專利名稱：：對顯示出對于由成纖維細胞生長因子受體或其變體介導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)敏感的細胞進行鑒定...的制作方法對顯示出對于由成纖維細胞生長因子受體或其變體介導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)敏感的細胞進行鑒定的方法本發(fā)明涉及測定FGFR或其變體的體內(nèi)活化或抑制的方法和/或鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)有敏感性(例如抑制或活化)的細胞(如腫瘤細胞，例如作為腫瘤樣本)的方法、用于所述目的的生物反應(yīng)性識別劑的應(yīng)用、包括它們的試劑盒、檢測它們用于鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞的試劑、和所述在制造此類試劑盒中的應(yīng)用，以及提及的其他應(yīng)用、方法和發(fā)明性實施方案。成纖維細胞生長因子(FGF)組成在多種組織或器官中得到發(fā)育性調(diào)控并表達的超過20種結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽的家族。FGF刺激生殖、細胞遷移和分化并且在骨骼和肢體發(fā)育、傷口治愈、組織修復(fù)、血細胞生成、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)生中起主要作用(綜述見于Ornitz，NovartisFoundSvmp232:63-76;討論76-80,272-82(2001))。由屬于蛋白激酶的受體酪氨酸激酶(RTK)家族的特異性細胞表面受體介導(dǎo)FGF的生物作用。這些蛋白質(zhì)由細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和在結(jié)合FGF時經(jīng)歷磷酸化的細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成。目前鑒定了四種FGF國R:FGF-R1(也稱作Flg,fms樣基因，flt-2，bFGF-R，N-bFGF-R或Cekl)、FGF-R2(也稱作Bek-細菌表達激酶-，KGFR，Ksam,Ksaml和Cek3)、FGF-R3(也稱作Cek2)和FGF-R4。所有成熟的FGF-R都享有由氨基末端信號肽、三個細胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig結(jié)構(gòu)域I、Ig結(jié)構(gòu)域II、Ig結(jié)構(gòu)域III，Ig結(jié)構(gòu)域之間有酸性區(qū)("酸性框"結(jié)構(gòu)域))、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)、激酶結(jié)構(gòu)域組成的共同結(jié)構(gòu)(UHrich和Schlessinger，Cell61:203,1990;Johnson和Williams(1992)Adv.CancerRes.60:1-41)。不同的FGF-R同工型對于不同的FGF配體具有不同的結(jié)合親和性，因而FGF8(雄激素誘導(dǎo)的生長因子)和FGF9(膠質(zhì)細胞活化因子)似乎對FGF-R3具有增加的選擇性(Chellaiah等人，JBiol.Chem1994;269:11620)。近來的發(fā)現(xiàn)顯示出由于FGF-R的突變而增加骨骼異常(包括軟骨發(fā)育不全這一人類侏儒癥的最常見形式)的數(shù)量。FGF-R1、FGF-R2和FGF-R3的不同結(jié)構(gòu)域的特異性位點突變與常染色體顯性人類骨骼發(fā)育異常相關(guān)，將該骨骼發(fā)育異常分類為顱縫早閉綜合征和侏儒綜合征(Coumoul和Deng，BirthDefectsResearch69:286-304(2003)。FGF-R3突變相關(guān)的骨骼發(fā)育異常包括軟骨發(fā)育不良、具有發(fā)育延遲的嚴重軟骨發(fā)育不全和黑棘皮病(SADDAN)以及致死性發(fā)育不全(TD)(Webster等人，TrendsGenetics13(5):178-182(1997);Tavormina等人，Am.J.Hum.Genet"64:722-731(1999))。也在兩種顱縫早閉表型Muenke冠狀煩縫早閉(Bellus等人，NatureGenetics,14:174-176(1996);Muenke等人，Am.J.Hum.Genet.，60:555-564(1997))和Crouzon綜合征伴黑棘皮病(Meyers等人，NatureGenetics,11:462-464(1995))中描述了FGF畫R3突變。Crouzon綜合征與FGF-R2中的特異性位點突變相關(guān)而Pfeiffer綜合征的家族性和散發(fā)性形式都與FGF-R1和FGF-R2中的突變相關(guān)(Galvin等人，PNASUSA,93:7894-7899(1996);Schell等人，HumMolGen，4:323-328(1995))。FGF-R中的突變導(dǎo)致突變受體的組成型活化和增加的受體蛋白酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致細胞和組織不能分化。特別地，軟骨發(fā)育不全突變導(dǎo)致突變受體增強的穩(wěn)定性，從下調(diào)解離受體活化，導(dǎo)致受限制的軟骨細胞突變和骨生長抑制(綜述見于Vajo等人，EndocrineReviews,21(1):23-39(2000))。存在正在累積的關(guān)于在多種類型癌癥中有突變的活化FGF-R3的證據(jù)。在兩種常見上皮癌癥(膀胱癌和子宮頸癌)以及在多發(fā)性骨髓瘤中組成型活化的FGF-R3是FGF-R3在癌中致癌作用的最初證據(jù)。此外，最近的研究報道了在很大比例的良性皮膚腫瘤中存在FGF-R3活化的突變(Logie等人，HumMolGenet2005)。FGF-R3似乎是目前膀胱癌癥中最頻繁突變的癌基因，其在全部膀胱癌病例的幾乎50%和在具有表性膀胱肺瘤的約70%的病例中都突變(Cappellen等人，NatureGenetics1999，23;19-20;vanRhijn等人，CancerResearch2001，61:1265-1268;Billerey等人，Am.丄Pathol.2001，158:1955-1959，WO2004/085676)。另外，在膀胱癌(表性和侵潤性)中報道了FGF-R3的過表達(Gomez-Roman等人，ClinicalCancerResearch2005)。在10-25%的多發(fā)性骨髓瘤病例中報道了作為t(4,14)染色體易位結(jié)果的FGF-R3異常過表達(Chesi等人，NatureGenetics1997,16:260-264;Richelda等人，Blood1997，90:4061畫4070;Sibley等人，BJH2002,118:514-520;Santra等人，Blood2003，101:2374-2476)。在5-10。/。的具有t(4，14)染色體易位的多發(fā)性骨髓瘤中觀察到FGF-R3活化突變并且它與肺瘤it^相關(guān)(Chesi等人，NatureGenetics1997，16:260-264;Chesi等人，Blood,97(3):729-736(2001);Intini等人，BJH2001，114:362-364)。在上下文中，F(xiàn)GF-R3發(fā)信號的結(jié)果似乎是細胞類型特異的。在軟骨細胞中，F(xiàn)GF-R3極度活躍導(dǎo)致生長抑制(綜述見于Omitz,2001)，而在骨髓瘤細胞中，其作用于腫瘤逸艮(Chesi等人，2001)。發(fā)現(xiàn)FGF-R3活性的抑制代表了治療T細胞介導(dǎo)的炎癥或自身免疫疾病的方法，如在T細胞介導(dǎo)的炎癥或自身免疫疾病的治療中，該疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、II型膠原關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼疾(SLE)、銀屑病、幼年型糖尿病、干燥綜合征、曱狀腺疾病、肉狀瘤病、自身免疫性葡萄膜炎、炎癥性腸病(節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)、乳糜瀉和重癥肌無力。參見WO2004/110487。WO03/023004和WO02/102972也描述了FGF-R3突變導(dǎo)致的紊亂。在由FGF-R3以及也由其他FGF-R(尤其是與諸如異常FGF23血清水平相聯(lián)的)所引起的疾病中，進一步應(yīng)提及常染色體顯性低血磷性詢僂病(ADHR)、X染色體連鎖的低血磷性佝僂病(XLH)、肺瘤誘導(dǎo)的軟骨病(TIO)、骨纖維性發(fā)育不良(FH)(也參見X.Yii等人，Cytokine&GrowthFactorReviews16，221-232(2005),和X.Yu等人，TherapeuticApheresisandDialysis9(4)，308-312(2005))。在乳腺癌中牽涉了FGF-R1、FGF-R2和FGF-R4的基因擴增和/或過表達(Penault國Llorca等人，IntJCancer1995;Theillet等人，GenesChrom.Cancer1993;Adnane等人，Oncogene1991;Jaakola等人，IntJCancer1993;Yamada等人，NeuroRes2002)。FGF畫R1和FGF-R4的it^達也與胰腺癌和星形細胞瘤相關(guān)(Kobrin等人，CancerResearch1993;Yamanaka等人,CancerResearch1993;Shah等人，Oncogene2002;Yamaguchi等人，PNAS1994;Yamada等人，NeuroRes2002)。前列腺癌也與FGF-Rlit4J^目關(guān)(Giri等人，ClinCancerRes1999)。血管發(fā)生也涉及FGF/FGF-R。因此，也將把向FGF-R體系預(yù)見為抗血管發(fā)生療法以治療原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移(參見例如Presta等人，Cytokine&GrowthFactorsReviews16,159-178(2005))。在口腔鱗狀細胞癌的情形下，也描述了突變，尤其是在FGF-R3(例如FGF-R3b)中的突變對這些受體的組成型活化起主要作用(參見例如Y.Zhang等人，Int.J.Cancer117，166-168(2005)。報道了FGF-R,尤其是FGF-R1的增強的(尤其是支氣管的)表達與慢性阻塞性肺病(COPD)相關(guān)(參見例如A.Kranenburg等人，J.Pathol.206，28-38(2005))。也描述了抗拮FGF-R,尤其是FGF-R1或FGF-R4的方法可用于治療肥胖、糖尿病和/或與其相關(guān)的疾病，例如代謝綜合征、心血管病、高血壓、異常膽固醇和甘油三酯水平、皮膚病學(xué)紊亂(例如感染、靜脈曲張、黑棘皮病、濕疹、運動耐受不良、2型糖尿病、胰島素耐受性、高膽固醇血癥、膽石癥、整形外科損傷、血栓栓塞性疾病病、冠脈或血管限制(例如動脈粥樣硬化)、日間嗜睡、睡眠呼吸暫停、晚期腎病、膽嚢疾病、痛風(fēng)、熱失調(diào)、受損性免疫應(yīng)答、受損性呼吸功能、創(chuàng)傷后感染、不育癥、肝病、下腰痛、婦產(chǎn)科并發(fā)癥、胰腺炎、中風(fēng)、手術(shù)并發(fā)癥、壓迫性尿失禁和/或胃腸疾病(參見例如WO2005/037235A2)。