專(zhuān)利名稱(chēng)：一種四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電分析化學(xué)、化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種四環(huán)素類(lèi)藥物選擇 性電極的制備方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類(lèi)藥物(Tetracycline，TCs)是一類(lèi)廣譜抗菌藥物，具有十二氫化并四苯 基結(jié)構(gòu)，臨床上主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、支原體、衣原體、立克次體和螺旋體等 致病原引起的感染。TCs主要包括兩大類(lèi)，即天然四環(huán)素類(lèi)包括四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)、 金霉素(CTC)、去甲金霉素(DMC)等，和半合成四環(huán)素類(lèi)包括甲烯土霉素(MTC)、強(qiáng)力霉素 (DC)、二甲胺四環(huán)素(MNC)等，其中最常用的TCs為T(mén)C、0TC、CTC、DC。其以?xún)r(jià)格低、抗菌譜 廣等優(yōu)點(diǎn)，在養(yǎng)殖業(yè)被廣泛用作飼料添加劑，以預(yù)防、控制和治療動(dòng)物疾病。長(zhǎng)期攝入的TCs 在人體內(nèi)逐漸蓄積，可引起急慢性中毒，最終導(dǎo)致多種器官的病變，故許多國(guó)家對(duì)TCs殘留 實(shí)施嚴(yán)格的例行監(jiān)控，我國(guó)規(guī)定動(dòng)物源性食品中TCs的最大殘留量為0. lmg/kg。目前檢測(cè)TCs的常用方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法、微生 物法等。①高效液相色譜法(HPLC)是應(yīng)用最廣泛的定量檢測(cè)TCs的方法，具有高效分離及 高靈敏度檢測(cè)的特性。該方法不足之處是樣品前處理復(fù)雜、需要專(zhuān)業(yè)的操作人員、儀器價(jià)格 昂貴、分析成本高昂、分析速度慢、不適宜于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。②毛細(xì)管電泳法(CE)具有分析速 度快、樣品量少的特點(diǎn)，但儀器價(jià)格昂貴、需要專(zhuān)業(yè)的操作人員、穩(wěn)定性和精密度有待提高。 ③酶聯(lián)免疫法(ELISA)在快速篩查中應(yīng)用最為廣泛，靈敏度較高(約0. 001 0. 005mg/ kg)，適用于現(xiàn)場(chǎng)分析和工業(yè)化檢測(cè)，目前已有檢測(cè)TCs殘留的試劑盒在售。主要不足之處 在于不適用于有色、混濁、粘稠液，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。④微生物法是廣泛應(yīng)用的初篩 TCs的方法，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、適合大批樣品分析、可反映生物效價(jià)，但靈敏度低(檢出 限> :3mg/kg)、選擇性差、存在交叉反應(yīng)。基于離子選擇性電極的電位分析法，具有眾多優(yōu)點(diǎn)所需設(shè)備簡(jiǎn)單，便于現(xiàn)場(chǎng)檢 測(cè)；分析速度較快；能用于有色、混濁、粘稠液，一般不需進(jìn)行化學(xué)分離，操作簡(jiǎn)單迅速； 有較高的選擇性。主要缺點(diǎn)是檢測(cè)限偏高(10_6 10_5mol/L)，不能用于極低濃度樣品 分析，大大限制了其應(yīng)用范圍。采用離子選擇性電極測(cè)定四環(huán)素類(lèi)藥物，已有前人報(bào)道 (Microchem. J.，1987，36 (1) 107，海峽醫(yī)學(xué)，1994，4 (3) :23.)，但靈敏度均較低，檢測(cè)限僅 約相當(dāng)于0. 9 2. ang/kg，難以達(dá)到分析要求。分子印跡技術(shù)是結(jié)合了酶與底物作用的“鎖與鑰匙模型”、抗體形成學(xué)說(shuō)以及 “專(zhuān)一性吸附理論”而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型制備技術(shù)。該技術(shù)制備的分子印跡聚合物 (Molecular Imprinting Polymers, MPs)，具有親和性與選擇性好、抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)、 穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于色譜分離、模擬酶催化、臨床藥物 分析、傳感技術(shù)、膜分離和固相萃取等領(lǐng)域。整體柱通常是指通過(guò)反應(yīng)試劑原位聚合而得 到的棒狀整體聚合物，具有高通透性、多孔性和大的比表面積。將高選擇性的分子印跡技 術(shù)與高通透性的整體柱分離技術(shù)相結(jié)合，制備四環(huán)素類(lèi)藥物分子印跡整體柱已有相關(guān)報(bào)道(Talanta 2009,79 :926 ；中國(guó)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?200810052541. 3)，但均用作固相萃取材料或 液相色譜填料。Pretsch等基于整體柱制備了高靈敏度的金屬離子選擇性電極，檢測(cè)限達(dá) 10"9mol/L(Anal. Chem. 2005,77 :3966)。目前尚未見(jiàn)基于分子印跡整體柱的選擇性電極的制 備方法及其應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。針對(duì)上述幾種測(cè)定TCs方法各自的不足，本發(fā)明提出了一種基于分子印跡整體柱 的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，基于該選擇性電極，采用電位分析法，可以高靈敏 度地檢測(cè)樣品中的四環(huán)素類(lèi)藥物。