專利名稱：：一種慶大霉素凝膠制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含有慶大霉素的藥物組合物及其制備方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的藥物劑型一一慶大霉素凝膠制劑，該制劑中含有慶大霉素和泊洛沙姆。背景4支術(shù)梅尼埃病是一種具有明顯致殘性的內(nèi)耳疾病。全球發(fā)病率為12/1000人(ArebergIK,GeorgeG，PillsburgHCIII.TheincidenceandprevalenceofMeniere'sdisease:astatisticalanalysisoflimits.OtolaryngolClinNorthAm,1980;13:597-602.)。臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作的眩暈，伴有患耳脹滿感及耳鳴。發(fā)作頻率及發(fā)病間歇期不定，且發(fā)作方式也多變。疾病間歇期病人可有聽力下降及耳鳴。雙側(cè)發(fā)病率大于30%(BalkanyTJ,SiresB，ArebergIK.BilateralaspectsofMen舊re'sdisease:anunderestimatedclinicalentity.OtolaryngolClinNorthAm,1980;13:603-610.)。本病原因不明，但主要病理改變?yōu)槟っ月贩e水。內(nèi)淋巴液生成增多、吸收減少以及內(nèi)淋巴循環(huán)改變均可導(dǎo)致膜迷路積水。無論何種原因的膜迷路積水，產(chǎn)生癥狀的機(jī)制均未闡明，可能與內(nèi)耳膜破裂、內(nèi)淋巴液離子濃度或滲透壓變化有關(guān)。學(xué)者們認(rèn)為病毒性內(nèi)耳疾病、自身免疫性內(nèi)耳病、遺傳等因素與梅尼埃病的產(chǎn)生有一定關(guān)聯(lián)。雖然迄今并不能明確梅尼埃病的發(fā)病機(jī)制，但關(guān)于其臨床治療已有100年的歷史。多種保守的非手術(shù)方法一直是本病基本的治療手段，如低鹽飲食、避免咖啡因攝入、使用利尿劑等。藥物治療梅尼埃病也取得了一定的成功，包括類固醇激素、鈣通道阻滯劑、血管舒張劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及食品添加物等(SlatteryWH川，F(xiàn)ayadJN.MedicaltreatmentofMeniere'sdisease.OtolaryngolClinNorthAm,1987;30:1027-1038.)。另外，抗過敏治療對(duì)60%的病人有效。保守治療失敗后，應(yīng)選擇外科方法進(jìn)行治療。歸納分為1、迷路破壞手術(shù)即通過迷路切除術(shù)毀損聽覺與平衡系統(tǒng)。該技術(shù)由Cawthome(1943)首先采用。Schuknecht對(duì)其進(jìn)行了推廣，并于1956年報(bào)告了其治療結(jié)果。此后，越來越多以膜迷路積水為重點(diǎn)的治療方法得以發(fā)展。2、內(nèi)淋巴囊手術(shù)Portmann(1926)首次進(jìn)行了經(jīng)乳突內(nèi)淋巴嚢分流術(shù)。之后其他方式的內(nèi)淋巴嚢分流術(shù)和減壓術(shù)也得到了發(fā)展，如內(nèi)淋巴囊蛛網(wǎng)膜下腔分流術(shù)、Denver分流術(shù)、Cody方式以及內(nèi)淋巴嚢減壓術(shù)，另外還有最新的淋巴嚢切除術(shù)(GibsonWPR，ArenbergIK.PathophysiologictheoriesintheetiologyofMeniere'sdisease.OtolaryngolClinNorthAm,1987;30:961-968.)。3、選擇性神經(jīng)切除術(shù)McKenzie(1931)和Dandy(1932)最早提出了該方法，Dandy在1941年報(bào)道了624例手術(shù)結(jié)果。但手術(shù)較高的難度與風(fēng)險(xiǎn)使得該術(shù)式逐漸被迷路破壞術(shù)和內(nèi)淋巴嚢手術(shù)所取代。由WilliamHouse提出的經(jīng)中顱窩前庭神經(jīng)切斷術(shù)，是第一例在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行的選擇性神經(jīng)切斷手術(shù)，但手術(shù)難度較大，且有一定的失敗率。