專利名稱：一種用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及食品加工技術，更具體地涉及用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法。
背景技術：
大豆分離蛋白是以低溫脫溶大豆粕為原料生產的一種全價蛋白類食品。蛋白質含量在90%以上，氨基酸種類有近20種，并含有人體必需氨基酸。其營養(yǎng)豐富，不含膽固醇， 近年的研究證實，大豆蛋白具有肉類蛋白所不具有的保健價值，是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動物蛋白的品種之一，對維系人類生命和保證人們的健康起著重要作用。但大豆蛋白分子結構緊密，對酶解具有很強的抵抗力，不利于人體內的消化和吸收，其生理活性和消化性是開發(fā)大豆蛋白加工技術的主要難題。因此，測定蛋白在人體內的消化率對提高和改善大豆蛋白加工難題具有重要的現(xiàn)實意義。目前對蛋白質消化的研究方法主要有化學法分析、體內消化法(人體及動物實驗法)和體外模擬法等?；瘜W分析法快速簡便，但這種利用概略養(yǎng)分分析所測得的蛋白養(yǎng)分與人體消化吸收養(yǎng)分間存在很大差異，不足以準確地反映出蛋白的實際營養(yǎng)價值。體內消化法(人體及動物實驗法)是測定蛋白質消化最好的方法，但是這種方法復雜、時間長、費用高；且由于很多因素影響而很難做到。與前兩種方法相比，體外模擬法具有快速、簡便、重復性好等優(yōu)點，雖體內消化過程難以精確再現(xiàn)，但是，存在于體內的條件是可以在體外再現(xiàn)的。通過對體內真實情況的模擬，能很好的反映食物在體內消化吸收，可在短時間內對多個樣品進行評定。現(xiàn)有技術文獻中已有關于對大豆蛋白進行體外消化率測定的記載。例如，黃滄海等(幾種蛋白質原料體外消化率測定方法的比較，飼料工業(yè)，高壓物理學報，2005年第沈卷第20期)分別采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法、肉食性魚類(如鱸魚)消化道粗酶提取液消化法和草食性魚類(如草魚)消化道粗酶提取液消化法測定了酪蛋白、魚粉、豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7種蛋白原料的消化率。結果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法在測定魚粉蛋白質消化率時可以替代魚類消化液粗酶消化法，對于其它蛋白質原料使用該方法應慎重。Pedersen, B.禾口 Eggum, B. 0. (Prediction ofprotein digestibility by an in vitro enzymatic pH-stat procedure，1983 年第 49 期)用體外法測定了 61 種食物蛋白質的消化率，其中57種植物蛋白或植物蛋白與動物蛋白的混合物，體外實驗測的消化率與體內實驗(大鼠試驗)有很好的相關性。李清曉等(豆粕粉碎粒度與蛋白質體外消化率的關系研究，家畜生態(tài)學報，2005年第沈卷第5期)采用胃蛋白酶一胰酶兩步法，通過體外模擬雞體消化道內環(huán)境來比較不同粉碎粒度豆粕的蛋白消化率，從而確定適合肉仔雞生長的較適宜豆粕粉碎粒度。蛋白質在體內的消化是一個兩步過程，第一步是蛋白質與預可消化性的胃蛋白酶相接觸，第二步是蛋白質和氨基酸與胰蛋白酶的接觸消化。目前，胃蛋白酶-胰酶兩步體外消化法是公認的一種較好的測定蛋白質消化率的方法。但該方法大多用于飼料的消化率測定，雖有關于大豆蛋白體外消化的研究，但這些研究中所采用的蛋白酶沒有經(jīng)過酶的標準化，在體外消化中酶的活性變化范圍可能會較大，且對體內條件的模擬及仿真度不高。這樣，會使體內消化率的測定結果不穩(wěn)定且無對比參考性。因此，還需要對現(xiàn)有的大豆蛋白體外消化法進行改進以提高其測定結果的穩(wěn)定性和對比參考性。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法。本發(fā)明在于提供一種大豆分離蛋白體外消化率的測定方法，該方法是在現(xiàn)有技術基礎上加以改進，可提高測定結果的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，所述用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法包括下列步驟配制大豆分離蛋白的水溶液(0. 01 0. 1%，g/100mL)，作為樣品；使用一種或多種酶模仿人胃腸道的環(huán)境對所述樣品進行體外消化；終止消化過程，獲得待測樣品；以及測定所述待測樣品的體外消化率。在一個較佳實施方式中，在配制大豆分離蛋白的水溶液之前，可首先對所述大豆分離蛋白進行標準化檢測。