也描述了在視網(wǎng)膜母細胞瘤的異常發(fā)信號中涉及酸性成纖維細胞生長因子(尤其是FGF-1)和FGF-R1，導(dǎo)致在FGF-1結(jié)合時的增殖(參見例如S.Siffroi-Fernandez等人，Arch.Ophthalmology123，368-376(2005))。顯示了滑膜肉瘤的生長被成纖維細胞生長因子信號途徑的打斷所抑制(參見例如T.Ishibe等人，Clin.CancerRes.11(7)，2702-2712(2005))。此外，也可以在甲狀腺癌的情形下闡明FGF-R的參與。在上面提及的所有情形下，可以合理地期望調(diào)節(jié)FGF-R信號的異常活性(尤其是此種激酶活性的抑制)可用于所提及疾病的治療。無論如何，可以期望具有何時使用藥物進行治療可以預(yù)期是有用的指示，該藥物調(diào)節(jié)(例如抑制或活化)FGF-R信號，并且進一步期望具有標記以允許監(jiān)控FGF-R調(diào)節(jié)以及用該調(diào)節(jié)化合物治療是否有效。尤其希望當用抑制FGF-R信號的藥物治療時具有指示。FRS-2(也稱作SNT1)是用作FGF-R活化和細胞內(nèi)信號途徑之間主要聯(lián)系的脂錨定連接物蛋白質(zhì)(Lin等人，Mol.CellBiol.18:3762-3770，1998;Xu等人，J.Biol.Chem.273:17987-17990，1998;Dhalluin等人，Mol.Cell6:921-929，2000;Ong等人，Mol.CellBiol.20:979-89，2000)。FRS-2包括與FGF-R的近膜區(qū)組成型地相關(guān)聯(lián)的磷酸酪氨酸結(jié)合類別(PTB)的受體識別序列，以及具有多個酪氨酸和絲氨酸磷酸化位點的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。FGF-R活化導(dǎo)致FRS-2酪氨酸殘基磷酸化，其隨后募集Grb2和酪氨酸磷酸酶Shp2而起始MAPK和P13K信號通鋭Xu等人，1998，loc.cit.;Ong等人，2000，loc.cit.;Hadari等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:8578-83,2001)。在破壞FRS-2基因后的小鼠發(fā)育期間觀察到的胚致死表型反應(yīng)了FRS-2在FGF信號中的重要性。此外，F(xiàn)RS-2-缺陷小鼠胚胎成纖維細胞顯示了FGF-誘導(dǎo)的遷移、增殖和MAK活化的損傷(Hadari等人，2001)。發(fā)明概迷出人意料地，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了FRS-2的磷酸化(尤其是酪氨酸磷酸化)狀10態(tài)可以作為生物標記用于此類針對所提及(尤其是增殖性)疾病和紊亂的調(diào)節(jié)化合物的效力尤其顯示了在此類對于FGF-R信號的抑制敏感的細胞中而非在增殖不依賴于FGF-R的那些細胞系中，F(xiàn)RS-2是高度酪氨酸磷酸化的。因此本發(fā)明是基于通過FGFR調(diào)節(jié)物的FGFR抑制導(dǎo)致磷酸化的FRS-2水平降低的發(fā)現(xiàn)。在增殖(例如腫瘤)細胞中，對FGF-R信號抑制進行應(yīng)答的細胞中的FRS-2酪氨酸磷酸化程度當存在FGF-R信號抑制劑時減小，而在不應(yīng)答抑制的細胞中，沒有檢測到酪氨酸磷酸化水平，也就是非常低至零一一或者更通常是不易于通過增加調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)而改變，并且可以期望只有顯示出FRS-2酪氨酸磷酸化的細胞才顯示對于FGF-R信號的抑制有敏感性?；蛘撸胍狥GF-R信號活化時(例如在傷口愈合的情形下)，也可能檢測激活劑(例如FGF衍生物等)是否導(dǎo)致FRS-2、其變體或其包括磷酸酪氨酸的片段的磷酸化的增加，因此指示(于K可期望的)FGF-R信號的活化。因此，在增殖細胞中FRS-2的酪氨酸磷酸化程度(尤其是酪氨酸磷酸化的存在)可以用于區(qū)分在用FGF-R信號調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)治療時能夠反應(yīng)的細胞與對于此種治療不應(yīng)答的細胞。因此，細胞中FRS-2酪氨酸磷酸化狀態(tài)是針對通過FGF-R信號的抑制劑調(diào)節(jié)(尤其是抑制)(例如不期望的)細胞增殖的可能性的生物標記。FRS-2酪氨酸磷酸化的水平也可以用于離體確定FGFR及其變體的調(diào)節(jié)物的活性。此外，F(xiàn)RS-2酪氨酸磷酸化(或者FRS-2、其變體或者其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的同義詞)的測定尤其在鑒定調(diào)節(jié)FGF-R活性(尤其是涉及其活性)的化合物/藥物中是有用的，并且也可用于鑒定可能受益于用FGF-R調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)治療的患者的診斷方法，以及用于監(jiān)控該治療的效力。第一實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞(優(yōu)選分離的，例如在細胞培養(yǎng)物或細胞懸液中，包括分離的細胞，或者來自分離的組織和/或器官，通常來自生物樣品，最優(yōu)選來自患者的細胞)的方法，包括測定在生物樣品中FGF-R底物2(FRS-2)、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化狀態(tài)，其作為針對此類對抑制的敏感性的生物標記。再一實施方案中，本發(fā)明涉及使用在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中鑒定的磷酸化(尤其是磷酸酪氨酸)作為用于細胞或組織或器官(尤其是來自患者的生物樣品的)的生物標記的方法或者涉及在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中鑒定的磷酸化(尤其是磷酸酪氨酸)的應(yīng)用，所述細胞或組織或器官顯示異常活躍，尤其是組成型活化的FGF-R信號，尤其是可用FGF-R或其變體的抑制劑治療和對于此種抑制劑有應(yīng)答，所述方法或應(yīng)用包括通過能夠識別FRS-2中磷酸酪氨酸的生物特異性識別劑，測定來自生物樣品的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中磷酸酪氨酸的存在，F(xiàn)RS-2中磷酸化的陽性發(fā)現(xiàn)表明異?；钴S，尤其是組成型活化的FGF-R信號，并且優(yōu)選地，為了將對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的抑制劑有應(yīng)答的細胞或組織或器官與不應(yīng)答的此類細胞或組織或器官區(qū)分，比較在缺乏和存在由FGF-R或其變體介導(dǎo)的信號的抑制劑時的磷酸化狀態(tài)，在存在抑制劑時的磷酸化降低表示此種應(yīng)答性。本發(fā)明也涉及鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)有敏感性的細胞(優(yōu)選分離的，例如在細胞培養(yǎng)物或細胞懸液中的細胞，包括分離的細胞，或者來自分離的組織和/或器官，通常來自生物樣品，尤其來自患者的細胞)的方法，包括a)將生物樣品與能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑接觸，和b)用能夠識別磷酸4匕狀態(tài)的生物特異性識別劑來測定所述FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中酪氨酸的磷酸化狀態(tài)，和c)將磷酸化狀態(tài)與涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體(尤其是異?；钴S，例如組成型活化形式)的信號的抑制的敏感性和/或癥狀狀態(tài)和/或治療效力相關(guān)聯(lián)，再一實施方案中，本發(fā)明也涉及用于鑒定對于涉及FGF-R或其變體的信號調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的生物樣品(尤其來自患者)的試劑盒，尤其是用于鑒定用FGF-R抑制劑治療有用的患者的試劑盒，包括用于測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的礴酸化狀態(tài)的工具，尤其是用于鑒定生物樣品(優(yōu)選來自患者)中磷酸化的，更尤其是酪氨酸磷酸化的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的工具，作為用于此種對調(diào)節(jié)(尤其是抑制)有敏感性的生物標記；其中優(yōu)選如果該試劑盒允許在缺乏調(diào)節(jié)，更優(yōu)選在缺乏FGF刺激下，更確切地說更優(yōu)選在FGF-R信號的組成型活化的情形下，發(fā)現(xiàn)磷酸化的陽性，這表明對于抑制的敏感性，尤其是相比于沒有抑制劑治療的樣品，如果用抑制劑治療的樣品中磷酸化減少。本發(fā)明的又再一實施方案涉及能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式(尤其是識別其中的磷酸酪氨酸)的生物特異性識別劑(尤其是抗磷酸酪氨酸抗體)的應(yīng)用，或者涉及所述生物特異性識別劑用于鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞，尤其是來自生物樣品，尤其是來自患者，(更尤其是用于鑒定用FGF-R抑制劑治療有用的患者)，其中所述應(yīng)用優(yōu)選包括測定所述FRS-2或其變體或片段的磷酸化狀態(tài)；其中在不存在調(diào)節(jié)下的磷酸化的發(fā)現(xiàn)優(yōu)選意味著可以期望對所述抑制有敏感性；優(yōu)選用于鑒定異常活躍，尤其是非FGF-依賴的活化，更尤其是FGF-R信號的組成型活化。優(yōu)選的是生物特異性識別劑在對于用FGF-R信號抑制劑治療有應(yīng)答的患者的癥狀鑒定中的應(yīng)用或者用于其的生物特異性識別劑，包括鑒定來自所述患者的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括磷酸酪氨酸的片段的磷酸化，尤其是酪氨酸磷酸化。本發(fā)明的另一實施方案涉及測定FRS-2磷酸化(或FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的同義詞)以用于鑒定涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)物(調(diào)節(jié)活性的化合物或藥品)的方法，包括測定在此種調(diào)節(jié)物存在及不存在下FRS-2磷酸化狀態(tài)，并且分別地，如果在加入所述(可能的)調(diào)節(jié)物的情形下發(fā)現(xiàn)所述磷酸化減少，則將該調(diào)節(jié)物指定為信號抑制劑的類別，如果在加入所述調(diào)節(jié)物的情形下發(fā)現(xiàn)所述磷酸化增加，將該調(diào)節(jié)物指定為信號活化物的類別；尤其是用于鑒定顯示出FGF-R信號異?；钴S，尤其是非FGF-依賴的活化，更尤其是組成型活化的細胞。