Silverstein和Norrell(SilversteinH,NorrellH.Retrolabyrinthinesurgery:adirectapproachtothecerebellopontineangle.OtolaryngolHeadNeckSurg,1980;88:462-469.)對(duì)上述技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，于1980年開展了迷路后前庭神經(jīng)切斷術(shù)(乳突后前庭神經(jīng)切斷術(shù)及迷路后-乳突后聯(lián)合徑路前庭神經(jīng)式:，、'，、'，土、a'、除上述梅尼埃病治療方法外，還有一類微創(chuàng)性、根治性的治療技術(shù)一一應(yīng)用耳毒性藥物治療梅尼埃病性眩暈。該技術(shù)始于Fowler(1948)的工作(FowlerE.Streptomycintreatmentofvertigo.TransAmAcadOphthalmolOtolaryngol,1948;10:166-169.),他首次報(bào)道了全身應(yīng)用鏈霉素治療眩暈的臨床結(jié)果。但該方法影響雙側(cè)聽覺及前庭功能的特性使其不能用于單側(cè)病變的治療，除雙側(cè)難治性梅尼埃病，其余患者一般不采用全身氨基糖苷類藥物治療，該觀點(diǎn)直至現(xiàn)在還被部分學(xué)者所倡導(dǎo)。為避免氨基糖苷類藥物的全身作用，Schuknect(SchuknechtH.AblationtherapyinMeniere'sdisease.ActaOtolaryngol(Stockh),1957;132(Suppl):1國(guó)42.〉于1957年首次報(bào)道了經(jīng)鼓室局部應(yīng)用鏈霉素的臨床研究。采用450~2400mg的劑量，62%的病人獲得治愈，但也有相同比率的病人伴有嚴(yán)重的聽力損失。有鑒于此，在接下來的20年中對(duì)經(jīng)鼓室用藥持懷疑態(tài)度。隨著對(duì)氨基糖普類藥物研究的深入，學(xué)者們開始重新重視局部治療的觀點(diǎn)。Beck(1974)開始用聚乙烯管或中耳通氣管經(jīng)鼓膜插入，進(jìn)行鼓室內(nèi)慶大霉素治療，每天2次中耳灌注16mg慶大霉素。其目的不是為了完全破壞前庭功能，而是為了損傷分泌上皮，減少積水。Beck(1986)(BeckC.lntratympanicapplicationofgentamicinfortreatmentofMeniere'sdisease.KeioJMed，1986;35:3641.)報(bào)告了梅尼埃病性眩暈局部治療的結(jié)果，成功率達(dá)到91%~100%,僅17%的病人出現(xiàn)聽力減退，2%發(fā)生全聾。因此Beck建議治療需持續(xù)到出現(xiàn)眩暈、自發(fā)性眼震、或骨-氣導(dǎo)間距降低等臨床癥狀。Beck和其他研究者的成功工作使鼓室內(nèi)給藥治療梅尼埃病重獲重視并在臨床推廣。盡管以這種方式治療梅尼埃病的醫(yī)療中心逐漸增加，且前景良好，但該方法仍存在許多難題有待解決如最佳的治療時(shí)間窗、方案的優(yōu)化、有效劑量、給藥方式、治療的截止點(diǎn)以及近期和遠(yuǎn)期效果評(píng)價(jià)指標(biāo)等。文獻(xiàn)顯示，總劑量320mg每天3次給藥的方案，其控制眩暈的效果和產(chǎn)生的聽力障礙與總劑量不超過78mg每周1次給藥的治療方案結(jié)果相同。治療總劑量自13mg至440mg不等，但其眩暈控制率相同(PyykkoI，lshizakiH,KaasinenS，etal.lntratympanicgentamicininbilateralMeniere'sdisease.OtolaryngolHeadNeckSurg，1994;"0:162-167;RarchSD，OasJG.IntratympanicgentamicinfortreatmentofintractableMeniere'sdisease:apreliminaryreport.Laryngoscope,1997;107:49-55.)。文獻(xiàn)中關(guān)于治療方法與效果的報(bào)道差異較大，每個(gè)治療中心根據(jù)病人情況和對(duì)藥物反應(yīng)釆用了不同的治療劑量。