傳統(tǒng)的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的敏感膜為溶解有電活 性物質(zhì)(四環(huán)素類(lèi)藥物-磷鎢酸鈉締合物或四環(huán)素類(lèi)藥物-四苯硼鈉締合物)的聚氯乙烯 (PVC)膜，當(dāng)樣品濃度極低時(shí)(一般< 10-6mol/L)，出現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)藥物從敏感膜向待測(cè)樣品 溶液中擴(kuò)散的離子通量，導(dǎo)致敏感膜表面的待測(cè)離子濃度高于本體濃度而無(wú)法進(jìn)一步降低 檢測(cè)限。本發(fā)明提出的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，采用如下三個(gè)技術(shù)手段抑制上述的擴(kuò)散 離子通量①在直徑為1 3mm的石英玻璃管中合成四環(huán)素類(lèi)藥物分子印跡整體柱，洗脫模 板分子四環(huán)素類(lèi)藥物后，將溶解有電活性物質(zhì)的PVC溶液吸入該分子印跡整體柱，揮干溶 劑后形成敏感材料。因敏感膜的厚度實(shí)質(zhì)性增加至傳統(tǒng)敏感膜的10倍以上，且整體柱的多 孔結(jié)構(gòu)限制了四環(huán)素類(lèi)藥物在膜中的擴(kuò)散遷移行為，故大大降低了離子擴(kuò)散系數(shù)；②洗脫 模板分子后的分子印跡整體柱內(nèi)部含有四環(huán)素類(lèi)藥物的特異性結(jié)合位點(diǎn)，可高效綁定電活 性物質(zhì)中的四環(huán)素類(lèi)藥物；③內(nèi)充液中加入可與四環(huán)素類(lèi)藥物絡(luò)合的Ca2+，降低了其游離 濃度，有效抑制四環(huán)素類(lèi)藥物與內(nèi)充液中親水性對(duì)離子的共傳輸造成的跨膜離子通量。故 將四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的檢測(cè)限降低至10_9mol/L數(shù)量級(jí)，低于0. 005mg/L(mg/kg)，靈 敏度較高；由于分子印跡整體柱對(duì)模板分子的特異性識(shí)別，故選擇性較高，常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì) 電位測(cè)量均無(wú)影響；線性范圍較寬，為1 X ΙΟ"8 1 X 10-3mol/L ；可直接檢測(cè)有色溶液；檢測(cè) 速度較快，低濃度樣品可于2小時(shí)內(nèi)完成；所需設(shè)備簡(jiǎn)單，便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。上述基于分子印 跡整體柱的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法在其他文獻(xiàn)或?qū)＠芯匆?jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的首要技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有檢測(cè)樣品中四環(huán)素類(lèi)藥物含量 的幾種方法之不足，包括樣品前處理復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，儀器價(jià)格昂貴，分析成本 高昂，分析速度慢，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適宜于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，穩(wěn)定性和精密度不佳，對(duì)樣品本身要求 較高，不適用于有色、混濁、粘稠液，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)果靈敏度較低(檢出限> :3mg/kg)，特 異性不強(qiáng)等，提供一種基于分子印跡整體柱的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其靈敏度高、選擇 性高，可直接檢測(cè)有顏色溶液，檢測(cè)速度較快；精密度和準(zhǔn)確度較高；所使用儀器簡(jiǎn)單，分 析成本低廉。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供相關(guān)的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明為解決首要技術(shù)問(wèn)題而所提出的技術(shù)方案是一種基于分子印跡整體柱的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其特征在于該電極包括 內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管、內(nèi)充液、內(nèi)參比電極、電極桿、環(huán) 氧樹(shù)脂；將內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管的外壁中段粘在電極桿 下端，并密封粘接處，電極桿內(nèi)加入有內(nèi)充液，內(nèi)參比電極插入電極桿并浸沒(méi)于內(nèi)充液中， 用環(huán)氧樹(shù)脂固定內(nèi)參比電極并密封電極桿上端；新制備的電極置于10_6 10_8mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液中活化。所述的四環(huán)素類(lèi)藥物包括四環(huán)素(Tc)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)或強(qiáng)力霉素 (DC)。所述的內(nèi)參比電極為Pt電極或Ag/AgCl電極。