本發(fā)明另一實施方案涉及鑒定可受益于FGF-R調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)治療的患者的診斷方法，或能夠識別FRS-2、其變體或者其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑(特別是抗磷酸酪氨酸抗體)在其中的應(yīng)用，或者在鑒定可受益于FGF-R調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)治療的患者中使用的所述生物特異性識別劑，尤其包括測定沒有抑制劑時來自該患者的生物樣品中是否存在此磷酸化(尤其是表明患者可能受益于抑制劑治療的此種抑制劑的陽性發(fā)現(xiàn))以及優(yōu)選地在存在抑制劑時其在來自此患者的生物樣品中是否減少，或者監(jiān)控用此種FGF-R調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)治療的效力的方法和應(yīng)用，治療，包括測定來自該患者的生物樣品中，在沒有治療而有陽性發(fā)現(xiàn)時，此種磷酸化是否改變，尤其是存在調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)時的減少；優(yōu)選地在鑒定該患者的生物樣品中FGF-R信號的異常活躍，尤其是非FGF-依賴的活化，更尤其是組成型活化的應(yīng)用。本發(fā)明又另一實施方案涉及i貪斷對用FGF-R信號的抑制劑治療有應(yīng)答的(尤其是增殖性)疾病(或患者)的方法，包括鑒定來自患者的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的(優(yōu)選酪氨酸)磷酸化形式，優(yōu)選地用能夠識別FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑，或者涉及所述生物特異性識別劑在所述診斷方法中的應(yīng)用；其優(yōu)選地在鑒定FGF-R信號的異?；钴S，尤其是非FGF-依賴的活化，更尤其是組成型活化中的應(yīng)用。本發(fā)明的又另一實施方案涉及i^斷對于用FGF-R信號的抑制劑治療14不敏感的增殖性疾病的方法，包括鑒定生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的缺乏，優(yōu)選地用能夠識別FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑，或者涉及所述生物特異性識別劑在所述診斷方法中的應(yīng)用。本發(fā)明另一實施方案涉及監(jiān)控患者對于依賴于FGF-R信號的紊亂的治療療法進行應(yīng)答的方法，包括在所述療法前獲得所述患者的生物樣品，分別測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的存在，尤其是磷酸化的程度，并在開始所述療法后獲得一個或多個進一步的生物才羊品并測定所述FRS-2、所述其變體或所述其包括酪氨酸的片段的磷酸化程度是否改變，尤其AA否減少，其中磷酸化程度的減少表明成功的治療。本發(fā)明的又進一步的實施方案涉及能夠識別磷酸化的FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑在制造診斷物中的應(yīng)用，該診斷物用于從生物樣品的細胞或組織中鑒定對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)敏感的細胞，所述鑒定包括測定FGF-R底物2(FRS-2)、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)。又進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及能夠識別磷酸化的FRS-2或其變體或其片段的生物特異性識別劑鑒定細胞的應(yīng)用，該細胞對于鑒定調(diào)節(jié)FGF-R信號的化合物有用。本發(fā)明進一步的實施方案涉及鑒定增殖需要用于增殖的FGF受體活化，尤其是其組成型活化的并且應(yīng)答FGF-R信號抑制的細胞的方法，包括a)將分離細胞或組織的樣品加入缺乏FGF-R抑制劑的培養(yǎng)基，以及將平行樣品加入缺乏FGF，存在FGF-R受體抑制劑的培養(yǎng)基，b)從所述樣品中至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段；c)測定所述樣品中FRS-2的磷酸化狀態(tài)；和d)比較被抑制劑處理的樣品和沒有被處理的樣品中的磷酸化狀態(tài)，存在抑制劑下的磷酸化減少表明適于鑒定可用于治療包括FGF-R信號異?；钴S的癥狀的抑制劑的細胞。過FGF依賴的或非FGF依賴的用于增殖的FGF受體活化(尤其是組成型活化)而增殖。本發(fā)明的再又一實施方案涉及使用能夠識別磷酸化的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑鑒定FGF-R依賴型信號的潛在抑制劑的方法或該生物特異性識別劑的應(yīng)用，包括用所述識別劑從生物樣品中測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，并且在發(fā)現(xiàn)磷酸化的情形下，將存在檢測化合物和其不存在下的磷酸化程度進行比較，磷酸化的降〗氐表明該檢測化合物作為FGF-R依賴型信號的抑制劑的可用性。所有前述方法、應(yīng)用、試劑、試劑盒和本發(fā)明的其他實施方案優(yōu)選地允許鑒定具有可以期望為對于用FGF-R信號調(diào)節(jié)物治療有應(yīng)答的癥狀，尤其是紊亂或疾病的患者，尤其是在FRS-2、其變體、其包括酪氨酸的片段中磷酸-酪氨酸的陽性鑒定的情形下。除非另有指明，否則此處之前以及此處之后使用的一般術(shù)語優(yōu)選地在本公開內(nèi)容的上下文中具有下面的含義一一此處使用(尤其是在權(quán)利要求中)的多種一般表達中任何一種或多種可以獨立于其他術(shù)語而被下面提供的更具體的定義所代替，因而限定了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案顯示出"對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)敏感的"細胞優(yōu)選地指對用所述信號的調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)治療有應(yīng)答的細胞，并且其包括在來自患者的生物樣品中。這些細胞顯示出在FGF-R調(diào)節(jié)物存在下，F(xiàn)RS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化相比于缺乏調(diào)節(jié)物下的磷酸化有改變，尤其是在調(diào)節(jié)物是抑制劑的情形下，發(fā)現(xiàn)磷酸化增加，或者更優(yōu)選地，調(diào)節(jié)物是抑制劑時發(fā)現(xiàn)磷酸化降低。調(diào)節(jié)物(優(yōu)選抑制劑)優(yōu)選是與FGF-R或其變體結(jié)合的分子，并且優(yōu)選地抑制關(guān)于FRS-2或其變體的其蛋白激酶活性，優(yōu)選酪氨酸蛋白激酶活性。"磷酸化狀態(tài)"(或者"磷酸化程度")指在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的一級M酸序列中不存在或者部分或完全存在磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和/或(優(yōu)選且只有)酪氨酸分子。根據(jù)本發(fā)明，磷酸化狀態(tài)是例如將來自罹患依賴于(例如組成型)FGF-R信號(可以顯示存在磷酸化)的諸如疾病或紊亂的癥狀的患者的生物樣品從沒有給出此種依賴性的樣品(可以顯示缺乏或只存在微弱磷酸化)中區(qū)分開的手段。尤其地，在存在和缺乏FGF-R信號調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)下孵育后，通過比較生物樣品的磷酸化狀態(tài)，能夠?qū)⑵渲锌梢哉{(diào)節(jié)(尤其是抑制)FGF-R信號的生物樣品(并且其因而對于此種調(diào)節(jié)物，尤其是抑制劑的治療有應(yīng)答，在抑制劑的情形下，其如果是在沒有抑制劑時發(fā)現(xiàn)磷酸化的情形則在存在抑制劑時此磷酸化得到減少或消除)與其中該調(diào)節(jié)(尤其是抑制)不影響磷酸化狀態(tài)(也就是在抑制劑的情形下，其中存在或缺乏抑制劑時都不存在磷酸化，或者相比于有或沒有抑制劑的樣品，沒有觀察到給定磷酸化的改變)的生物樣品區(qū)分開。更優(yōu)選地，本發(fā)明允許鑒定這樣的細胞，其尤其由于FGF-R信號異?；钴S并且最尤其是由于FGF-R信號的組成型活化，過度增殖并且因此顯示出FRS-2或其變體中酪氨酸磷酸化并因而期望為對于用FGF-R信號抑制劑治療是有應(yīng)答的(如可以通過檢測在FGF-R信號抑制劑存在和不存在下它們的磷酸化狀態(tài)來進一步區(qū)分)，允許將它們從不存在此種磷酸化并且因此不期望FGF-R信號抑制劑治療在其中會成功的細胞中區(qū)分。通常，對于不存在FGF刺激下或在生物樣品中也存在的FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化(尤其是酪氨酸磷酸化)的發(fā)現(xiàn)因而是根據(jù)本發(fā)明高度優(yōu)選的生物標記，并且所有的發(fā)明實施方案都極其最特別地涉l義現(xiàn)顯示出FGF-R或其變體這一類型的異?；钴S，尤其是組成型活性的此種細胞。如果該生物樣品來自患者，在存在和不存在調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)下的磷酸化狀態(tài)(本文中該術(shù)語也可以由術(shù)語"磷酸化程度"代替)和磷酸化的存在或者變異的缺乏因而允許確定患者是否可以受益于調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)的治療(可以將在存在抑制劑時發(fā)現(xiàn)磷酸化減小或無磷酸化，而在不存在抑制劑時發(fā)現(xiàn)較高的磷酸化的那些患者預(yù)測為受益于此種抑制劑的治療)。無論用于本文何處，"磷酸化"優(yōu)選地指酪氨酸磷酸化。患者優(yōu)選溫血動物，更優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類，其易于罹患或正在罹患(至少部分)取決于FGF-R信號過活性，尤其是由于FGF-R信號異?；钴S，尤其是由于FGF-R信號組成型活化，或者因為其他原因(例如對于FGF增大的敏感性和/或增加的FGF水平，增加的FGF-R生物合成等)的癥狀或紊亂。癥狀，特別是選自下面的疾病或紊亂很重要人類侏儒癥的最常見形式的骨骼異常(包括軟骨發(fā)育不全)、分類為顱縫早閉綜合征和侏儒綜合征的骨骼發(fā)育不良，例如軟骨發(fā)育不良、伴有發(fā)育延遲的嚴重軟骨發(fā)育不全以及黑棘皮病(SADDAN)和致死性發(fā)育不全、Miienke冠狀顱縫早閉、Crouzonz綜合征伴黑棘皮病、常染色體顯性〗^fir磷性佝僂病、X染色體連鎖的低血磷性鉤僂病(XLH)、腫瘤誘導(dǎo)的軟骨病、骨纖維性發(fā)育不良。自免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、II型膠原關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘠、銀屑病、幼年型糖尿病、干燥綜合征、曱狀腺疾病、肉狀瘤病、自身免疫性葡萄膜炎、炎癥性腸病(節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)、乳糜瀉和重癥肌無力、口腔鱗狀細胞癌。