專利名稱：鹽霉素elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及檢測鹽霉素含量的試劑盒，特別是檢測動物源性 食品中鹽霉素含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。背景技術：
鹽霉素(Salinomycin)屬于聚醚類獸用抗生素，對大多數革蘭 氏陽性菌和部分霉菌起抗菌作用，單獨使用對雞球蟲病能發(fā)揮良好的預防效果。但使用鹽 霉素不可過量，過量使用將會在動物體內大量蓄積，并會使所食用動物中毒死亡，通過食物 鏈而危及人類健康。2002年12月我國農業(yè)部公告第235號文規(guī)定鹽霉素在肌肉中最高 殘留量為600yg/kg，在皮膚、脂肪中的最高殘留量為1200 μ g/kg，在肝中的最高殘留量為 WOOyg/kg。歐盟自2006年，不再允許鹽霉素-鈉在飼料中添加。因此，檢測鹽霉素在動 物性食品中的殘留量非常重要。目前，常用于鹽霉素殘留檢測的方法主要有微生物法和儀器分析法。微生物檢測 法雖然經濟、操作簡便，但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時，其靈敏度和特異性受到限 制。儀器分析法主要有高效液相色譜分析法(HPLC)、液-質聯(lián)機(LC-MS)、液質串聯(lián)質譜法 (LC-MS/MS)等，這些方法的前處理過程繁瑣、檢測費用較高，不宜用于大量樣本篩查，推廣 使用受到限制。(三)實用新型內容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的鹽霉素 殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術 含量不高，可進行一次連續(xù)多個樣品中鹽霉素殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時 間。本實用新型的技術方案是一種檢測食品中鹽霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包 括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自 封袋、一份說明書和一份質檢報告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶標板作為固相載體， 酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反 應微孔條有8個反應孔，在試劑盒酶標板微孔條上預包被鹽霉素偶聯(lián)抗原制成檢測板，放 入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，以塑料硬膜為蓋板膜，將6瓶Iml梯度濃度的標準品溶液、 Iml高濃度標準品溶液、12ml酶標二抗、7ml鹽霉素抗體工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液 B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復溶液試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和 玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質檢報告一同封 裝在硬紙盒內，以便于攜帶和運輸。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準 分析孔)，既可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回 鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性。檢測時，樣本中的鹽霉素 將和酶標板微孔條上預包被的鹽霉素偶聯(lián)抗原競爭抗鹽霉素抗體，加入酶標二抗后，用TMB 底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含鹽霉素的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其 對應的稀釋倍數，即可得出樣品中鹽霉素含量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度肌肉/肝臟樣本的最低檢測限為5 μ g/ kg、蛋類樣本的最低檢測限為20 μ g/kg;肌肉/肝臟樣本的回收率為75% 士 10% ；蛋類樣 本的回收率為80% 士20%;相對于其他鹽霉素檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、氮氣吹干裝置、渦旋儀、離心機、振蕩機和微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備， 所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于鹽霉素殘留量的檢測。


圖1為本實用新型酶聯(lián)板的側面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型酶聯(lián)板的側面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。
具體實施方式
參見附圖酶標反應微孔條(2)預包被鹽霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標板的外框 支撐架(1)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱 內反應時封蓋酶標反應微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明帽的半透 明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝 50ml濃縮復溶液；白色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6) 的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封 裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試劑瓶(8)用于封裝12ml酶標二抗，綠色帽的白色塑料 試劑瓶(8)用于封裝7ml鹽霉素抗體工作液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用于封裝Iml/ 瓶的標準品溶液及Iml高濃度標準品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個瓶位，放置位置依次 為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復溶液(11)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色 液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml鹽霉素抗體工作液瓶位(16)，12ml酶標二抗瓶 位(15)，6種Iml/瓶各種濃度的標準品溶液及1瓶Iml高濃度標準品溶液瓶位(17)，盒體 為(19)是硬紙盒。本實用新型的實施例一、樣本的前處理1.配液:配液1:8%氯化鈉溶液稱取8. Og氯化鈉加去離子水溶解定容至IOOml 配液2 甲醇-8 %氯化鈉溶液量取80ml甲醇加入到20ml 8%氯化鈉溶液中混勻配液3 :0. 5M氫氧化鈉-8%氯化鈉溶液稱取2. Og氫氧化鈉加8%氯化鈉溶液溶解定容至IOOml配液4:復溶工作液用去離子水將2X濃縮復溶液按1 1體積比進行稀釋(1份2X濃縮復溶液+1 份去離子水)用于提取樣本的復溶，復溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個月。[0027]配液5 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個月。2. (a)肌肉、肝臟樣本處理步驟取適量樣本用勻漿機4000r/min以上勻漿Imin ；稱取2. 0 士0. 05g均質物至50ml 聚苯乙烯離心管中，加入8ml甲醇-8%氯化鈉溶液，用振蕩器劇烈振蕩5min ；3000g以上， 室溫(20-25°C )離心IOmin ；移取2ml上清液加入4ml 0. 5M氫氧化鈉氯化鈉溶液混 合，再加入IOml 二氯甲烷，用振蕩器振蕩5min，3000g以上，室溫(20-25°C )離心IOmin ；除 去上層，取下層5ml至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；用Iml復 溶工作液溶解干燥的殘留物；取50 μ 1用于分析。