在一個較佳實施方式中，所述大豆分離蛋白的蛋白質含量優(yōu)選在90% (干基)以上。在一個較佳實施方式中，所述水優(yōu)選為雙蒸水。在一個較佳實施方式中，所述酶可選自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、以及胰凝乳蛋白酶。在一個較佳實施方式中，消化所述樣品的過程可包括以下步驟調節(jié)所述樣品的pH到大約1. 5 ；加入胃蛋白酶；溫育所述樣品；提高pH到大約7. 8;加入胰蛋白酶；以及溫育所述樣品。在一個較佳實施方式中，終止消化過程的步驟可包括加入Na2CO3溶液于所述待測樣品中，并立即將所述待測樣品放入冰浴中冷卻。在一個較佳實施方式中，可采用三氯乙酸-可溶性氮法進行體外消化率測定。與現(xiàn)有技術中的測定方法相比，本發(fā)明的用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明采用的方法，模擬食物在體內的消化條件，盡量貼近人體消化環(huán)境，安全環(huán)保，工藝操作簡單方便，易于控制管理。2、本發(fā)明采用的方法，避免了由于酶種類、活力差異引起的測定差別，3、本發(fā)明采用的方法，對掌握大豆分離蛋白體外消化率，建立大豆分離蛋白體內消化模型，能夠提供直接而重要的參考依據(jù)。
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為了更好理解本發(fā)明的本質，下面結合附圖，通過對本發(fā)明較佳的實施方式的描述，詳細說明但不限制本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明的體外測定大豆分離蛋白消化率的流程圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述測定方法的流程如圖1所示。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，本發(fā)明所提供的用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法可包括下列步驟1)配制大豆分離蛋白的水溶液，作為樣品；2)使用一種或多種酶模擬人體胃腸道的環(huán)境對所述樣品進行體外消化；3)終止消化過程，獲得待測樣品；以及4)測定所述待測樣品的體外消化率。本發(fā)明的用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法通過模擬人體內的消化環(huán)境 (PH和溫度等)，用胃腸蛋白酶對大豆分離蛋白進行胃蛋白酶-胰酶兩步體外消化，體外消化的時間模擬食物經(jīng)過人體的消化道所需要的時間，并且采用三氯乙酸-可溶性氮法進行蛋白消化率的測定，從而能夠為準確地評價蛋白質飼料的營養(yǎng)價值和方法提供資料。該方法可一般性地用于各種大豆分離蛋白(包括經(jīng)熱處理或高壓處理得到的變性大豆分離蛋白)體外消化率的測定。在步驟幻中，所述酶可選自于胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。所用酶優(yōu)選為標準化酶，例如sigma公司的胃蛋白酶和胰蛋白酶，以提高測定結果的重現(xiàn)性和可比性。本發(fā)明所述的用于體外消化的酶根據(jù)美國藥典標準進行生產，酶的活性高度一致。美國藥典USP是一種非政府組織，它通過建立技術狀態(tài)標準來確保藥物質量和其他健康護理技術以促進公共健康。這些標準通過公眾參與的過程得以發(fā)展并為世界所接受。在一個較佳實施方式中，所述步驟2、包括以下步驟a)調節(jié)pH到大約1.5 ；b)加入胃蛋白酶；c)溫育樣品；d)提高pH到大約7. 8 ；e)加入胰蛋白酶；f)溫育樣品。在本發(fā)明中，終止消化過程的步驟可包括加入Na2CO3溶液于樣品中，并立即將樣品放入冰浴中冷卻。在配制大豆分離蛋白的水溶液之前，通常首先對所述大豆分離蛋白進行標準化檢測。檢測標準可為所述大豆分離蛋白的蛋白質含量一般應在90% (干基)以上， 雜質少，水分含量在5%左右。本發(fā)明所述的大豆分離蛋白標準化檢測，依據(jù)國家標準 (GB/T 5009. 5-2003食品中蛋白質的測定、GB/T5009. 3-2003食品中水分的測定、GB/T 5009. 6-2003食品中脂肪的測定和GB/T5009. 4-2003食品中灰分的測定)要求，進行原料的蛋白、水分、脂肪、灰份等的檢驗，保證原料符合高蛋白少雜質的要求，檢測方法簡單操作。其中，配制水溶液所用的水可為蒸餾水或雙蒸水。在本發(fā)明的一個較佳實施方式中，所述水優(yōu)選為雙蒸水。蒸餾水是不含任何礦物元素和雜質的純水，雙蒸水就是把蒸餾水在進行一次蒸發(fā)，純凈度更高。因一定量的雜質會對超高壓處理樣品產生一定影響，故優(yōu)選雙蒸水。在一個具體實施方式