慢性阻塞性肺病、肥胖、糖尿病和/或涉及其的疾病，例如代謝綜合征、心血管病、高血壓、異常膽固醇和甘油三酯水平、皮膚病學(xué)紊亂(例如感染、靜脈曲張、黑棘皮病、濕疹、運動耐受不良、2型糖尿病、胰島素耐受性、高膽固醇血癥、膽石癥、整形外科損傷、血栓栓塞性疾病、冠脈或血管限制(例如，動脈粥樣硬化)、日間嗜睡、睡眠呼吸暫停、晚期腎病、膽嚢疾病、痛風(fēng)、熱失調(diào)、受損性免疫應(yīng)答、受損性呼吸功能、創(chuàng)傷后感染、不育癥、肝病、下腰痛、婦產(chǎn)科并發(fā)癥、胰腺炎、中風(fēng)、手術(shù)并發(fā)癥、壓迫性尿失禁和/或胃腸疾病。特別重要的是增殖型紊亂，尤其是組織、器官或血細胞的癌癥或腫瘤疾病，例如膀胱或子宮頸的上皮癌癥、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚腫瘤、乳腺癌、胰腺癌、星形細胞瘤、前列腺癌、其中血管發(fā)生起作用的實體腫瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、滑膜肉瘤、甲狀腺癌、進一步的黑素瘤、惡性淋巴瘤、胃腸癌、其它胰臟癌、肺癌、食道癌、肝癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、腦瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、M母細胞瘤、8pll骨髓增生性紊亂或白血??；等。FGF-R是FGF(其也具有變體，例如多于20個基因和若干同工型)的高親和性受體，可以發(fā)現(xiàn)其多種變體。如此處所4吏用，術(shù)語"FGF-R，，尤其是FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3和FGF-R4包括所有能夠磷酸化FRS2以產(chǎn)生其磷酸酪氨酸形式的這些變體，尤其是組成型活化的或者由于與22種已知的成纖維細胞生長因子(FGF)中一種或多種結(jié)合(優(yōu)選具有解離常數(shù)為10—3或更強，更優(yōu)選1(T5或更強，還更優(yōu)選10-7或更強)而活化的、仍舊能夠磷酸化FRS-2以產(chǎn)生其磷酸酪氨酸形式(如用抗磷酸酪氨酸抗體(例如4G10)，或者尤其是通過實施例中的檢測法所闡述)，或者在與WO2006/000420(其因此通過參考這些檢測法而被包括敗及的那些作為FGF-R3(細胞檢測法)或FGF-R3(S^l檢測法)相對應(yīng)的檢測法中顯示出活性(酪氨酸磷酸化)的那些。優(yōu)選地，變體包括約(意味著在使用"約，，時，向各數(shù)值特別地賦予土10%，或優(yōu)選準確地為該數(shù)值)70%或更高同一性，更優(yōu)選至少約85%或更高同一性，還更優(yōu)選約90%或更高同一性，又更優(yōu)選約95%或更高同一性，非常優(yōu)選98%或更高同一性的序列(以氛基酸為準)，優(yōu)選由該序列組成。FGF-R(尤其是FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3或FGF-R4)與其變體之間序列同一性(也稱作同源性)的百分數(shù)優(yōu)選通過普遍用于這一目的使用的計算機程序來確定，例如Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,用于Unix的笫8版,GeneticsCmputerGroup,UniversityReseachPark,MadisonWisconsin,USA,其4吏用SmithandWaterman算法(Adv.Appl.Math.2:482-489(1981)，尤其是使用具有空位開放罰分為12和空位延伸罰分為1的仿射空位檢索。除了FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3和FGF-R4的原始序列以外，用于比較上面給出的所有序列變體的同一性的優(yōu)選M為對于FGF-R1，蛋白質(zhì)序列給出于http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgival=M34185;(登錄號No.M34185);對于FGF-R2,蛋白質(zhì)序列給出于http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nucleotide&val=l08773805(登錄號No.NM—022970NM—022969);對于FGF-R3，蛋白質(zhì)序列給出于http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/entrez/viewer.fcgidb=nucleotide&val=13112047(登錄號No.NM_022965);以及對于FGF-R4，蛋白質(zhì)序列給出于http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&val=47524176(登錄號No.NM_022963)。術(shù)語"變體"包括多種形式，例如尤其是同工型，突變體(非保守的或尤其是保守的，例如替代、缺失和/或添加一個或多個，例如至多10個氨基酸，也包括倒位)，等位變體，基于多態(tài)性的變體，融合蛋白，截短形式(例如相比于全長序列缺少10至50個氛基酸)等。尤其優(yōu)選的是具體在下面段落中提及的突變體、同工型、易位變體對于FGF-R有四種常規(guī)基因，即FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3和FGF-R4，每種包括若干同工型(例如FGF-R1:a，b，c;FGF-R2:b，c;FGF-R3:b，c;FGF-R4:截短形式)?？紤]到多態(tài)性，存在變體(例如對于FGF-R3:R248C(#)、S249C(#)、P250R、N328I、G370/372C(#)、S371/373C、Y373/375C(#)、G375/377C、G380/382R(#)、A391/393E(#)、I538/540V*、N540/542K、T、S或V、K650/652E(#)、K650/652M(#)、K650/652Q(#)、K650/652N、K650/652T(#)、X807/809C、G、L、R、W等，它們中的許多都參與疾病，例如癌癥形成，例如由#標記的那些可以發(fā)現(xiàn)于，例如膀胱癌，和/或骨骼發(fā)育不良，對于FGF-R1和FGF-R2也存在相當?shù)耐蛔?；作為易位的結(jié)果存在融合蛋白，例如FGF-R1:Bcr-FGF畫R1、ZNF198-FGF-R1、CEP110-FGF-R1、FOP畫FGF國Rl、Trim-FGF國R1、MY018A-FGF-R1、TIF1國FGF-R1;FGF曙R2:Tel-FGF-R3(參見例如Eswarakumat等人，J.Cytokine&GrowthFactorReviews16(2005)，139-149)。因此，通常也包括突變體(包括替代、缺失、插入)、同工型、多態(tài)性變體和融合蛋白，例如FGF-R蛋白質(zhì)下述部分的一或多種Ig結(jié)構(gòu)域I、酸性盒、IG結(jié)構(gòu)域II、Ig結(jié)構(gòu)域III、跨膜結(jié)構(gòu)域、激酶l、激酶插入物和/或激酶2。也發(fā)現(xiàn)了不同的FRS-2類型，也稱作SNT(Suc-相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)的酪氨酸-磷酸化靶標)。蛋白質(zhì)的FRS-2家族基本上由FRS-2a(SNT1)和FRS-2p(SNT2)組成，它們是募集含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)Grbl和含有SH2的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)SHP-2的脂錨定的多底物連接物分子。FRS-2a的酪氨酰磷酸化對于FGF-R信號的起始是至關(guān)重要的。本公開內(nèi)容中提及FRS-2處，這也涉及仍舊能結(jié)合FGF-R1、FGF-R2、FGF畫R3和/或FGF陽R4的FRS-2-a(SNT1)和FRS畫2(5(SNT2)的變體，也即尤其是那種與FRS-2a或FRS-2卩具有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少約85%或更高同一性，又更優(yōu)選約90%或更高同一性，還更優(yōu)選約95%或更高同一性，非常優(yōu)選98%或更高同一性的FRS-2變體。FRS-2a或FRS-2P與其變體之間序列同一性(也稱作同源性)的百分數(shù)優(yōu)選通過普遍用于這一目的使用的計算機程序來確定，例如Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,用于Unix的第8版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,MadisonWisconsin,USA,其使用SmithandWaterman算法(Adv.Appl.Math.2:482-489(1981)，尤其是使用具有空位開放罰分為12和空位延伸罰分為1的仿射空位檢索。因此，F(xiàn)RS-2(FRS-2a或FRS-2p)的變體尤其包括同工型，突變體(非保守的或尤其是保守的，例如替代、缺失和/或添加一個或多個，例如至多10個氨基酸，也包括倒位)，等位變體，基于多態(tài)性的變體，融合蛋白，截短形式(例如相比于全長序列缺少10至50個氛基酸)等。尤其優(yōu)選的是FRS-2a和FRS-2p;任何變體必須包括至少一個可進行磷酸化(尤其是酪氨酸磷酸化)的位點。包括酪氨酸的FRS-2片段或其變體是這樣的肽，其具有可以在其鏈上被磷酸化并且仍可以被生物特異性識別劑所識別的一個或多個酪氨酸部分，該部分例如通過諸如S"6柳o^/w附蛋白酶、金黃色葡萄球菌(Sto尸/^;/oc0cc"sflwe"s,蛋白酶、胃蛋白酶、Asp-N畫蛋白酶、月夷凝孚L蛋白酶或胰蛋白酶的蛋白酶的位點特異性蛋白水解切割或通過諸如用bromocyan的化學(xué)切割獲得，優(yōu)選地每種是對獲自生物樣品，尤其是細胞或組織或器官，特別尤其是腫瘤的FRS-2或其變體通過蛋白水解或化學(xué)切割而獲得，該識別劑能夠區(qū)分這些肽的未磷酸化和磷酸化形式，尤其是也能夠從其他肽，例如從其他蛋白質(zhì)區(qū)分這些肽。優(yōu)選地，該片段具有,皮切割的FRS-2原始序列中5個或更多，更優(yōu)選10個或更多個連續(xù)氨基酸，還更優(yōu)選20個或更多，尤其是50個或更多個連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，F(xiàn)RS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的"磷酸化形式"是在所述FRS-2、變體或片段的一級J^酸結(jié)構(gòu)中一個或多個絲氨酸、蘇氨酸或(尤其是)酪氨酸部分磷酸化的形式。術(shù)語"生物樣品"可以例如指體液，例如唾液、血液、血漿、血清、滑液、腹腔積液、肺內(nèi)液或尿，或者更優(yōu)選指細胞、細胞組分或組織或器官樣本(包括來自器官或尤其是肺瘤的樣品)，或其兩種或更多種的混合物，例如組織或器官樣品或者細胞或來自待檢測的細胞、器官或組織的細胞裂解物(例如來自受影響的或推測受影響的細胞、腫瘤或其他組織或器官)。優(yōu)選地，指分離的生物樣品。這些可源于培養(yǎng)物或者可優(yōu)選地獲自患者。在根據(jù)本發(fā)明的方法和應(yīng)用中，通常使用分離的生物樣品，就是說該方法和應(yīng)用優(yōu)選地在不存在患者時進行，例如在分離的實驗室中等等。因此，獲得生物樣品以及其檢驗的步驟可以并且優(yōu)選地為分離的，這種情形下，根據(jù)本發(fā)明的方法或應(yīng)用與取樣或者樣品類型無關(guān)。