所述的內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管是通過(guò)以下方法 制備的①將模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單體甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液 中，超聲溶解，加入致孔劑，攪拌6 他后，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶 氮二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解；其中，模板分子為0. Immol時(shí)，甲醇和丙酮的混合溶液體積 為0. 5 1. 5mL,甲醇所占混合溶液的體積為45 100%；模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單 體、交聯(lián)劑的摩爾比為1 2 10 20 50;功能單體、交聯(lián)劑的總體積與致孔劑的體積 比為1 2 3 4;致孔劑為甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占體積為10 20%; 引發(fā)劑用量為功能單體質(zhì)量的8 20% ；②將上述混合物通氮?dú)? IOmin后，置入內(nèi)徑為1 3mm、長(zhǎng)度為2 5cm的石 英玻璃管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將石英玻璃管封口，置于紫外燈下聚合3 》!，得到內(nèi)含四環(huán)素 類(lèi)藥物分子印跡整體柱的石英玻璃管；⑧截取長(zhǎng)度為0. 5 Icm的上述制得的內(nèi)含四環(huán)素類(lèi)藥物分子印跡整體柱的石英 玻璃管，索式提取除去模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物，45 60°C干燥12 36h，即得內(nèi)含洗脫四環(huán) 素類(lèi)藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取劑為純甲醇；④將上述內(nèi)含洗脫四環(huán)素類(lèi)藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管一端浸入溶 有電活性物質(zhì)的均勻混合物中，快速吸入該均勻混合物，待四氫呋喃揮發(fā)后，即形成內(nèi)含吸 入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管。所述的溶有電活性物質(zhì)的均勻混合物的合成方法，步驟如下取干燥的電活性物質(zhì)、PVC、四氫呋喃和增塑劑加入到試管中，密封后，用渦旋 振蕩器混成均勻混合物；其中，電活性物質(zhì)、PVC和增塑劑的質(zhì)量比為0.5 10 30 35 30 70 ；當(dāng)PVC的質(zhì)量為Img時(shí)，四氫呋喃的體積為30 80 μ L ；增塑劑為以下增塑 劑之一種鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)、 癸二酸二異辛酯(DOS)、鄰硝基苯基辛基醚(o-NPOE)。所述的電活性物質(zhì)的制備方法，步驟為將0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/L磷鎢酸溶液 按摩爾比3 4 1或0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/ L四苯硼鈉溶液按摩爾比1 1 1. 5攪拌下混合，靜置10 12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為 0. 01 0. 05mol/L的鹽酸洗滌5 8次后，45 60°C烘干，即得干燥的電活性物質(zhì)。所述的內(nèi)充液⑵為含10_3 10_6mOl/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物、10—1 10_3mOl/L 的NaCl和KT1 lO^nol/L的CaCl2的混合溶液。本發(fā)明為解決第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為一種基于分子印跡整體柱 的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，其特征在于將內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印 跡整體柱的石英玻璃管的外壁中段粘在電極桿下端，并密封粘接處，電極桿內(nèi)加入內(nèi)充液， 將內(nèi)參比電極插入電極桿并浸沒(méi)于內(nèi)充液中，用環(huán)氧樹(shù)脂固定內(nèi)參比電極并將電極桿上端封口，最后將新制備的電極置于濃度為10_6 10_8mol/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液中活化 48 96h，從而獲得基于分子印跡整體柱的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極；所使用的內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管的制備方法，步 驟如下①將模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單體甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液 中，超聲溶解，加入致孔劑，攪拌6 他后，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶 氮二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解；其中，模板分子為0. Immol時(shí)，甲醇和丙酮的混合溶液體積 為0. 5 1. 