(fā)明的一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，包括
(1) 配制流動相
流動相A溶液0.02~0.1 mol/LpH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；
流動相B溶液含1.0-2.0 mol/L氯化鈉的0.02-0.lmol/L pH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶
液；
(2) 制備對照品溶液
將精制木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶內(nèi)，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻， 至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶對照品溶液；
(3) 制備供試樣品溶液
將粗制木瓜粉置于50ml容量瓶中，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，經(jīng)濾 紙過濾，備用；
3(4)利用快速蛋白質(zhì)液相色譜FPLC的離子交換色譜柱進行層析分離，通過計算峰面積比 值的公式來計算木瓜蛋白酶的純度。
所述步驟(1)中的流動相A溶液為0.05mol/LpH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；
所述步驟(1)中的流動相B溶液為含2.0mol/L氯化鈉的0.05 mol/LpH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；
所述步驟(2)中的木瓜蛋白酶的用量為250mg-500mg; 所述步驟(3)中的粗制木瓜蛋白酶的用量為300mg-500mg;
所述步驟(4)中的色譜條件是離子交換柱為HiTrapTMSPXLlml，流動相A溶液為 0.02 ~0.1 mol/LpH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，流動相B溶液為含1.0~2.0mol/L氯化鈉的 0.02~0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，上樣量為250-500 nl,平衡為5~10個柱床， 沖洗為5~7個柱床，洗脫梯度為流動相B溶液在15~25個柱床內(nèi)由0%線性增加至 70%-100%，流速為0.8~1.0ml/min;
所述的木瓜蛋白酶的純度計算方法X=(粗制木瓜蛋白酶的峰面積X精制木瓜蛋白酶 的濃度/精制木瓜蛋白酶的峰面積X粗制木瓜蛋白酶的濃度)X 100%。 有益效果
本發(fā)明的測定方法快速、操作簡單，耗時少，結(jié)果可信，重復(fù)性高，為精確測定木瓜 蛋白酶的純度提供依據(jù)，具有重要的學(xué)術(shù)價值和實際應(yīng)用意義。


圖1為利用快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)對精制木瓜蛋白酶溶液進行離子交換色譜分析所 得到色譜圖2為利用快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)對粗制木瓜蛋白酶溶液進行離子交換色譜分析所
得到色譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
實施例1
利用快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)測定木瓜蛋白酶的純度，具體步驟如下 (1)配制流動相稱取乙酸鈉配制成0.05mol/L乙酸鈉溶液、氯化鈉，量取去離子水，按
4比例配制成流動相A、 B溶液。
流動相A溶液稱取4.102g乙酸鈉配制成體積為1L的0.05mol/LpH 4.5乙酸-乙酸鈉 的緩沖液；
流動相B溶液:稱取4.102g乙酸鈉，58.44g氯化鈉配制成體積為1L的0.05mol/L pH4.5 乙酸-乙酸鈉-氯化鈉緩沖液；
(2)制備對照品溶液精確稱取精制木瓜蛋白酶500mg，置入50ml容量瓶內(nèi)，加入 流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶對照 品溶液；
G)制備供試樣品溶液稱取粗制木瓜粉500mg，置于50ml容量瓶中，加入流動相A 溶液至50ml刻度線定容，搖勻，經(jīng)濾紙過濾，備用；
(4)利用FPLC的離子交換色譜柱進行層析分離，通過計算峰面積比值的公式來計算 木瓜蛋白酶的純度。
色譜條件是離子交換柱為HiTrapTM SP XL lml，流動相A溶液為O.05mol/L pH 4.5的 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，流動相B溶液為含l.Omol/L氯化鈉的0.05mol/LpH4.5的乙酸-乙 酸鈉緩沖溶液，上樣量為50(^1，平衡為5個柱床，沖洗為5個柱床，洗脫梯度為流動相B 溶液在15個柱床內(nèi)由0%線性增加至70%，流速為1.0ml/min。
實施例2
利用快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)測定木瓜蛋白酶的純度，具體步驟如下
(1) 配制流動相稱取乙酸鈉配制成0.05mol/L乙酸鈉溶液、氯化鈉，量取去離子水， 按比例配制成流動相A、 B溶液。