當本文使用術(shù)語"細胞，，時，這指來自如剛剛定義的生物樣品的細胞、細胞片段或細胞裂解物。一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法或應(yīng)用不包括從患者獲得樣品的步驟，也就是純粹的體外方法或應(yīng)用，也就是體外和缺乏患者的方法或應(yīng)用。另一方面，也包括這一獲得樣品步驟的那些實施方案也是本發(fā)明允許的優(yōu)選的實施方案。"生物特異性識別劑"可以是抗體，在特別的情形下，(尤其是作為二級或三級標記的生物特異性識別分子的情形下)，其也可以是抗體結(jié)合蛋白(例如，來自細菌的蛋白A或蛋白G)，或者它可以是適配體(其包可以被選擇為期望的蛋白并且可以是，例如從組合蛋白質(zhì)文庫中分離的多肽的蛋白質(zhì))。如果未特別說明，本公開內(nèi)容中的上位術(shù)語"抗體"旨在包括多克隆或單克隆抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、或者下述這些形式中的任何一種或多種的片段其仍舊識別，尤其是顯示出對于FRS-2和/或其變體和/或其包括酪氨酸的片段，包括與構(gòu)象或(優(yōu)選地)一級結(jié)構(gòu)之一或兩者都相關(guān)的(例如包括磷酸酪氨酸)表位有(實質(zhì)上或全部選擇性的)結(jié)合親和性，該結(jié)合親和性優(yōu)選具有為10"或者更低的解離常數(shù)K，更優(yōu)選具有10"或者更低的解離常數(shù)K，仍然更優(yōu)選具有10-8或者更低的解離常數(shù)K。因此，"抗體"尤其指這樣的蛋白質(zhì)，其功能上限定為結(jié)合蛋白(能夠與抗原上(與構(gòu)象和/或一級結(jié)構(gòu)相關(guān))的特異表位結(jié)合的分子)而結(jié)構(gòu)上限定為包括本領(lǐng)域技術(shù)人員識別為源自免疫球蛋白編碼基因的框架區(qū)的氨基酸序列。結(jié)構(gòu)上，天然發(fā)生的最簡單的抗體(例如IgG)包括四條多肽鏈、兩個重鏈(H)拷貝和兩個輕鏈(L)拷貝，全部通過二硫鍵共價連接。在H和L鏈的可變(V)區(qū)發(fā)現(xiàn)對于結(jié)合表位的特異性。主要構(gòu)成結(jié)構(gòu)的抗體區(qū)是恒定區(qū)(C)。術(shù)語"抗體"包括整個抗體、還有抗體的結(jié)合片段、修飾或衍生物。其也可以是重組產(chǎn)物，或者雙特異性抗體或者嵌合抗體，例如人源化抗體?？贵w可以是多克隆混合物或(一種以上或尤其是一種)單克隆。他們可以是源自天然來源的完整免疫球蛋白以及可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性(結(jié)合)部分。抗體可以顯示多種形式(矛汴生物)，包括例如，F(xiàn)v(由Vi^和VH結(jié)構(gòu)域組成)、dAB片段(由VH結(jié)構(gòu)域組成；參見Ward等人，Nature341:544-546，1989)、分離的互補決定區(qū)(CDR)、Fab(由VL、VH、CL和Cm結(jié)構(gòu)域組成)、以及F(ab)2(包括在鉸鏈區(qū)由二石雄連接的兩個Fab片段的二價片段)以及單鏈，也可使用單鏈抗體(SCA)，其中重鏈和輕鏈基因組合成單個編碼序列。一些SCA是含有輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)以及連接它們的合適的多肽接頭的重組分子。識別尤其指與各目的分子以高親和性結(jié)合(優(yōu)選特異的，例如以比樣品中任何其他分子高100倍，優(yōu)選1000倍，更優(yōu)選IO，OOO倍地結(jié)合，或者在每種情形下，以比樣品中任何其他分子更低的解離常數(shù)結(jié)合)，例如解離常數(shù)為io-4，更優(yōu)選10—6,還更優(yōu)選10-8或者在每種情形下更低。FRS-2(無論何時使用這一術(shù)語，其都包括FRS-2、其變體(尤其如狀態(tài)的測定可例如包括從生物樣品(例如包括組織裂解液、細胞或細胞片段)(至少部分)純化FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段以及一或多個富集步驟，例如通過傳統(tǒng)色譜法或快速蛋白液相色譜法(FPLC)和/或電泳技術(shù)，例如雙相電泳或特別是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，更優(yōu)選通過對FRS-2特異的生物特異性識別劑(例如抗體，更優(yōu)選多克隆抗體)的免疫沉淀，隨后通過SDS-PAGE，或者通過此類技術(shù)中兩種或更多種的任何適當?shù)慕M合，隨后用識別磷酸化的FRS-2、變體或片段(尤其是其中包括磷酸酪氨酸)的(自身未標記或標記的)生物特異性識別劑對磷酸化的FRS-2、其變體或片段進行篩選來測定磚酸化的(尤其是酪氨酸磷酸化的)FRS-2、其變體或片段的存在或定量的量，或者在FRS-2或變體或片段中的磷酸酪氨酸含量。"部分純化"意指相比于樣品中原始存在的其他蛋白質(zhì)，產(chǎn)生了至少兩倍，更優(yōu)選至少5倍，還更優(yōu)選至少10倍，最優(yōu)選至少25倍的FRS-2、其變體或片段的富集。或者，識別FRS-2的生物特異性識別劑也可結(jié)合固體支撐物(例如膜或反應(yīng)容器，例如多孔板)，例如共價地或通過吸附，與包括待評估的FRS-2的介質(zhì)(例如組織或細胞裂解物)接觸，然后可通過能夠識別并標記磷酸化的FRS-2，尤其其中包括磷酸酪氨酸的生物特異性識別劑來測定結(jié)合了的磷酸化(尤其是酪氨酸磷酸化的)FRS-2的量。24又或者，對于FRS-2的磷酸化形式，尤其是對于磷酸酪氨酸特異的生物特異性識別劑可結(jié)合到固體支撐物(參見下述段)，與包括待評估的FRS-2的介質(zhì)接觸，然后使用能夠識別并標記該結(jié)合的FRS-2的生物特異性識別劑來測定結(jié)合的FRS-2。每種情形下，標記步驟優(yōu)選地包括一種或多種能夠與結(jié)合到其表位的抗體結(jié)合的進一步標記的特異性識別分子，例如標記的蛋白A、標記的蛋白G、標記的鏈親和素、標記的進一步抗體，例如對于抗體的恒定區(qū)等特異的抗體。原則上，一步測定也是可能的，例如用對于FRS-2(包括其變體或片段)的磷酸化形式特異的生物特異性識別劑，并且允許標記和/或分離它。此外，也可能測定樣品中磷酸化(例如，通過只與磷酸化形式結(jié)合的生物特異性識別劑)和未磷酸化(例如通過只與未磷酸化形式結(jié)合的生物特異性識別劑)形式的FRS-2(例如，以便獲得它們的比率)并因此獲得關(guān)于樣品中微細差別的更詳細的信息，包括量化的可能性。用于確定FRS-2的磷酸化狀態(tài)的這些或者多種其他方法是可能的并因此是本發(fā)明的一部分。用于識別劑或FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段，或用于免疫沉淀物的固相支撐物可例如為細胞和免疫化學(xué)中常規(guī)的塑料或者玻璃容器或者平板或多孑L板，或者它們可以是膜，例如硝酸纖維素或PVDF膜。在測定步驟中，對于生物特異性識別劑或與其結(jié)合的進一步標記的特異性識別分子(如上面和下面所限定)，優(yōu)選以常規(guī)方式標記，例如通過酶結(jié)合，例如用過氧化酶，例如^^根過氧化酶，從而允許用常規(guī)反應(yīng)(例如與染料或其他試劑反應(yīng))測定結(jié)合了的過氧化酶綴合的識別劑的存在，例如4吏用SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstrate檢測系統(tǒng)(Pierce,PierceBiotechnology,Inc.,Rockford，IL，USA;#34075，包括用于光密度的魯米那和增強劑)，或用4-氯-l-萘酚和H202、堿性磷酸酶(使用砩酸酶/BCIP-NBT體系)、p-半乳糖苦酶；蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、3-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、a-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶或葡糖淀粉酶染色，用生物素/鏈親合素體系的組分(不與生物特異性識別劑結(jié)合的組分)、顯色劑、熒光物(例如熒光銪螯合物或Cy5)、生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光標記(例如異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白、o-酞醛、熒光胺)或發(fā)射熒光的金屬原子(例如銪或其它鑭系元素)或者放射性標記等來標記，每種情形下，允許已知的并且尤其是本領(lǐng)域公知的標準檢測反應(yīng)，從而允許例如基于酶、著色物、化學(xué)發(fā)光、熒光、生物發(fā)光或放射性(例如熒光)或其他檢測和量化的方法?；蛘撸嬷苯訕擞浥c磷酸化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段結(jié)合的生物特異性識別分子，可使用進一步標記的生物特異性識別分子，例如標記的抗體或細菌蛋白質(zhì)(例如蛋白A或蛋白G)(例如，如剛剛提及的標記)，其例如與已經(jīng)結(jié)合了的生物特異性識別分子(例如抗體)的恒定區(qū)或寡糖結(jié)合(例如標記的抗鼠或抗兔AB)，并因此允許可以使用結(jié)合的抗體的測定，如本領(lǐng)域已知。在每種情形下，可以由生物特異性識別劑(尤其是抗體，尤其是抗磷酸酪氨酸抗體)來特異性識別磷酸化(尤其是酪氨酸磷酸化)FRS-2，其允許特異性識別磷酸化的FRS-2或其包括磷酸化基團的片段的基于構(gòu)象和/或一級結(jié)構(gòu)的表位。"識別，，優(yōu)選指特異性結(jié)合，例如以針對生物特異性識別劑所指明的解離常數(shù)結(jié)合，例如，多種抗磷酸酪氨酸抗體可獲自多種商售來源，適于本發(fā)明的方法。例如，PY國7E1、PY-1B2和PY20是獲自Zymed(SanFrancisco,Calif.)的單克隆鼠抗磷酸酪氨酸抗體，其以商標PY-PLUS.TM.單個或作為混合物銷售。Zymed也提供了親和純化的多克隆兔抗磷酸酪氨酸抗體Z-PYl。鼠抗磷酸酪氨酸抗體，克隆PT-66獲自Sigma(St.Louis,Mo.)。此外，可產(chǎn)單克隆抗磷酸酪氨酸抗體的方法描迷于U.S.專利No.4，543，439，其內(nèi)容，其也可以用于篩選其它抗磷酸酪氨酸抗體)，以及可獲得的抗磷酸酪氨酸抗體在此通過引用作為參考。出于免疫沉淀目的，尤其優(yōu)選可以使用的多克隆或者雙特異性抗體(與抗原(尤其是FRS-2)上兩不同表位結(jié)合)以允許形成大的抗體/抗原聚集物，對于結(jié)合固相支撐物，提及的任何抗體或其仍舊顯示出(尤其是特異性的)結(jié)合活性的衍生物是可行的。一個優(yōu)選的變化方法中，根據(jù)本發(fā)明的方法或應(yīng)用包括首先從生物樣品(至少部分)純化(例如通過沉淀或結(jié)合)FRS-2、其變體或其包括(未磷酸化的或磷酸化的)酪氨酸的片段(此后將任何這些變體都稱作"FRS-2x")，例如使用能夠識別FRS-2x的第一生物特異性識別劑(例如抗體)，然后從該生物特異性識別劑通過諸如SDS-PAGE分離FRS-2x,固定FRS-2x，例如通過將FRS-2x印跡到膜上，然后結(jié)合能夠識別磷酸化的FRS-2x(尤其是磷酸化的酪氨酸)的第二生物特異性識別劑(其自身可為標記的以致不需要進一步的標記反應(yīng)，或者未標記的)，并且(如果第二生物特異性識別劑自身尚未標記)進一步將標記過的生物特異性識別劑(所述標記和標記的生物特異性識別劑可優(yōu)選如上面所定義)與結(jié)合至FRS-2x的第二生物特異性識別劑結(jié)合，并且鑒定結(jié)合的標記過的生物特異性識別劑。