5mL,甲醇所占混合溶液的體積為45 100%；模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單 體、交聯(lián)劑的摩爾比為1 2 10 20 50;功能單體、交聯(lián)劑的總體積與致孔劑的體積 比為1 2 3 4;致孔劑為甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占體積為10 20%; 引發(fā)劑用量為功能單體質(zhì)量的8 20% ；②將上述混合物通氮?dú)? IOmin后，置入內(nèi)徑為1 3mm、長(zhǎng)度為2 5cm的石 英玻璃管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將石英玻璃管封口，置于紫外燈下聚合3 》!，得到內(nèi)含四環(huán)素 類(lèi)藥物分子印跡整體柱的石英玻璃管；③截取長(zhǎng)度為0. 5 Icm的上述制得的內(nèi)含四環(huán)素類(lèi)藥物分子印跡整體柱的石英 玻璃管，索式提取除去模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物，45 60°C干燥12 36h，即得內(nèi)含洗脫四環(huán) 素類(lèi)藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取劑為純甲醇；④將上述內(nèi)含洗脫四環(huán)素類(lèi)藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管一端浸入溶 有電活性物質(zhì)的均勻混合物中，快速吸入該均勻混合物，待四氫呋喃揮發(fā)后，即形成內(nèi)含吸 入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管。所述溶有電活性物質(zhì)的均勻混合物的制備方法，步驟依次為取干燥的電活性物質(zhì)、PVC、四氫呋喃和增塑劑加入到試管中，密封后，用渦旋 振蕩器混成均勻混合物；其中，電活性物質(zhì)、PVC和增塑劑的質(zhì)量比為0.5 10 30 35 30 70 ；當(dāng)PVC的質(zhì)量為Img時(shí)，四氫呋喃的體積為30 80 μ L ；增塑劑為以下增塑 劑之一種鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)、 癸二酸二異辛酯(DOS)、鄰硝基苯基辛基醚(o-NPOE)。所述電活性物質(zhì)是由以下方法合成將0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/L磷鎢酸溶液 按摩爾比3 4 1或0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/ L四苯硼鈉溶液按摩爾比1 1 1. 5攪拌下混合，靜置10 12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為 0. 01 0. 05mol/L的鹽酸洗滌5 8次后，45 60°C烘干，即得干燥的電活性物質(zhì)。所述內(nèi)充液為含10—3 IO-6Hiol/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物、10—1 10_3mOl/L的NaCl 和10-1 10_3mOl/L的CaCl2的混合溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于具有下列技術(shù)效果(1)本發(fā)明中提出的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，通過(guò)增加敏感膜的厚度、使用多孔 整體柱材料、高效綁定電活性物質(zhì)中的四環(huán)素類(lèi)藥物于敏感膜中、優(yōu)化內(nèi)充液組成，有效抑 制了四環(huán)素類(lèi)藥物的擴(kuò)散離子通量，降低電極檢測(cè)限至10_9mol/L數(shù)量級(jí)，低于0. 005mg/ L(mg/kg)，靈敏度較高。(2)因分子印跡整體柱對(duì)模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物具有特異性識(shí)別作用，故選擇性較高，常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)電極的電位測(cè)量均無(wú)影響。(3)以本發(fā)明中提出的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極為指示電極，采用電位分析方法， 可以高靈敏度、高選擇性地檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物，檢測(cè)速度較快，能檢測(cè)有色溶液，所需設(shè)備 簡(jiǎn)單，分析成本低廉，可實(shí)現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)藥物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。


圖1為基于分子印跡整體柱的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極示意圖；圖加-i為一系列不同制備方法獲得的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的工作曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于下述實(shí)施 例。實(shí)施例1第一步內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子印跡整體柱的石英玻璃管的制備，步驟如下①將四環(huán)素0. lmmol、甲基丙烯酸0. 6mmol加入1. OmL甲醇和丙酮(1 1)的混合 溶液中，超聲溶解，加入0. 16mL甲苯和1.44mL十二醇，攪拌Mi后，加入4. 5mmol乙二醇二 甲基丙烯酸酯和8mg偶氮二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解，通氮lOmin。