許多研究者將患者臨床反應(yīng)(眼震、眩暈、或聽力減退)作為治療截止點(diǎn)，而另一些學(xué)者則希望達(dá)到前庭感覺器的化學(xué)切除。分析上述差異與混亂的主要原因是1、鼓室內(nèi)應(yīng)用慶大霉素后其活性及藥物動(dòng)力學(xué)尚不清楚；2、經(jīng)鼓室途徑給藥有其內(nèi)在的不準(zhǔn)確性，藥物可經(jīng)咽鼓管、外耳道漏出，或分隔在中耳腔的某個(gè)位置，不能被內(nèi)耳吸收，這些情況使得每個(gè)病人及每次給藥均有可能不同。3、單次注射藥物的局部滯留時(shí)間短。即使經(jīng)鼓室給藥后其被內(nèi)耳吸收的藥物量可以控制，藥物的動(dòng)力學(xué)和活性仍不完全相同。多個(gè)小組對(duì)慶大霉素在內(nèi)耳細(xì)胞的作用部位和時(shí)間過程進(jìn)行了研究。全身給藥后外淋巴液慶大霉素濃度峰值出現(xiàn)在26h,但據(jù)報(bào)道內(nèi)耳細(xì)胞對(duì)慶大霉素的吸收可發(fā)生于給藥后的數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)。這種時(shí)間過程和動(dòng)力學(xué)差異可能與實(shí)驗(yàn)技術(shù)、給藥方式及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟煌嘘P(guān)。為探討經(jīng)鼓室給藥治療方法中諸多問題的解決辦法，本研究觀察了慶大霉素-泊洛沙姆407原位凝膠制劑對(duì)內(nèi)耳細(xì)胞形態(tài)和功能的影響方式。出人意料地發(fā)現(xiàn)慶大霉素泊洛沙姆原位凝膠制劑可以延遲藥物對(duì)內(nèi)耳形態(tài)的損傷，延長(zhǎng)對(duì)靶組織的作用時(shí)間，這將有可能明顯地提高治療效果。希望通過本研究結(jié)果更好地定義這一新的治療方法，如果可能，還將解釋不同的鼓室內(nèi)給藥方式得到相同治療結(jié)果的原因。另外，也希望本研究(也包括其他學(xué)者的相關(guān)工作)能夠成為發(fā)展一種內(nèi)耳藥物與微創(chuàng)技術(shù)相結(jié)合的新的治療模式的開端，并為其提供有價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。附圖1為藥物體外擴(kuò)散池裝置的示意圖。附圖2描述了PluronicF-127和PluronicF-127慶大霉素制劑的相變溫度變化曲線。附圖3描述了37。C條件下25%PluronicF-127及慶大霉素凝膠的體外降解量曲線。附圖4描述了慶大霉素不同制劑的累計(jì)釋放量曲線。附圖5描述了慶大霉素不同制劑的累計(jì)釋放率曲線。附圖6描述了慶大霉素不同制劑的累計(jì)釋放量與釋放時(shí)間平方根的函數(shù)曲線。附圖7描述了原位凝膠制劑和水溶液制劑鼓室內(nèi)局部給藥后外淋巴液的慶大霉素藥代動(dòng)力學(xué)曲線。附圖8比較了鼓室內(nèi)灌裝不同慶大霉素制劑后對(duì)內(nèi)耳細(xì)胞形態(tài)的影響。慶大霉素泊洛沙姆407原位凝膠制劑組動(dòng)物2小時(shí)耳蝸外毛細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅有散在性細(xì)胞缺失；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，8小時(shí)外毛細(xì)胞較2小時(shí)缺失增多，但仍表現(xiàn)為散在性缺失，l-2天時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞核明顯缺失和固縮，4天時(shí)外毛細(xì)胞核表現(xiàn)為逐漸恢復(fù)趨勢(shì)，5天時(shí)外毛細(xì)胞核逐漸恢復(fù)，少量細(xì)胞核固縮和腫脹，6天時(shí)仍存在片狀的核缺失、固縮和膨脹；普通制劑組動(dòng)物2小時(shí)耳蝸外毛細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅有散在性細(xì)胞缺失，但在8小時(shí)時(shí)外毛細(xì)胞就幾乎完全缺失，1天時(shí)外毛細(xì)胞核則逐漸恢復(fù)正常，固縮和腫脹并存；2-3天時(shí)外毛細(xì)胞核逐漸'fe復(fù)正常，僅有少量細(xì)胞核表現(xiàn)為固縮和腫脹；4天以后外毛細(xì)胞核已基本恢復(fù)正常。