因而可以看出樣品中是否存在磷酸化的(尤其是酪氨酸磷酸化的)FRS-2x或者其磷酸化的(尤其是酪氨酸磷酸化的)程度。貫穿^^開內(nèi)容所提及的"包括酪氨酸的片段，，，它們可以是未磷酸化和/或(優(yōu)選)磷酸化的形式。此處使用的免疫沉淀、標記、印跡和其他方法可以推導(dǎo)自標準操作，例如Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988;Coligan等人，CurrentProtocolsinImmunology,WileyInterscience，1991;E.Bast:MikrobiologischeMethoden((MicrobiologicMethods))，第二版，SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg/Berlin,2001;HansGtinterGassen/GangolfSchrimpf(編)，GentechnischeMethoden,第二版,SpektrumAkademiseherVerlag,Heidelberg/Berlin1999),其全部優(yōu)選地通過引用作為參考。根據(jù)本發(fā)明的特殊實施方案，方法或應(yīng)用可包括將來自患者生物樣品的FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的(尤其是酪氨酸)磷酸化狀態(tài)與從沒有顯示出對涉及FGF-R的信號抑制有敏感性的患者和/或從顯示出有此種敏感性的患者獲得的樣品中之前所測定的磷酸化范圍相比較以便確定該磷酸化狀態(tài)是否足以得到針對涉及FGF-R的信號抑制的敏感性。磷酸化比率越高，期望的對FGF-R信號抑制的敏感性越高。當提及時，解離常數(shù)優(yōu)選在pH7.4的磷酸緩沖鹽中測量，該緩沖鹽可以按下面制備可以通過將800gNaCl，20gKC1，144gNa2HP04和24gKH2P04溶解在8L蒸餾水中，并加滿至10L來制備10L的10xPBS母液。pH為6.8，但當稀釋至1xPBS時，其應(yīng)變?yōu)?.4。稀釋時，生成的1xPBS將具有終濃度137mMNaCl，lOmM磷酸鹽，2.7mMKCl，pH7.4。如此處所理解，術(shù)語"生物標記"(或"標記")指其存在和/或濃度可以被檢測并且與已知癥狀(尤其是取決于涉及FGF-R的信號和/或顯示出敏感性的疾病或紊亂狀況)相關(guān)的生物分子(此處尤其是未磷酸化的或磷酸化的FRS-2，或其變體或其包括酪氨酸的片段)。其也包括還允許測定FRS-2或其變體的磷酸化狀態(tài)(尤其包括磷酸酪氨酸)的片段(其例如可通過對FRS-2進行蛋白酶處理(例如用位點特異性蛋白酶)等獲得)。該生物標記差異存在于罹患對于涉及FGF-R或其變體的信號抑制有應(yīng)答的癥狀(例如疾病或紊亂)的患者以及患有對于此種抑制不應(yīng)答的疾病的患者中。本發(fā)明也涉及允許顯示出對于涉及FGF-R或其變體的信號抑制敏感的試劑盒，包括作為對于此種抑制敏感性的生物標記而在生物樣品中用于測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)的工具，尤其是鑒定磷酸化的，尤其是用于鑒定酪氨酸磷酸化的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的工具。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以，例如是用于夾心免疫檢測法(ELISA，包括夾心ELISA或竟爭性ELISA),用于基于熒光的免疫檢測法或用于其它免疫檢測法或酶免疫檢測法，例如基于表面增強激光解吸/離子化(SELDI)的免疫檢測法、Western印跡、免疫沉淀、免疫組化、免疫熒光、放射免疫(RIA)和/或免疫放射分析(IRMA)的試劑盒。此種檢測法需要的組分和成分是本領(lǐng)域已知的，并且根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括至少兩種此組分，其允許鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)。試劑盒可包括生物芯片，例如適于捕獲蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)生物芯片，例如來自CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA，USA)、PackardBioscienceCo.(Meriden，CT，USA)、Zyomyx(Hayward，CA，USA)、Phylos(Lexington,MA，USA)或Biacore(Uppsala,Sweden)，其例如描述于US6,225,047;WO99/51773;US6,329,209;WO00/56934;或US5,242,828中。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括一一作為測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)的工具一一能夠識別，尤其是結(jié)合磷酸化的FRS-2、其變體或其包括(優(yōu)選磷酸化)酪氨酸的片段的生物特異性識別劑，尤其是抗體，更尤其是抗磷酸酪氨酸抗體；以及更優(yōu)選另外一一作為用于至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的工具一一能夠識別，優(yōu)選免疫沉淀FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑，以及用于鑒定所述能夠識別，尤其是結(jié)合FRS-2、其變體或其包括(優(yōu)選磷酸化)酪氨酸的片段的生物特異性識別劑的標記。該標記可以優(yōu)選地是其他生物特異性識別分子的形式，例如如上面所定義，在能夠識別(尤其是結(jié)合)磷酸化的FRS-2、其變體或其包括(磷酸化的)酪氨酸片段的生物特異性識別劑結(jié)合到磷酸化的FRS-2、其磷酸化的變體或其包括磷酸化的酪氨酸的片段的狀態(tài)下，該標記識別(尤其是結(jié)合)該生物特異性識別劑，該標記是按上述標記的，例如標記的蛋白A、標記的蛋白G、標記的鏈親和素、標記的其他抗體，例如特異性針對抗體恒定區(qū)的抗體等等。允許調(diào)節(jié)(尤其是抑制)涉及FGF-R或其變體的信號的化合物是特別的調(diào)節(jié)物，優(yōu)選是特別的抑制劑，其可以例如選自下組(尤其是人源化的)抗體、其片段，單鏈抗體，或尤其是其他化學(xué)劑，尤其是抑制劑，例如US6,774,237(其在此通過引用作為參考，尤其對于落入權(quán)利要求的化合物(終產(chǎn)物)，更優(yōu)選其中具體作為實例提及的化合物)中提及的那些中的一種或多種、3-(2，6-二氯-3，5-二曱絲苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基氨基]-嘧咬-4-基}-1-甲基脲(本文中也稱作抑制劑1，參見實施例1)、其他落入WO2006/000420A(其通過引用作為參考，尤其是對于落入權(quán)利要求的化合物(終產(chǎn)物)，更優(yōu)選其中具體作為實例提及的化合物)的權(quán)利要求，或尤其在其中提及的化合物、PD17307(抑制劑2)、或其他落入專利US5，733，913(其通過引用作為參考，尤其是對于落入權(quán)利要求的終產(chǎn)物，更優(yōu)選其中具體作為實例提及的化合物)的權(quán)利要求，或尤其在其中提及的化合物(終產(chǎn)物)、PD166866(J.Med.Chem.40:2296-2303,1997)。貫穿本說明書的說明和權(quán)利要求，措詞"包括"和"包含"和該措詞的變化，例如"包括了"和"包括有"通常意指"包括但不限于"，并且不旨在(也不會)排除其他部分、添加物、組分、整體或步驟，相反，"含有，，及其變化如"含有了"意指該措詞所修飾的組分或特征就限于所提及的那些。當使用"包括，，或"包括有"時，適當且合理時，可以用"由……組成"代替它。本公開內(nèi)容中對于文章或參考文獻的任何提及并不旨在意指所參考的材料為現(xiàn)有技術(shù)而負面影響本發(fā)明的可專利性及范圍。附圖i兌明圖1:圖中給出的細胞系中的FRS-2酪氨酸磷酸化。將指數(shù)生長期的細胞裂解(參見實施例1)并且用a-FRS-2抗體對全部細胞裂解物進行免疫沉淀，隨后用抗-pTyr抗體或抗-FRS-2抗體免疫印跡，或者直接用實施例1中的表1給出的抗-pFRS2抗體進行免疫印跡。WB=Western印跡，IP=免疫沉淀。圖2:在RT4細胞中，用FGF-R抑制劑PD173074(抑制劑1，參見30實施例l的方法)，在RT112的情形下，用TKI258/CHIR258,4-#j^-5-氟_3-[6-(4-甲基-1-p底噪基)-111-苯并咪唑-2-基]-2(1H)-查啉酮(抑制劑2，參見實施例1的方法)處理后的FRS-2磷酸化的比較分析。按所示處理示出的細胞系。通過用特異性FRS-2抗體免疫沉淀，然后通過抗FRS-2的Western印跡或通過使用檢測FRS2上磷酸化Tyrl96的抗體的Western印跡來測定FRS-2酪氨酸磷酸化。注意FRS-2蛋白通常顯示出由MAPK對絲氨^/蘇氨酸殘基磷酸化而造成的不同的電泳遷移率(Lax等人，Mol.Cell10:709-719，2004)。Inhib.1=抑制劑1，Inhib.2=抑制劑2，DMSO=二甲亞砜。(A)=膀胱癌細胞系RT4(B)=膀胱癌細胞系RT112圖3:在生長因子刺激下，F(xiàn)RS-2酪氨酸磷酸化的比較分析用FGF/肝素(50ng/ml〃5ng/ml)，EGF(10ng/ml)(來自R&DSystems,Inc"Minneapolis,MN，USA;#236-EG-200)或胰島素(5照/ml)(Sigma,Sigma-Aldrich，Inc.,St.Louis，MO，USA;#1882)刺激膀胱癌細胞系RT112以及RT2。裂解細胞并回收全部蛋白質(zhì)裂解物。使用實施例l的表1提及的抗體，通過免疫沉淀然后通過抗pTyr抗體Western印跡來測定FRS-2酪氨酸磷酸化。通過用抗磷MAPK(實施例1的表1中的pMAPK抗體)的Western印跡對全部細胞裂解物檢測MAPK活化。通過用a-MAPK(實施例1的表1中的MAPK)的Western印跡監(jiān)控等量的MAPK蛋白。WB=Western印跡；IP-免疫沉淀；Untr.-未處理的；INS=胰島素。圖1-3中，參考實施例1的表1，當用PTyr抗體進行Western印跡時，將來自SantaCruz的抗體#sc-8318用于免疫沉淀，當用抗FRS-2抗體進行Western印跡時，將抗體#05-502用于免疫沉淀。對于FRS-2進行Western印跡的抗體是來自SantaCruz的弁Sc-8318。"#"表示目錄號。發(fā)明的優(yōu)選實施方案下面，提及本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案-如上面所提及，其他優(yōu)選的實施方案可以通過用上面或?qū)嵤├薪o出的定義來替代描述該實施方案的一個或多個術(shù)語而獲得。(Al)—個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞的方法，包括測定在生物樣品中FGF-R底物2(FRS-2)、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，作為用于對此種抑制敏感的生物標記，其中將FRS-2的酪氨酸磷酸化狀態(tài)用作生物標記。