②在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將上述混合物加入內(nèi)徑為2mm、長(zhǎng)度為3cm的石英玻璃管中，并 將其封口，置于紫外燈下聚合他，得到內(nèi)含四環(huán)素分子印跡整體柱的石英玻璃管。③截取長(zhǎng)度為0. 5cm的上述制得的內(nèi)含四環(huán)素分子印跡整體柱的石英玻璃管，甲 醇為萃取劑，索式提取除去四環(huán)素，60°C干燥24h，即得內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子印跡整體 柱的石英玻璃管。第二步內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管的制備方法，步 驟如下①電活性物質(zhì)的制備方法將65mL 1. OX 10_2mol/L鹽酸四環(huán)素溶液和20mL 1. 0X10_2mol/L磷鎢酸溶液攪拌下混合，靜置12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為0. Olmol/L的鹽酸 洗滌5 8次后，60°C烘干，即得干燥的電活性物質(zhì)。②取上述干燥的電活性物質(zhì):35mg、PVC 157. 5mg、DBP 157. 5mg、四氫呋喃6mL加入
到試管中，密封后，用渦旋振蕩器混成均勻混合液。③將第一步中制得的內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子印跡整體柱的石英玻璃管一端浸 入上述的均勻混合物中，快速吸入該均勻混合物，待四氫呋喃揮發(fā)后，即形成內(nèi)含吸入有電 活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管。第三步四環(huán)素選擇性電極的制備，步驟如下①將上述制得的吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管外壁中段粘 在電極桿下端，并密封粘接處。②內(nèi)充液的配制配制含10_4mol/L的鹽酸四環(huán)素、10_2mol/L的NaCl和10_2mol/L 的CaCl2的混合溶液。③取內(nèi)充液0. SmL加入電極桿中，將Ag/AgCl電極插入電極桿，并浸沒(méi)于內(nèi)充液液面以下，用環(huán)氧樹(shù)脂固定之并封口，即制得四環(huán)素選擇性電極，如圖1。④將上述制得的電極置入10_8mOl/L的鹽酸四環(huán)素溶液中活化60h。第四步工作曲線的繪制。①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱(chēng)取鹽酸四環(huán)素0. 1205g，用少量水溶解，加入50. OOmL Michaelis緩沖溶液(酒石酸-酒石酸鈉緩沖溶液，pH 2. 8)，去離子水定容至250mL棕色容 量瓶，得10_3mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。再逐級(jí)稀釋成10_4 10_9mol/L鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。②以上述制得的四環(huán)素選擇性電極為指示電極，飽和甘汞電極為參比電極，按照 濃度從低到高的順序，用電位差計(jì)依次測(cè)量?jī)芍щ姌O形成的原電池電動(dòng)勢(shì)E。以四環(huán)素濃度 的對(duì)數(shù)值(Igc)為橫坐標(biāo)，以電動(dòng)勢(shì)E為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，如圖2-a。第五步電極選擇性系數(shù)的測(cè)定。K+、Na+、NH4\ Ca2+、Mn2+、Zn2\ Ba2+、Mg2+、Sr2+、Fe2\ 佝3+、托普霉素、甘氨酸、丙胺酸、 賴(lài)氨酸、葡萄糖、麥芽糖、乳糖等常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)電極電位測(cè)量無(wú)影響。實(shí)施例2模板分子為土霉素，其他同實(shí)施例1，如圖2_b。實(shí)施例3模板分子為金霉素，其他同實(shí)施例1，如圖2-c。實(shí)施例4模板分子為強(qiáng)力霉素，其他同實(shí)施例1，如圖2-d。實(shí)施例5第一步內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子印跡整體柱的石英玻璃管的制備。①將四環(huán)素0. lmmol、甲基丙烯酸0. 4mmol加入1. OmL甲醇和丙酮(8 2)的混合 溶液中，超聲溶解，加入0. 24mL甲苯和1.36mL十二醇，攪拌Mi后，加入3mmol乙二醇二甲 基丙烯酸酯和6mg偶氮二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解，通氮?dú)鈒Omin。②在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將上述混合物加入內(nèi)徑為2mm、長(zhǎng)度為3cm的石英玻璃管中，并 將其封口，置于紫外燈下聚合4h，得到內(nèi)含模板分子四環(huán)素分子印跡整體柱的石英玻璃管。③截取長(zhǎng)度為0. 5cm的上述制得的內(nèi)含模板分子四環(huán)素分子印跡整體柱的石英 玻璃管，甲醇為萃取劑，索式提取除去四環(huán)素，60°C干燥Mh，即得內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子 印跡整體柱的石英玻璃管。其他同實(shí)施例1，如圖2_e。實(shí)施例6第一步內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子印跡整體柱的石英玻璃管的制備。①將四環(huán)素0. lmmol、甲基丙烯酸0. 8mmol加入LOmL甲醇中，超聲溶解，加入 0. 16mL甲苯和1. 44mL十二醇，攪拌6h后，加入2mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯和IOmg偶氮 二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解，通氮?dú)鈒Omin。②在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將上述混合物加入內(nèi)徑為2mm、長(zhǎng)度為3cm的石英玻璃管中，并 將其封口，置于紫外燈下聚合4h，得到內(nèi)含模板分子四環(huán)素分子印跡整體柱的石英玻璃管。③截取長(zhǎng)度為0. 5cm的上述制得的內(nèi)含模板分子四環(huán)素分子印跡整體柱的石英 玻璃管，甲醇為萃取劑，索式提取除去四環(huán)素，60°C干燥Mh，即得內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子 印跡整體柱的石英玻璃管。