中，消化所述樣品的過程可包括以下步驟
調節(jié)所述樣品的pH到大約1. 5 ；加入胃蛋白酶；溫育所述樣品；提高pH到大約7. 8 ；加入胰蛋白酶；以及溫育所述樣品。在一個具體實施方式
中，終止消化過程的步驟可包括加入Na2CO3溶液于所述待測樣品中，并立即將所述待測樣品放入冰浴中冷卻。其中，可采用三氯乙酸-可溶性氮法進行體外消化率測定。本發(fā)明所述的三氯乙酸-可溶性氮法，是依據(jù)大分子蛋白質不溶于三氯乙酸溶液中，只有小分子肽類和游離氨基酸才溶于其中的原理。這是經(jīng)典的區(qū)別大分子蛋白質和其水解產物肽、游離氨基酸的方法。例如，在一個較佳實施方式中，本發(fā)明所述的測定方法可包括下列步驟1)大豆分離蛋白粉的標準化檢測2)原料液配制選用含蛋白質90% (干基)以上的大豆分離蛋白(SPI)為原料，在20 25°C下用雙蒸水配制溶液，濃度為0. 1%。3)蛋白酶溶液配制所述蛋白酶為胃蛋白酶和胰蛋白酶。用0. OlM HCl溶液配成濃度為5mg/mL胃蛋白酶溶液，用PH 7. 0磷酸緩沖鹽溶液配成5mg/mL的胰蛋白酶溶液。兩種蛋白酶溶液均須新鮮配制。4)體外消化模擬大豆分離蛋白在人胃腸道的消化過程，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法進行體外消化。用雙蒸水調配成0.1% 1.0%的大豆蛋白溶液，調節(jié)PH到1.5。將樣品放入 37°C恒溫振蕩搖床，加入胃蛋白酶溶液，使其用量達到 5%，開始消化。30min后，調 PH到6.0中止反應。隨后升高溫度到401，調？!1為7.8。加入新鮮的胰蛋白酶溶液1 % 5%，繼續(xù)消化60min。5)終止消化終止消化的方法包括加入Na2CO3溶液于正在反應的樣品中，并立即將消化物放入冰浴中冷卻。6)體外消化率測定采用三氯乙酸-可溶性氮(TCA-NSI)法對樣品的體外消化率進行測定。步驟如下 將IOmL的不同消化液加入IOmL的10% TCA,于5000Xg離心30min后，倒出上清液。沉淀部分再用IOmL的10% TCA洗滌，并于同樣條件下離心，得到TCA不溶組分。蛋白質總氮和 TCA不溶性氮含量采用凱氏定氮法測得。消化過程氮釋放量(％ )由下式計算而得
權利要求
1.一種用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法，該方法包括下列步驟 配制大豆分離蛋白的水溶液，作為樣品；使用一種或多種酶模擬人體胃腸道的環(huán)境對所述樣品進行體外消化； 終止消化過程，獲得待測樣品；以及測定所述待測樣品的體外消化率。
2.權利要求1所述的方法，其中，在配制大豆分離蛋白的水溶液之前，對所述大豆分離蛋白進行標準化檢測。
3.權利要求2所述的方法，其中，所述大豆分離蛋白的蛋白質含量在90%(干基)以上。
4.權利要求1、2和3中的任意一項所述的方法，其中，所述水為雙蒸水。
5.權利要求1、2、3和4中的任意一項所述的方法，其中，所述酶選自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、以及胰凝乳蛋白酶。
6.權利要求5所述的方法，其中，所述酶為標準化酶。
7.權利要求1、2、3、4、5和6中的任意一項所述的方法，其中，體外消化所述樣品的過程包括以下步驟調節(jié)所述樣品的PH到大約1. 5 ； 加入胃蛋白酶； 溫育所述樣品； 提高PH到大約7. 8 ； 加入胰蛋白酶；以及溫育所述樣品。
8.權利要求1、2、3、4、5、6和7中的任意一項所述的方法，其中，終止消化過程的步驟包括加入Na2CO3溶液于所述待測樣品中，并立即將所述待測樣品放入冰浴中冷卻。
9.權利要求1、2、3、4、5、6、7和8中的任意一項所述的方法，其中，采用三氯乙酸-可溶性氮法進行體外消化率測定。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于體外測定大豆分離蛋白消化率的方法。該方法的步驟包括配制大豆分離蛋白的水溶液，作為樣品；使用一種或多種酶模仿人胃腸道的環(huán)境對所述樣品進行體外消化；終止消化過程，獲得待測樣品；以及測定所述待測樣品的體外消化率。該方法具有操作簡易方便，節(jié)能環(huán)保，安全高效等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102329853SQ20101022745
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權日2010年7月12日
發(fā)明者劉威, 張?zhí)m芳, 曹有福, 李樹君, 楊炳南, 蘇丹, 趙鳳敏, 趙小鵬 申請人:中國農業(yè)機械化科學研究院