附圖9比較了鼓室內(nèi)注射不同慶大霉素制劑后動(dòng)物的聽力閾移。所有動(dòng)物在鼓室內(nèi)注射慶大霉素制劑后均出現(xiàn)聽力閾值升高，但非緩釋制劑組動(dòng)物閾移較快，于12小時(shí)達(dá)到最高峰，平均聽力損失60dB，隨著觀察時(shí)限延長(zhǎng)，聽閾逐漸恢復(fù)，至14天時(shí)平均聽力損失僅有5dB。緩釋制劑組動(dòng)物聽力損失緩慢，且程度小于非緩釋制劑組動(dòng)物，24小時(shí)聽力損失達(dá)50dB,并維持該水平數(shù)天，于96小時(shí)開始聽力逐漸恢復(fù)，但恢復(fù)較慢，直至14天時(shí)聽力損失仍保持在12.5dB。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種用于治療梅尼埃病的藥物組合物，其含有氨基糖苷類抗生素和泊洛沙姆。其中的氨基糖苷類抗生素包括慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素和新審素，優(yōu)選為為慶大霉素。在上述的藥物組合物中，泊洛沙姆約占組合物重量的21-40%。優(yōu)選泊洛沙姆約占組合物重量的23-28%，最優(yōu)選約25%。本發(fā)明還涉及上述藥物組合物在制備用于治療梅尼埃病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及一種用于治療梅尼埃病凝膠制劑，其含有氨基糖苷類抗生素和泊洛沙姆。其中的氨基糖苷類抗生素為慶大霉素。在上述凝膠制劑中，泊洛沙姆約占組合物重量的21"40%。優(yōu)選泊洛沙姆約占組合物重量的23-28%，最優(yōu)選約25%。其中慶大霉素與泊洛沙姆的重量比優(yōu)選為3:25。參照下面對(duì)本發(fā)明例示性實(shí)施方案和其中包括的實(shí)施例的詳細(xì)描述可容易地理解本發(fā)明。作為聲明，應(yīng)理解為上述的說明僅是例示性和說明性的，而不是對(duì)本面的方案。非離子表面活性劑泊洛沙姆(Poloxamer)為聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)組成的ABA型嵌段共聚物，而濃度為20%~40°/。的泊洛沙姆407(PluronicF127)水溶液具有受熱反向凝膠的性質(zhì)。早期的毒性研究表明這種共聚物具有良好的耐受性，這些結(jié)果推動(dòng)了泊洛沙姆407在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和美容方面的設(shè)計(jì)應(yīng)用。本研究制備了以泊洛沙姆407為基質(zhì)的慶大霉素溫度敏感性凝膠制劑，并對(duì)其生物學(xué)特性及體內(nèi)外藥物釋放進(jìn)行了探討。試驗(yàn)1:體外釋放研究材料和方法一.試劑與藥品硫酸慶大霉素(批號(hào)0511430，邯鄲滏榮原料藥公司)；泊洛沙姆407(PluronicF-127,BASF公司)，慶大霉素?zé)晒馄衩庖邫z測(cè)試劑盒(美國(guó)雅培公司)，其他化學(xué)試劑均為分析純。二.儀器電子天平(德國(guó)塞多利斯，BS124S);熒光偏振免疫檢測(cè)儀(TDXsystem,美國(guó)雅培公司)。三.方法1.PluronicF-127凝膠的制備精密稱取PluronicF-127適量于玻璃容器中，加入低溫PBS液適量，渦旋溶解，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%。然后置于4。C冰箱中保存24h以上，直至聚合物完全溶解得到澄明溶液。另取處方量慶大霉素與聚合物水溶液混勻，藥物質(zhì)量濃度為30mg/ml。2.PluronicF-127和PluronicF-127慶大霉素制劑的溫度可逆性相變特性的檢測(cè)在溫度可控性水浴箱內(nèi)觀察不同濃度PluronicF-127的溶液-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度。同樣方法觀察PluronicF-127慶大霉素制劑的溶液-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度。3.