其他同實(shí)施例1，如圖2_f。實(shí)施例7電活性物質(zhì)的制備方法將20mL 1.0X 10_2mol/L鹽酸四環(huán)素溶液和25mL 1. 0 X 10_2mol/L四苯硼鈉溶液攪拌下混合，靜置12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為0. 01mol/L的鹽 酸洗滌5 8次后，60°C烘干，即得干燥的電活性物質(zhì)。其他同實(shí)施例1，如圖2_g。實(shí)施例8內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管的制備方法，步驟如下①電活性物質(zhì)的制備方法將65mL 1. OX 10_2mOl/L鹽酸四環(huán)素溶液和20mL 1. 0X10_2mol/L磷鎢酸溶液攪拌下混合，靜置12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為0. Olmol/L的鹽酸 洗滌5 8次后，60°C烘干，即得干燥的電活性物質(zhì)。②取上述干燥的電活性物質(zhì)0. 5mg、PVC 31. 5mg、DOP 68mg,四氫呋喃2. 5mL加入
到試管中，密封后，用渦旋振蕩器混成均勻混合液。③將第一步中制得的內(nèi)含洗脫四環(huán)素后的分子印跡整體柱的石英玻璃管一端浸 入上述的均勻混合物中，快速吸入該均勻混合物，待四氫呋喃揮發(fā)后，即形成內(nèi)含吸入有電 活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管。其他同實(shí)施例1，如圖2_h。實(shí)施例9內(nèi)充液的配制配制含10_5mol/L的鹽酸四環(huán)素、10_3mol/L的NaCl和10_3mol/L的 CaCl2的混合溶液。其他同實(shí)施例1，如圖2_i。應(yīng)用實(shí)施例10第一步樣品處理準(zhǔn)確稱(chēng)取5. Og攪碎的鰻魚(yú)干制品于50ml聚四氟乙烯離心管中，加入 25mLMcllvaine' s緩沖液，振蕩IOmin后，加入5mL三氯乙酸水溶液，以2000r/min的速度 離心2min，等靜置分層后，5000r/min離心20min，上清液用過(guò)濾頭過(guò)濾，再加入IOmL緩沖 液、2mL三氯乙酸溶液，經(jīng)超聲波振蕩提取10min，5000r/min離心IOmin過(guò)濾，重復(fù)一次，合 并過(guò)濾液，將其置于自動(dòng)蒸發(fā)濃縮儀上45°C氮吹濃縮至0. 5mL，用0. Olmol/L檸檬酸溶液定 容至10mL。第二步樣品測(cè)量取上述處理好的樣品溶液lmL，加入2. OOmL Michaelis緩沖溶液，去離子水定容 至IOmL容量瓶中。取上述溶液置于測(cè)量池中，以本發(fā)明制得的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極為 指示電極，飽和甘汞電極為參比電極，用電位差計(jì)測(cè)量?jī)芍щ姌O形成的原電池電動(dòng)勢(shì)E。根 據(jù)工作曲線可得樣品中各種四環(huán)素類(lèi)藥物的濃度。采用本方法和水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法《水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉 素殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》(DB33T 691-2008)，同時(shí)測(cè)定10份加標(biāo)樣品，結(jié) 果如下表1。結(jié)果表明經(jīng)t檢驗(yàn)，本方法測(cè)定結(jié)果與加標(biāo)量、標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯 著性差異(？<0.05)，故本方法可用于含量在1\10_8 1\10_3!1101/1范圍的水產(chǎn)品中四 環(huán)素類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)。
表1本方法測(cè)定結(jié)果與加標(biāo)量、標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果之比較
權(quán)利要求
1.一種四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其特征在于該電極包括內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的 分子印跡整體柱的石英玻璃管(1)、內(nèi)充液O)、內(nèi)參比電極(3)、電極桿(4)和環(huán)氧樹(shù)脂 (5)；將內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管(1)的外壁中段粘在電極 桿⑷下端，并密封，電極桿⑷內(nèi)加入有內(nèi)充液O)，內(nèi)參比電極⑶插入電極桿⑷并浸 沒(méi)于內(nèi)充液⑵中，用環(huán)氧樹(shù)脂(5)固定內(nèi)參比電極(3)并將電極桿⑷上端部封口 ；制備 的電極置于10_6 