(A2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及才艮據(jù)(A2)的方法，其中將不存在調(diào)節(jié)物(尤其是FGF)下，F(xiàn)RS-2或其變體中(尤其是酪氨酸)磷酸化的陽性發(fā)現(xiàn)，用作對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的抑制可以有效影響信號，尤其是抑制該信號的指示。(A3)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(A2)或(A3)的方法，其中將存在和不存在涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的抑制劑下，孵育后的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的將磷酸化抑制的發(fā)現(xiàn)當作期望的該應(yīng)答的指示。(A4)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Al)-(A3)任一項的方法，其中術(shù)語FGF-R或變體包括由于結(jié)合(優(yōu)選具有解離常數(shù)為10—3或更強，更優(yōu)選為10—5或更強，還更優(yōu)選為10—7或更強)一種或多種成纖維細胞生長因子而活化的，或者優(yōu)選組成型活化的、仍舊能夠磷酸化FRS-2以產(chǎn)生其磷酸酪氨酸形式(如用抗磷酸酪氨酸抗體所闡述)的FGF-R的所有那些形式或變體，并且其包括分別與FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3或FGF-R4之一相比時，有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少85%或更高同一性，還更優(yōu)選90。/o或更高同一性，又更優(yōu)選95%或更高同一性，非常優(yōu)選98%或更高同一性的序列(優(yōu)選由該序列組成)，并且其中術(shù)語FGF-R底物2(FRS-2)、其變體或其包括酪氨酸的片段包括還能夠與FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3和/或FGF-R4結(jié)合的FRS-2的那些形式，尤其是與FRS-2a或FRS-2p具有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少約85%或更高同一性，還更優(yōu)選約90%或更高同一性，又更優(yōu)選約95。/。或更高同一性，非常優(yōu)選98%或更高同一性的FRS-2變體，或其包括磷酸酪氨酸的片段。(A5)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Al)-(A4)任一項的方法，包括至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段，然后用能夠識別FRS-2、其變體或其片段的磷酸化形式，尤其是其中包括的磷酸酪氨酸的生物特異性識別劑來測定磷酸化的，尤其是酪氨酸磷酸化的存在或量，其中標記并且給予所述生物特異性識別劑或者標記在給予后能夠結(jié)合所述生物特異性識別劑的進一步的生物特異性識別分子，從而允許檢測FRS-2或其變體或其片段的磷酸化形式。(A6)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及(A5)的方法，其中生物特異性識別劑是抗體。(A7)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Al)-(A6)任一項的方法，其中將包括磷酸酪氨酸的FRS-2、其包括磷酸酪氨酸的變體，或者其包括磷酸酪氨酸的片段用作生物標記，其指示顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞，并且優(yōu)選包括使用抗磷酸酪氨酸抗體形式的生物特異性識別劑來測定所述FRS-2、其變體或片段中酪氨酸磷酸化的存在或量。(A8)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Al)-(A7)任一項的方法，其中將對于FGF-R信號調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞與非FGF-R依賴地增殖的那些細胞相區(qū)分，尤其是發(fā)現(xiàn)了對抑制敏感的細胞顯示出非FGF依賴的，更尤其是組成型的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化，尤其是酪氨酸磷酸化。(A9)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Al)-(A8)任一項的方法，其中將不存在FRS-2的磷酸化，尤其是不存在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段下，不存在磷酸化當作不期望由FGF-R信號抑制劑來抑制FGF-R信號的證據(jù)。(Bl)或者，本發(fā)明優(yōu)選地涉及將在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中鑒定的磷酸化(尤其是磷酸酪氨酸)用作用于細胞或組織或器官的生物標記的方法或在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中鑒定的磷酸化的應(yīng)用，所述細胞或組織或器官顯示出異常活躍，尤其是組成型活化的FGF-R信號，尤其是可用FGF-R或其變體的抑制劑治療或者對于此種抑制劑有應(yīng)答，所述方法或應(yīng)用包括通過能夠識別FRS-2中磷酸酪氨酸的生物特異的識別劑，測定來自生物樣品的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中磷酸酪氨酸的存在，磷酸化的陽性發(fā)現(xiàn)表明異?；钴S，尤其是組成型活化的FGF-R信號。(B2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)的方法，進一步包括為了將對于涉及FGF-R或其變體的信號的抑制劑有應(yīng)答的細胞或組織或器官與不應(yīng)答的此類細胞或組織或器官區(qū)分，比較不存在以及存在由FGF-R或其變體介導(dǎo)的信號的抑制劑下酪氨酸磷酸化狀態(tài)，存在抑制劑時，酪氨酸磷酸化的降低表示此類應(yīng)答。(B3)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)或(B2)的方法，其中將在存在以及不存在涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的抑制劑下，孵育后的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨細胞，其中將磷酸化部分或者全部抑制(也就是磷酸化減少)的發(fā)現(xiàn)當作期望的該應(yīng)答的指示。(B4)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)-(B3)任一項的方法，其中術(shù)語FGF-R或變體包括由于結(jié)合(優(yōu)選具有解離常數(shù)為10-3或更強，更優(yōu)選為105或更強，還更優(yōu)選為10—7或更強)一種或多種成纖維細胞生長因子而活化的，或者優(yōu)選組成型活化的FGF-R的所有那些形式或變體、其仍舊能夠磷酸化FRS-2以產(chǎn)生FRS-2的磷酸酪氨酸形式(如用抗磷酸酪氨酸抗體所闡述)，并且包括分別與FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3或FGF-R4之一相比時，有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少85%或更高同一性，還更優(yōu)選90。/?；蚋咄恍裕指鼉?yōu)選95%或更高同一性，非常優(yōu)選98%或更高同一性的序列(優(yōu)選由該序列組成)，34并且其中術(shù)語FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段包括還能夠與FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3和/或FGF-R4結(jié)合的FRS-2的那些形式，尤其是與FRS-2a或FRS-2J5具有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少約85%或更高同一性，還更優(yōu)選約90%或更高同一性，又更優(yōu)選約95%或更高同一性，非常優(yōu)選98。/?；蚋咄恍缘腇RS-2變體，或其包括磷酸酪氨酸的片段。(B5)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)-(B4)任一項的方法，包括至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段，然后用能夠識別磷酸酪氨酸的生物特異性識別劑來測定所述FRS-2、所述變體或所述其包括酪氨酸的片段中磷酸酪氨酸的存在或量，其中標記并且給予所述生物特異性識別劑或者能夠結(jié)合所述生物特異性識別劑的進一步的生物特異性識別分子，從而允許檢測FRS-2或其變體或其片段的磷酸化形式。(B6)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及(B6)的方法，其中生物特異性識別劑是抗磷酸酪氨酸抗體。(B7)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)-(B6)任一項的方法，其中將包括磷酸酪氨酸的FRS-2、其包括磷酸酪氨酸的變體，或者其包括磷酸酪氨酸的片段用作生物標記，其指示顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號抑制有敏感性的細胞，并且優(yōu)選包括使用抗磷酸酪氨酸抗體形式的生物特異性識別劑來測定所迷FRS-2、其變體或片段中酪氨酸磷酸化的存在或量。(B8)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)-(B7)任一項的方法，其中將對于FGF-R信號調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞與非FGF-R依賴地增殖的那些細胞相區(qū)分，發(fā)現(xiàn)其中尤其是非FGF依賴的，更尤其是組成型的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化，尤其是酪氨酸磷酸化。(B9)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Bl)-(B8)任一項的方法，其中將不存在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化當作不期望由FGF-R信號抑制劑來抑制FGF-R信號的證據(jù)。(B10)本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案涉及根據(jù)(Bl)-(B10)任一項的方法，包括a)將生物樣品與能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑接觸，和b)用磷酸酪氨酸生物特異性識別劑來測定酪氨酸的磷酸化狀態(tài)，和c)將磷酸化狀態(tài)與對涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)的信號抑制的敏感性和/或癥狀狀態(tài)和/或治療效力相關(guān)聯(lián)。