(b)蛋類樣本處理步驟將蛋清與蛋黃攪拌均勻；量取Iml均質過的蛋樣本至IOml刻度離心管中，加入 5ml乙腈，用振蕩器充分振蕩5min，3000g以上，室溫(20-25°C )離心IOmin ；取上層清液 Iml至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加入Iml復溶工作液，渦 動30s ；取出200 μ 1加入600 μ 1復溶工作液混勻；取50 μ 1用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20_25°C )平衡30min以上，注意每種 液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記 錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品工作液/樣本溶液加標準品工作液/樣本溶液50 μ 1到對應的微孔 中，再加入抗體工作液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25°C避光環(huán)境中反 應 30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、加酶標二抗加入酶標二抗100 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C 避光環(huán)境中反應30min，取出重復洗板步驟6。 8、顯色加入底物液A液50 μ 1/孔，再加底物液B液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用 蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應15min。9、測定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙 波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。三、結果判定結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與鹽霉素含量成負相關。1、用樣本的平均吸光度值與標準品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。 假設樣本ι的吸光度值為0. 611，樣本2的吸光度值為1. 012，標準液吸光度值分別是 0 μ g/L 為 1. 889 ； 1 μ g/L 為 1. 391 ;3 μ g/L 為 0. 947 ；9 μ g/L 為 0. 483 ；27 μ g/L 為 0. 225 ；81 μ g/L為0. 080。則樣本1的濃度范圍是3 μ g/L-9 μ g/L再乘以其對應的稀釋倍數即可 得出樣本中鹽霉素殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是1 μ g/L-3 μ g/L再乘以其對應的 稀釋倍數即可得出樣本中鹽霉素殘留的濃度范圍。2、定量分析(1)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) =- χ 100%
B0B-標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L標準溶液的平均吸光度值(2)標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以鹽霉素標準品濃度(μ g/L)的半對數為橫坐 標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應 的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中鹽霉素實際含量。四、測定前的注意事項1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25°C )會導致所有標準的OD值 偏低。2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性 不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試 劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中 的試劑。6、儲存條件保存試劑盒于2_8°C，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標 準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5 (A450nm < 0. 5)時，表示試劑可能變質。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可 延長反應時間到20min(或更長)，但不得超過30min。反之，則減短反應時間。9、該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度 發(fā)生變化。
權利要求一種鹽霉素ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被鹽霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別6瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，下凹瓶位共15個。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標 板，放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液和高濃度標準品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶標二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料 瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液 用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復溶液用藍色帽 的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔 預包被鹽霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液6瓶，Iml/瓶， 濃度分別為ο μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L，81 μ g/L ；高濃度標準品溶液1瓶， Iml ；酶標二抗1瓶，12ml ；抗體工作液1瓶，7ml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1瓶， 7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶，40ml ；濃縮復溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測動物源性食品中鹽霉素含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、鹽霉素抗體工作液、鹽霉素6個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、高濃度標準品、濃縮復溶液、蓋板膜、自封袋、說明書和質檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的鹽霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗鹽霉素抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中鹽霉素的含量。與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在動物源性食品中鹽霉素的含量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/52GK201628716SQ200920173198
公開日2010年11月10日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權日2009年8月28日
發(fā)明者萬宇平, 何方洋, 余厚美, 馮才偉, 馮才茂, 劉玉梅, 李勇, 汪善良, 羅曉琴, 蒲曉容, 趙正苗 申請人:北京望爾康泰生物技術有限公司;北京望爾生物技術有限公司