10_8mOl/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液中活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其特征在于所述的四環(huán)素類(lèi)藥 物包括四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)或強(qiáng)力霉素(DC)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其特征在于所述的內(nèi)參比電極 為Pt電極或Ag/AgCl電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其特征在于所述的內(nèi)充液⑵ 為含IO"3 l(T6mol/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物、KT1 l(T3mol/L的NaCl和KT1 lO^nol/ L的CaCl2的混合溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極，其特征在于所述內(nèi)含吸入有電 活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管(1)是通過(guò)以下方法獲得①將模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單體甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液中， 超聲溶解，加入致孔劑，攪拌6 他后，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮 二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解；其中，模板分子為0. Immol時(shí)，甲醇和丙酮的混合溶液體積為 0. 5 1. 5mL,甲醇所占混合溶液的體積為45 100%;模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單體、 交聯(lián)劑的摩爾比為1 2 10 20 50;功能單體、交聯(lián)劑的總體積與致孔劑的體積比 為1 2 3 4;致孔劑為甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占體積為10 20%;引 發(fā)劑用量為功能單體質(zhì)量的8 20% ；②將上述混合物通氮?dú)? IOmin后，置入內(nèi)徑為1 3mm、長(zhǎng)度為2 5cm的石英玻 璃管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將石英玻璃管封口，置于紫外燈下聚合3 》!，得到內(nèi)含四環(huán)素類(lèi)藥 物分子印跡整體柱的石英玻璃管；③截取長(zhǎng)度為0.5 Icm的上述制得的內(nèi)含四環(huán)素類(lèi)藥物分子印跡整體柱的石英玻璃 管，索式提取除去模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物，45 60°C干燥12 36h，即得內(nèi)含洗脫四環(huán)素類(lèi) 藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取劑為純甲醇；④將上述內(nèi)含洗脫四環(huán)素類(lèi)藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管一端浸入溶有電 活性物質(zhì)的均勻混合物中，快速吸入該均勻混合物，待四氫呋喃揮發(fā)后，即形成內(nèi)含吸入有 電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管(1)；所述溶有電活性物質(zhì)的均勻混合物的合成步驟為取干燥的電活性物質(zhì)、PVC、四氫呋 喃和增塑劑加入到試管中，密封后，混成均勻混合物；其中，電活性物質(zhì)、PVC和增塑劑的質(zhì) 量比為0.5 10 30 35 30 70;當(dāng)PVC的質(zhì)量為Img時(shí)，四氫呋喃的體積為30 80 μ L ；增塑劑為以下增塑劑之一種鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、 鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)、癸二酸二異辛酯(D0Q或鄰硝基苯基辛基醚(ο-ΝΡΟΕ)；所述電活性物質(zhì)是由以下方法獲得的將0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液 與0. 005 0. 02mol/L磷鎢酸溶液按摩爾比3 4 1或0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素 類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/L四苯硼鈉溶液按摩爾比1 1 1. 5攪拌下混合，靜置10 12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為0. 01 0. 05mol/L的鹽酸洗滌5 8次后，45 60°C烘 干，即得干燥的電活性物質(zhì)。