流動相A溶液稱取4.102g乙酸鈉配制成體積為1L的0.05mol/LpH 4.5乙酸-乙酸鈉 的緩沖液；
流動相B溶液:稱取4.102g乙酸鈉，U6.88g氯化鈉配制成體積為1L的O.05mol/L pH4.5 乙酸-乙酸鈉-氯化鈉緩沖液；
(2) 制備對照品溶液精確稱取精制木瓜蛋白酶500mg，置入50ml容量瓶內(nèi)，加入 流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶對照 品溶液；
(3) 制備供試樣品溶液稱取粗制木瓜粉500mg，置于50ml容量瓶中，加入流動相A 溶液至50ml刻度線定容，搖勻，經(jīng)濾紙過濾，備用；(4)利用FPLC的離子交換色譜柱進行層析分離，通過計算峰面積比值的公式來計算 木瓜蛋白酶的純度。
色譜條件是離子交換柱為HiTrap SP XL lml，流動相A溶液為0.05 mol/LpH 4.5的 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，流動相B溶液為含2.0mol/L氯化鈉的0.05mol/LpH 4.5的乙酸-乙 酸鈉緩沖溶液，上樣量為500^1，平衡為5個柱床，沖洗為5個柱床，洗脫梯度為流動相 B溶液在20個柱床內(nèi)由0%線性增加至100%,流速為0.8ml/min。
權(quán)利要求
1.一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，包括(1)配制流動相流動相A溶液0.02～0.1mol/L pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；流動相B溶液含1.0～2.0mol/L氯化鈉的0.02～0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；(2)制備對照品溶液將木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶內(nèi)，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，至木瓜蛋白酶充分溶解，制得木瓜蛋白酶對照品溶液；(3)制備供試樣品溶液將粗制木瓜粉置于50ml容量瓶中，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，經(jīng)濾紙過濾，備用；(4)利用快速蛋白質(zhì)液相色譜FPLC的離子交換色譜柱進行層析分離，通過計算峰面積比值的公式來計算木瓜蛋白酶的純度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，其特 征在于所述步驟(1)中的流動相A溶液為0.05mol/LpH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，其特 征在于所述步驟(1)中的流動相B溶液為含2.0mol/L氯化鈉的0.05 mol/LpH 4.5的乙 酸-乙酸鈉緩沖溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，其特 征在于所述步驟(2)中的木瓜蛋白酶的用量為250mg-500mg。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，其特 征在于所述步驟(3)中的粗制木瓜蛋白酶的用量為300mg-500mg。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，其特 征在于所述步驟(4)中的色譜條件是離子交換柱為HiTrapWSPXLlml，流動相A溶 液為0.02 ~0.1 mol/LpH 4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，流動相B溶液為含1.0~2.0mol/L氯 化鈉的0.02 0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，上樣量為250-500 pl，平衡為5~10 個柱床，沖洗為5 7個柱床，洗脫梯度為流動相B溶液在15 25個柱床內(nèi)由0。/。線性增加 至70%-100%，流速為0.8~1.0ml/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用快速蛋白質(zhì)液相色譜測定木瓜蛋白酶純度的方法，包括配制流動相A溶液乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和流動相B溶液乙酸-乙酸鈉-氯化鈉緩沖溶液；分別將精制的木瓜蛋白酶和粗制的木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶內(nèi)，加入流動相A溶液至50ml刻度線定容，搖勻，至木瓜蛋白酶充分溶解；最后利用快速蛋白質(zhì)液相色譜FPLC的離子交換色譜柱進行層析分離，通過計算峰面積比值的公式來計算木瓜蛋白酶的純度。該測定方法快速、操作簡單，耗時少，結(jié)果可信，重復(fù)性高，為精確測定木瓜蛋白酶的純度提供依據(jù)，具有重要的學(xué)術(shù)價值和實際應(yīng)用意義。
文檔編號G01N30/02GK101565739SQ20091005272
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者朱利民, 聶華麗, 蘇賽男 申請人:東華大學(xué)