專利名稱：慶大霉素elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及檢測(cè)慶大霉素殘留量的試劑盒，特別是檢測(cè)肌 肉、肝臟中慶大霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。 ( 二 )背景技術(shù)慶大霉素(Gentamicin)是氨基糖甙類抗生素，被廣泛應(yīng)用于動(dòng) 物疾病的治療，由于其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒性，在動(dòng)物食品中的殘留會(huì)影響人類健康，歐 美國(guó)家及我國(guó)均要求其限量使用。 檢測(cè)慶大霉素殘留量的化學(xué)方法目前有高效液相色譜法，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和 繁瑣的過(guò)程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問(wèn)題是提供一種小巧輕便的慶大霉 素殘留量檢測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技 術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中慶大霉素殘留量的測(cè)定，減少了檢測(cè)樣本所需要 的時(shí)間。 本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中慶大霉素殘留量的酶聯(lián)免疫 試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶 位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯試劑板作為 固相載體，酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆 裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，在試劑盒酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被慶大霉素偶聯(lián)抗原制成 檢測(cè)板，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，以塑料硬膜為蓋板膜，將放入真空鋁箔袋中，將 6瓶lml梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、lml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、12ml酶標(biāo)二抗、7ml慶大霉素抗體 工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復(fù)溶液試 劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標(biāo)板、蓋板 膜、自封袋、說(shuō)明書、質(zhì)控報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。每一個(gè)試劑盒中的 試劑足夠進(jìn)行96次測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將 板孔拆開多次檢測(cè)。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果 的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí)，樣本中的慶大霉素將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的慶大霉素偶聯(lián)抗原競(jìng) 爭(zhēng)抗慶大霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含慶大霉 素的殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中慶大霉 素殘留量，其操作簡(jiǎn)便易行。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度肌肉樣本的最低檢測(cè)限為4ii g/kg、肝
臟樣本的最低檢測(cè)限為4ii g/kg ;肌肉樣本的回收率為90% ±10% ;肝臟樣本的回收率為
90% ±10% ;相對(duì)于其他慶大霉素檢測(cè)方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、恒溫
箱、渦旋儀、離心機(jī)和微量加樣器，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。 本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于慶大霉素殘留量的檢


圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8. 55cm);[0009] 圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長(zhǎng)為12. 8cm); 圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖； 圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖； 圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖； 圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖； 圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。 參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被慶大霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外 框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫 箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2);透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮 洗滌液；藍(lán)色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色塑 料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml 顯色液B液，黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試 劑瓶(8)用于封裝12ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml慶大霉素抗 體工作液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝lml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及l(fā)ml高濃度標(biāo) 準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)， 50ml濃縮復(fù)溶液(11) ， 7ml顯色液A液瓶位(14) ， 7ml顯色液B液瓶位(13) ， 7ml終止液瓶 位(12) ，7ml慶大霉素抗體工作液瓶位(16) ， 12ml酶標(biāo)二抗瓶位(15) ，6種lml/瓶各種濃 度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及1瓶lml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。
具體實(shí)施方式本實(shí)用新型的實(shí)施例 —、樣本的前處理 1.配液 配液1 :0. 1M PBS溶液(PH = 10-11) 稱取13. 4g十二水合磷酸氫二鈉、20g氯化鈉、0. 32g氫氧化鈉、0. 5g二水合磷酸二 氫鉀、0. 5g氯化鉀加去離子水溶解定溶至500ml。 配液2:洗滌工作液 用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 : 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4t:環(huán)境可保存一個(gè)月。 配液3:復(fù)溶工作液 用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 : 1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮復(fù)溶液+1