6.一種四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，其特征在于將內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì) 的分子印跡整體柱的石英玻璃管⑴的外壁中段粘在電極桿⑷下端，并密封粘接處，電極 桿內(nèi)加入內(nèi)充液O)，將內(nèi)參比電極(3)插入電極桿并浸沒(méi)于內(nèi)充液O)中，用環(huán) 氧樹(shù)脂(5)固定內(nèi)參比電極C3)并將電極桿(4)上端封口，最后將新制備的電極置于濃度 為10_6 10_8mOl/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液中活化48 96h，從而獲得基于分子印跡整 體柱的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，其特征在于所使用的內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管(1)的制備方法，步 驟如下①將模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單體甲基丙烯酸溶解在甲醇和丙酮的混合溶液中， 超聲溶解，加入致孔劑，攪拌6 他后，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮 二異丁腈，繼續(xù)攪拌至溶解；其中，模板分子為0. Immol時(shí)，甲醇和丙酮的混合溶液體積為 0. 5 1. 5mL,甲醇所占混合溶液的體積為45 100%;模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物、功能單體、 交聯(lián)劑的摩爾比為1 2 10 20 50;功能單體、交聯(lián)劑的總體積與致孔劑的體積比 為1 2 3 4;致孔劑為甲苯和十二醇的混合溶液，其中甲苯所占體積為10 20%;引 發(fā)劑用量為功能單體質(zhì)量的8 20% ；②將上述混合物通氮?dú)? IOmin后，置入內(nèi)徑為1 3mm、長(zhǎng)度為2 5cm的石英玻 璃管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將石英玻璃管封口，置于紫外燈下聚合3 》!，得到內(nèi)含四環(huán)素類(lèi)藥 物分子印跡整體柱的石英玻璃管；③截取長(zhǎng)度為0.5 Icm的上述制得的內(nèi)含四環(huán)素類(lèi)藥物分子印跡整體柱的石英玻璃 管，索式提取除去模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物，45 60°C干燥12 36h，即得內(nèi)含洗脫四環(huán)素類(lèi) 藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管；其中索式提取所用萃取劑為純甲醇；④將上述內(nèi)含洗脫四環(huán)素類(lèi)藥物后的分子印跡整體柱的石英玻璃管一端浸入溶有電 活性物質(zhì)的均勻混合物中，快速吸入該均勻混合物，待四氫呋喃揮發(fā)后，即形成內(nèi)含吸入有 電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管(1)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，其特征在于所述溶 有電活性物質(zhì)的均勻混合物的制備方法，步驟依次為取干燥的電活性物質(zhì)、PVC、四氫呋喃和增塑劑加入到試管中，密封后，混成均勻混合 物；其中，電活性物質(zhì)、PVC和增塑劑的質(zhì)量比為0.5 10 30 35 30 70;當(dāng)PVC的 質(zhì)量為Img時(shí)，四氫呋喃的體積為30 80 μ L ；增塑劑為以下增塑劑之一種鄰苯二甲酸二 丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)、癸二酸二異辛酯(DOS)或 鄰硝基苯基辛基醚(O-NP0E)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，其特征在于所述電 活性物質(zhì)是由以下方法合成將0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/L磷鎢酸溶液按摩 爾比3 4 1或0. 005 0. 02mol/L鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物溶液與0. 005 0. 02mol/L四苯 硼鈉溶液按摩爾比1 1 1. 5攪拌下混合，靜置10 12h，過(guò)濾，沉淀物用濃度為0. 01 ·0. 05mol/L的鹽酸洗滌5 8次后，45 60°C烘干，即得干燥的電活性物質(zhì)；
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極的制備方法，其特征在于所述內(nèi) 充液(2)為含10_3 10_6mOl/L的鹽酸四環(huán)素類(lèi)藥物、10—1 10、ol/L的NaCl和10—1 10_3mol/L的CaCl2的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極及其制備方法，該電極由內(nèi)含吸入有電活性物質(zhì)的分子印跡整體柱的石英玻璃管、內(nèi)充液、內(nèi)參比電極、電極桿、環(huán)氧樹(shù)脂組合構(gòu)成。本發(fā)明通過(guò)采用增加敏感膜的厚度、使用多孔整體柱材料、高效綁定電活性物質(zhì)中的四環(huán)素類(lèi)藥物于敏感膜中、優(yōu)化內(nèi)充液組成，降低電極檢測(cè)限至10-9mol/L數(shù)量級(jí)；又因分子印跡整體柱對(duì)模板分子四環(huán)素類(lèi)藥物具有特異性識(shí)別作用，故選擇性較高，常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)電極的電位測(cè)量均無(wú)影響。以本發(fā)明中提出的四環(huán)素類(lèi)藥物選擇性電極為指示電極，飽和甘汞電極或Pt電極為參比電極，采用電位分析方法，可高靈敏度、高選擇性地檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)藥物，而且設(shè)備簡(jiǎn)單，分析成本低廉，可實(shí)現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)藥物殘留分析。
文檔編號(hào)G01N27/30GK102116758SQ20091015669
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者張會(huì)娜, 段靜, 王邃, 蓋盼盼, 郭智勇, 魏丹毅 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)