檢測(cè)PluronicF-127凝膠的體外降解性分別取lml配好的25%PluronicF-127和25%PluronicF-127慶大霉素制劑溶液置于管形瓶中，特溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，稱量凝膠重量。然后將其放置于37C保溫箱內(nèi)，定時(shí)稱量殘余凝膠重量。殘余凝膠重量M-NU-M容器一M溶質(zhì)。4.PluronicF-127慶大霉素制劑的體外釋放試驗(yàn)8本研究藥物體外擴(kuò)散池裝置由供給室與接受室兩部分組成(參見附圖1),由固定裝置組合，可上下調(diào)節(jié)供給室的位置，使半透膜與接受室液面始終接觸。供給室為圓柱形，底部設(shè)計(jì)成漏斗狀，中心預(yù)留面積0.lcni2的圓孔，可固定半透膜，代替圓窗膜通道。供給室內(nèi)分別加入20%、25%、30%PluronicF-127慶大霉素制劑溶液0.5ml,接受室內(nèi)加入PBS10ml,并上下調(diào)節(jié)可上下調(diào)節(jié)供給室的位置，使半透膜與接受室液面始終接觸。另取擴(kuò)散池加入PBS慶大霉素溶液0.5ml，作為對(duì)照。擴(kuò)散池置放于37°C保溫箱內(nèi)。分別于O.5h、lh、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h取出接受池內(nèi)全部液體并加入等量的新鮮PBS。每一樣本需重復(fù)3次。用熒光偏振免疫檢測(cè)法(FPIA)檢測(cè)接受池內(nèi)液體的慶大霉素含量。結(jié)果1.不同濃度PluronicF-127和PluronicF-127慶大霉素制劑的相變溫度見附圖2。20%—35%PluronicF-127溶液具有溫度敏感性相轉(zhuǎn)變特性。20%PluronicF-127溶液在24—25。C時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，而載有慶大霉素的20%PluronicF-127溶液卻無溫度敏感性溶液-凝膠轉(zhuǎn)變特性。但載有慶大霉素的40%PluronicF-127溶液卻可在10°C時(shí)發(fā)生膠凝化反應(yīng)。進(jìn)一步觀察慶大霉素對(duì)PluronicF-127溶液溫敏性相轉(zhuǎn)變特性的影響后發(fā)現(xiàn)，PluronicF-127溶液在加入慶大霉素后相轉(zhuǎn)變溫度變化較大，21%—24%的慶大霉素PluronicF-127溶液的溶液-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度分別為33°C、21°C、20。C及19°C。考慮到藥物凝膠制劑在體內(nèi)的應(yīng)用溫度及強(qiáng)度，選擇25%Pluronic溶液作為制劑的輔料濃度進(jìn)行觀察。3.PluronicF-127的體外降解見表1和附圖3。盡管PluronicF127的生物降解性較差，但體外溶蝕性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，載藥和不載藥的25%PluronicF127溶液在37。C條件下7周可分別降解75.32pg和69.73jug，IO周時(shí)降解108.73pg和99.05|ig，適合中耳腔局部應(yīng)用。表137。C條件下25%PluronicF-127及慶大霉素凝膠的體外降解量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.慶大霉素的體外釋放結(jié)果分別見表2_3和附圖4一6。結(jié)合圖表可知，普通制劑(PBS作為溶劑)的對(duì)照組在給藥4小時(shí)以內(nèi)釋放曲線較陡，符合零級(jí)釋放方程；4小時(shí)后釋放曲線漸為平緩。25%PluronicF127制劑釋放曲線較為平緩，符合零級(jí)和Higuchi釋放曲線。25%PluronicF127制劑的體外釋放符合Higuchi釋放曲線，其釋放速率分別為0.6398mg/h1/2。根據(jù)Higuchi提出的可溶性藥物從半固體介質(zhì)中的釋放方程處理本研究藥物釋放數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在達(dá)到給藥總量的50—60%之前，單位面積(S)的藥物累計(jì)釋放量(Q)與釋放時(shí)間的平方根(t1/2)成一定比例Q/S=2C。