份去離子水)，用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4t:環(huán)境可保存一個(gè)月。 2.以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加的肌肉、肝臟樣本處理步驟稱取2. 0±0. 05g去均質(zhì)樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入6ml 0. 1M PBS(PH =10 11)緩沖液6ml，混勻10min ;置于6(TC水浴環(huán)境中60min，取出冷卻至室溫并搖勻； 3000g以上，室溫離心10min ;移取上清液，加入復(fù)溶工作液，以1 : 9的體積比進(jìn)行稀釋 (50 ii 1上清液+450 ii 1復(fù)溶工作液)；取50 iU用于分析。 二、使用試劑盒的操作步驟 1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫(20-25°C )平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2、取出板架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗滌液在使用前也需要回溫。 4、編號(hào)將樣本溶液和標(biāo)準(zhǔn)品工作液對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品 工作液做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。 5、加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液50 ii 1到各自的微孔 中，然后加抗體工作液50ia/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，37t:環(huán)境中反應(yīng)30min。 6、取出微孔板，甩出孔內(nèi)液體，用洗滌液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭剌破)。 7、加入酶標(biāo)二抗工作液100 iU/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板置于37t:環(huán)境 反應(yīng)30min，取出重復(fù)步驟7。 8、顯色每孔先加入底物液A液50iil，再加B液50ia，輕輕振蕩混勻，37t:環(huán)境 中避光顯色15min。 9、測(cè)定每孔加入終止液50 ii 1，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用 雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD (若無(wú)酶標(biāo)儀，則不加終止液用 目測(cè)法可進(jìn)行判定)。 三、結(jié)果判定 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第l種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與慶大霉素殘留量成負(fù)相關(guān)。 1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(P g/L)。 假設(shè)樣本1的吸光度值為0. 512，樣本2的吸光度值為0. 889，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是 0 y g/L為1. 900 ;0. 1 y g/L為1. 450 ;0. 3 ii g/L為1. 000 ;0. 9 ii g/L為0. 600 ;2. 7 ii g/L為 0. 300 ;8. 1 y g/L為0. 150。則樣本1的濃度范圍是0. 9 ii g/L_2。 7 y g/L乘以其對(duì)應(yīng)的稀 釋倍數(shù)；樣本2的濃度范圍是0. 3 ii g/L-O. 9 y g/L乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 2、定量分析 (1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，艮卩
B
百分吸光度值(％) =- x 100%
BO B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0-0 ii g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(P g/L)的半對(duì)數(shù)為橫坐 標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng) 的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實(shí)際殘留量。 四、測(cè)定前的注意事項(xiàng) 1、室溫低于2(TC或試劑及樣本沒有回到室溫(20_25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值 偏低。[0049] 2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性， 重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3、試劑混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 4、反應(yīng)終止液為2mol/L硫酸，避免接觸皮膚。 5、儲(chǔ)存條件 保存試劑盒于2-『C，不要冷凍；將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、0D值的變化。
不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。 7、試劑變質(zhì)的跡象 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5(A450nm < 0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。 8、加A、 B液后一般顯色15min即可，若顏色較淺，可延長(zhǎng)顯色時(shí)間，但不能超過(guò) 30min。 9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37t:，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度 發(fā)生變化。
權(quán)利要求一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中慶大霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被慶大霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo) 板，放于真空鋁鉑袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶標(biāo)二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料 瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液 用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽 的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔 預(yù)包被慶大霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，lml/ 瓶，濃度分別為0 ii g/L， 0. 1 ii g/L， 0. 3 ii g/L， 0. 9 ii g/L， 2. 7 y g/L， 8. 1 y g/L ;高濃度標(biāo)準(zhǔn) 品溶液1瓶，lml ;酶標(biāo)二抗1瓶，12ml ;抗體工作液1瓶，7ml ;顯色液A液1瓶，7ml ;顯色液 B液1瓶，7ml ;終止液1瓶，7ml ;濃縮洗滌液1瓶，40ml ;濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中慶大霉素含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、慶大霉素抗體工作液、慶大霉素6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書和質(zhì)檢報(bào)告。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的慶大霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗慶大霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中慶大霉素的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在肌肉、肝臟中慶大霉素的殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK201535773SQ200920246849
公開日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者萬(wàn)宇平, 何勇, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 馮靜, 劉平, 劉福林, 李勇, 汪善良, 王立志, 趙正苗 申請(qǐng)人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司