(Dt/ji)1/2,C。為給藥濃度。藥物累計(jì)釋放量(Q)與釋放時(shí)間的平方根(t"2)的曲線圖見圖6。25%PluronicF127制劑的藥物累計(jì)釋放量(Q)與釋放時(shí)間的平方根(t"基本保持線性關(guān)系，提示藥物的釋放基本上是通過凝膠制劑的擴(kuò)散作用完成的。慶大霉素在25%PluronicF127內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)分別為5.79xl0-5Cm2s—'。表2慶大霉素不同制劑的累計(jì)釋放量(mg)(F±s,n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3慶大霉素制劑不同動(dòng)力學(xué)釋放模型<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Zeroorder0-0.0917t+10.9290.9382普通制劑(PBS)1storderLnQ=0.0007t+3.40030.9256(〉4h)HiguchiQ=0.9397t1/2-8.78180,9710Zeroorder~~Q=0.05t+0.12310.995425%pluronic1storderLnQ=0.0245t-1.19190.8983Higuchi0.6398x—0.9160.9782試驗(yàn)2:體內(nèi)活性研究材料和方法1.材料(1)動(dòng)物及分組健康白毛紅目豚鼠128只，25(T300g，雌雄不限，Preyer，s反射陽性。動(dòng)物隨機(jī)分為2組，一組經(jīng)聽泡注射慶大霉素PBS溶液，一組注射慶大霉素泊洛沙姆407原位凝膠制劑。(2)試劑30mg/ml慶大霉素+25%泊洛沙姆407溶液過濾滅菌(PluronicF-127,BASF公司);Hoechst33342染料;10%福爾馬林溶液;10mmol/LPBS(PH7.4)。(3)儀器及器械顯微手術(shù)器械；TDT-III聽覺電生理檢測(cè)系統(tǒng)(TDTInc，USA);熒光顯微鏡(Olympus，日本)；熒光偏振免疫檢測(cè)儀(TDXsystem,美國(guó)雅培公司)。2.方法(1)手術(shù)方法氯胺酮36mg/kg+lml/kg速眠新II注射液肌肉注射麻醉成功后，耳后切口，分離耳后肌肉及筋膜，暴露聽泡。開放聽泡，暴露圓窗，分別于圓窗龕處注射30mg/ml慶大霉素PBS溶液和30mg/ml慶大霉素+25%泊洛沙姆407溶液。(2)聽功能檢查分別于術(shù)前、及術(shù)后特定時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物前行聽性腦干i秀發(fā)電4立(AuditoryBrainstemResponse,ABR)測(cè)^式。動(dòng)物麻醉后，記錄電極置于豚鼠的顱頂，參考電極置于刺激側(cè)耳垂，地線接對(duì)側(cè)耳垂。采用TDT-III系統(tǒng)，刺激聲為短聲(click),時(shí)程90)is，重復(fù)速率20次/秒，濾波帶寬300—3000Hz，疊加512次，掃描周期20ms。短聲從80dBSPL開始，以5dBSPL遞減，以能分辨出ABRI波的刺激強(qiáng)度確定閾值，并重復(fù)2次，取平均值作為閾值。(3)外淋巴液獲取及檢測(cè)麻醉動(dòng)物聽功能檢測(cè)后，快速斷頭，取出聽泡。用生理鹽水沖洗中耳腔3次，每次均完全吸除殘留液體。確定中耳腔內(nèi)無殘留液體(避免污染外淋巴液樣本)后，圓窗區(qū)用干燥氧氣吹風(fēng)，直至周圍骨質(zhì)干燥及圓窗表面無液體殘留。用E卯endorf吸頭插入圓窗2~3mm,抽取2.00pL外淋巴液。樣本移入含有138pL人血清的微離心管內(nèi)，形成1:70的稀釋液。取30ML稀釋液混入90(iL人血清，形成1:280的混合液。每只動(dòng)物的同一樣本有2種稀釋液。樣本用熒光偏振免疫檢測(cè)法(FPIA)進(jìn)行檢測(cè)。(4)耳蝸基底膜鋪片及毛細(xì)胞核熒光染色術(shù)后ABR檢查后，將麻醉動(dòng)物斷頭取顳骨，2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定耳蝸組織，按常規(guī)耳蝸鋪片方法分離取出基底膜，置于PBS液中備用。Hoechst33342染料用蒸餾水配制成l隨o1/1的儲(chǔ)藏液，避光保存。染色前將儲(chǔ)藏液用PBS稀釋為10ju咖o1/1的染色液，將解剖出的基底膜置于2ml染色液中，避光和室溫下染色10min,然后PBS清洗鋪片。熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞核的變化(熒光激發(fā)波長(zhǎng)337nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm)。結(jié)果藥物動(dòng)力學(xué)資料兩組動(dòng)物的藥物動(dòng)力學(xué)資料見附圖7。附圖7顯示了兩種不同的慶大霉素制劑吸收入內(nèi)耳的動(dòng)力學(xué)模式。經(jīng)鼓室給藥后慶大霉素溶液制劑迅速吸收，24h時(shí)達(dá)到藥物濃度峰值2960Mg/ml，24h后慶大霉素水平快速下降，48h時(shí)外淋巴液中慶大霉素含量為278pg/ml，6d時(shí)無慶大霉素保留。該曲線呈現(xiàn)雙相性，第1個(gè)24h藥物迅速吸收，透過圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳的藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于清除量，隨后慶大霉素不再吸收入內(nèi)耳，而藥物仍繼續(xù)以一級(jí)消除方式消除。在這之間可能有一個(gè)短暫的階段輸入和輸出接近平衡。由于在很短的時(shí)間內(nèi)(48h)藥物已完全消除，因此平衡階段時(shí)間很短。與之相比，原位凝膠組的藥物動(dòng)力學(xué)曲線則比較復(fù)雜。在4h時(shí)由于藥物的突釋作用開始進(jìn)入內(nèi)耳，從而形成一個(gè)藥物峰值為643|ig/ml,然后慶大霉素水平在輕度下降后維持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定上升，隨后在24h~72h之間保持濃度平臺(tái)期，在72h的時(shí)間點(diǎn)后數(shù)天，藥物濃度緩慢下降。這些峰值濃度約為經(jīng)鼓室給藥組的1/3。所有動(dòng)物的對(duì)側(cè)耳和血液中均未檢測(cè)到慶大霉素。表4比較了兩組動(dòng)物不同檢測(cè)時(shí)間段的內(nèi)耳藥物濃度的分布范圍。可以看到，原位凝膠制劑組的每個(gè)時(shí)間段的值均明顯低于水溶液組。這些結(jié)果說明原位凝膠制劑組動(dòng)物任何時(shí)間段內(nèi)耳的慶大霉素濃度變化均低于水溶液組。表4.原位凝膠制劑和水溶液制劑鼓室內(nèi)局部給藥后外淋巴液的慶大霉素濃度分布<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果附圖8顯示2h時(shí)緩釋組和非緩釋組耳蝸外毛細(xì)胞形態(tài)基本正常，僅有散在性細(xì)胞缺失；8h時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞較2h時(shí)缺失增多，但仍表現(xiàn)為散在性缺失，而非緩釋組外毛細(xì)胞幾乎完全缺失；ld時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞核明顯缺失和固縮，而非緩釋組外毛細(xì)胞核逐漸恢復(fù)正常，固縮和腫脹并存；2d時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞核仍表現(xiàn)為明顯缺失和固縮，而非緩釋組外毛細(xì)胞核逐漸恢復(fù)正常，有少量細(xì)胞核表現(xiàn)為固縮和腫脹；4d時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞核表現(xiàn)為逐漸恢復(fù)趨勢(shì)，非緩釋組外毛細(xì)胞核逐漸恢復(fù)正常，有少量細(xì)胞核固縮和腫脹；5d時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞核逐漸恢復(fù)，有少量細(xì)胞核固縮和腫脹，而非緩釋組外毛細(xì)胞核已基本恢復(fù)正常；6d時(shí)緩釋制劑組耳蝸外毛細(xì)胞仍存在片狀的核缺失、固縮和膨脹，非緩釋組外毛細(xì)胞核則基本恢復(fù)正常。這些結(jié)果提示慶大霉素原位凝膠制劑可以延遲藥物對(duì)內(nèi)耳形態(tài)的損傷，但由于凝膠制劑避免了藥物很快流失，藥物持續(xù)釋放至內(nèi)耳，延長(zhǎng)對(duì)靶組織的作用時(shí)間，使得內(nèi)耳形態(tài)不能完全恢復(fù)。功能檢查結(jié)果附圖9比較了鼓室內(nèi)注射不同慶大霉素制劑后動(dòng)物的聽力閾移。所有動(dòng)物在鼓室內(nèi)注射慶大霉素制劑后均出現(xiàn)聽力閾值升高，但非緩釋制劑組動(dòng)物閾移較快，于12小時(shí)達(dá)到最高峰，平均聽力損失60dB，隨著觀察時(shí)限延長(zhǎng)，聽閾逐漸恢復(fù)，至14天時(shí)平均聽力損失僅有5dB。緩釋制劑組動(dòng)物聽力損失緩慢，且程度小于非緩釋制劑組動(dòng)物，24小時(shí)聽力損失達(dá)50dB，并維持該水平數(shù)天，于96小時(shí)開始聽力逐漸恢復(fù)，但恢復(fù)較慢，直至14天時(shí)聽力損失仍保持在12.5dB。試-驗(yàn)3:藥物組合物例1成分量(％重量份)慶大霉素3泊洛沙姆25磷酸鹽緩沖液補(bǔ)至100例2成分量(％重量份)慶大霉素4泊洛沙姆28磷酸鹽緩沖液補(bǔ)至IOO例3成分量(％重量份)慶大霉素i泊洛沙姆23磷酸鹽緩沖液補(bǔ)至100根據(jù)上述具體實(shí)施方案中的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯然可以使用其它的氨基糖苷類藥物替代慶大霉素從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，其它的氨基糖苦類藥物例如包括鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、新霉素等。這些藥物與慶大霉素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性能，它們與泊洛沙姆相混合而形成的組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在整篇申請(qǐng)中，參考了各種公開文獻(xiàn)。為了各種目的，這些公開文獻(xiàn)全部引入本申請(qǐng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可不偏離本發(fā)明范圍和精神而進(jìn)行各種修飾和改變?；诳紤]本文公開的說明書和本發(fā)明實(shí)踐，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。說明書和實(shí)施例意在僅視為是例示性的，在權(quán)利要求中表明了本發(fā)明的真正范圍和精神。權(quán)利要求1、一種藥物組合物，其含有氨基糖苷類抗生素和泊洛沙姆。2、根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中的氨基糖苷類抗生素為慶大霉素。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中泊洛沙姆約占組合物重量的21-40%。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的藥物組合物，其中泊洛沙姆約占組合物重量的25%。5、根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的藥物組合物在制備用于治療的藥物中的用途。6、一種用于治療梅尼埃病凝膠制劑，其含有氨基糖苷類抗生素和泊洛沙姆。7、根據(jù)權(quán)利要求5的凝膠制劑，其中的氨基糖苷類抗生素為慶大霉素。8、根據(jù)權(quán)利要求5或6的凝膠制劑，其中泊洛沙姆約占組合物重量的21-40%。9、根據(jù)權(quán)利要求7的凝膠制劑，其中泊洛沙姆約占組合物重量的25%。10、根據(jù)權(quán)利要求8的凝膠制劑，其中慶大霉素與泊洛沙姆的重量比為3:25。全文摘要本發(fā)明公開了一種含有慶大霉素和泊洛沙姆的凝膠制劑，其含有氨基糖苷類抗生素和泊洛沙姆。在上述的藥物組合物中，泊洛沙姆約占組合物重量的21-40％。優(yōu)選泊洛沙姆約占組合物重量的23-28％，最優(yōu)選約25％。其可用于治療梅尼埃病。文檔編號(hào)A61P27/00GK101428032SQ200710165288公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者馮紅云,孫建軍申請(qǐng)人:孫建軍;馮紅云