(CI)本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案涉及包括用于FGF-R或其變體的生物特異性識別劑以及能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑的試劑盒，用于從生物樣品(尤其是細胞或組織或器官)鑒定對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)的信號的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞，所述試劑盒包括用于測定生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)(作為對抑制的此類敏感性的生物標記)的工具，包括能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑(尤其是抗磷酸酪氨酸抗體)作為確定磷酸化狀態(tài)的工具以用于從細胞或組織或器官鑒定對涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)的信號的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞，包括測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，尤其是用于允許測定FGF-R信號的異?；钴S，更尤其是FGF-R信號的組成型活化。(C2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)主張(CI)的試劑盒，其中能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑是抗磷酸酪氨酸抗體，并且用于FGF-R或其變體的生物特異性識別劑是單克隆或者多克隆抗體。(C3)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(CI)或(C2)的試劑盒，包括一一作為測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)的工具一一能夠識別，尤其是結(jié)合磷酸化的FRS-2、其變體或包括(優(yōu)選磷酸化)酪氨酸的片段的生物特異性識別劑，尤其是抗體，更尤其是抗磷酸酪氨酸抗體；以及此外——作為用于至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的工具一一能夠識別，優(yōu)選免疫沉淀FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑，以及用于鑒定所述能夠識別，尤其是結(jié)合FRS-2、其變體或其包括磷酸化酪氨酸的片段的生物特異性識別劑的標記。(Dl)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑，以用于鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)(尤其是抑制)敏感的細胞(尤其是來自生物樣品，更尤其是來自患者)，尤其是顯示出FGF-R信號異常活躍，更尤其是組成型活化的細胞，其中所述應(yīng)用優(yōu)選包括測定所述FRS-2或其變體或其片段的磷酸化狀態(tài)；其中在不存在調(diào)節(jié)下發(fā)現(xiàn)的磷酸化優(yōu)選地表明可以期望對于所述抑制的敏感性。更優(yōu)選地，該生物特異性識別劑用于鑒定患者對用FGF-R信號的抑制劑進行治療有應(yīng)答的癥狀。(D2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉;s^艮據(jù)(Dl)的生物特異性識別劑，以用于鑒定顯示出FGF-R信號的異?；钴S，尤其是非FGF依賴的活化，更尤其是組成型活化的細胞。(D3)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Dl)-(D2)中任一項的生物特異性識別劑，其能夠鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式，更優(yōu)選其為抗磷酸酪氨酸抗體。(El)本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案涉及能夠識別磷酸化的FRS-2或用，該診斷物用于從細胞或組織鑒定對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)敏感的細胞，所述鑒定包括測定FGF-R底物2(FRS-2)，其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，其中該生物特異性識別劑能夠鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式，更優(yōu)選抗磷酸酪氨酸抗體。(E2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及才艮據(jù)(El)的應(yīng)用，用于鑒定顯示出FGF-R信號的異?；钴S，尤其是非FGF依賴的活化，更尤其是組37成型活化的細胞。(Fl)本發(fā)明又另一優(yōu)選的實施方案涉及能夠識別磷酸化的FRS-2、其變體或其片段的生物特異性識別劑的應(yīng)用，以鑒定用于鑒別調(diào)節(jié)FGF-R信號的化合物的細胞，其中該生物特異性識別劑能夠鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式，更優(yōu)選為抗磷酸酪氨酸抗體。(F2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)(Fl)的應(yīng)用，包括在存在和不存在已知的FGF-R信號抑制劑下，比較FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化程度，存在抑制劑時，磷酸化的減少表明細胞可用于鑒定其它抑制劑。(Gl)替代的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定增殖需要用于增殖的非FGF依賴的，(尤其是組成型)FGF受體活化并且應(yīng)答FGF-R信號抑制的細胞的方法，包括a)將分離的細胞或組織樣品加入不存在FGF-R抑制劑的培養(yǎng)基，以及在不存在FGF，存在FGF-R受體抑制劑的培養(yǎng)基中加入平行樣品，b)從所述樣品中至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段；c)測定所述樣品中FRS-2的磷酸化狀態(tài)；和d)比較被抑制劑處理的樣品和沒有被處理的樣品中的磷酸化狀態(tài)，存在抑制劑下的磷酸化減少表明適于鑒定可用于治療包括FGF-R信號異常活躍的癥狀的抑制劑的細胞，其中步驟c)中磷酸化狀態(tài)的測定通過能夠鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式的生物特異性識別劑而進行，更優(yōu)選通過抗磷酸酪氨酸抗體而進行。(Hl)本發(fā)明又進一步優(yōu)選的實施方案涉及使用能夠識別磷酸化的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑，以用于鑒定FGF-R依賴性^f言號的潛在抑制劑的方法或所述生物特異性識別劑的應(yīng)用，包括用所述識別劑從生物樣品中測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，在發(fā)現(xiàn)磷酸化的情形下，將存在檢測化合物和其不存在下的磷酸化程度進行比較，磷酸化的降低表明該檢測化合物作為FGF-R依賴型信號的抑制劑的用途，其中該生物特異性識別劑能夠鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式，更優(yōu)選為抗磷酸酪氨酸抗體。(H2)本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案涉;^才艮據(jù)H1的方法或應(yīng)用，其中該生物樣品顯示出FGF-R信號的異?；钴S，尤其是非FGF依賴的活性，更尤其是組成型活性。(II)本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案涉及診斷對于用FGF-R信號抑制劑治療有應(yīng)答的疾病的方法，包括鑒定來自患者的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式，其中所述鑒定優(yōu)選以能夠識別FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式的生物特異性識別劑，尤其是抗磷酸酪氨酸抗體進行。(12)更優(yōu)選根據(jù)(II)的方法鑒定取自患者的生物樣品中FGF-R信號的異?；钴S，尤其是非FGF依賴的活化，更尤其是組成型活化，其優(yōu)選地由鑒定酪氨酸磷酸化的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸部分的片段，尤其是也在EGF或其他FGF-R信號活化劑不存在下而顯示。在所有前面以及下面的實施方案中，缺乏磷酸化的顯示優(yōu)選地用作從生物樣品中鑒定可以期待為對于FGF-R信號抑制不應(yīng)答的細胞，并且因此允許例如鑒定由于在該樣品中獲得的細胞或組織而具有癥狀的患者，并因此鑒定對于FGR-R信號抑制劑治療不應(yīng)答的以及不適于此種治療的患者，并且因此避免該患者不必要地暴露于包括該抑制劑的治療安排，而另一方面尤其允許鑒定基于取自患者的生物樣品(其顯示出優(yōu)選FRS-2、其變體或其包括酪氨酸部分的片段的組成型磷酸化(指例如盡管缺乏FGF或其他FGF-R信號激活物仍然磷酸化)，尤其是酪氨酸磷酸化)的患者，并且鑒定尤其對于FGF-R信號抑制劑有應(yīng)答的(生物樣品在存在抑制劑時顯示出減小的酪氨酸磷酸化)的患者，并且因此可以認為該患者可以適于FGF-R信號抑制劑作為藥物的治療。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的所有的實施方案，其涉及在不存在FGF-R信號調(diào)節(jié)物(尤其是FGF)時生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中酪氨酸磷酸化的陽性鑒定，因為這意味著細胞顯示出FGF-R信號活性(例如異常活躍或組成型活性)，其應(yīng)當易受到FGF-R信號抑制的影響。當可以期待抑制劑對于待治療的癥狀具有有益效果時，來自相應(yīng)患者的生物樣品將顯示該患者在治療時具有減小的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化程度。這是優(yōu)選的情形。然而，反之也亦然，當活化物對于待治療的癥狀具有有益效果時，來自相應(yīng)患者的生物樣品將顯示該患者在治療時具有增加的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化程度。用于本方發(fā)明的方法或應(yīng)用之一的高度優(yōu)選的是實施例中提到的方法和組分，以及其中提及的抗體。本發(fā)明也涉及摘要的內(nèi)容，其因此通過引用作為參考。實施例下面的實施例用于il明本發(fā)明而非限制其范圍。實施例l:免疫沉淀和Western印跡以區(qū)分細胞系中的FRS-2的磷酸化1方法1.1細胞系和細胞培養(yǎng)條件(ATCC:美國典型培養(yǎng)物保藏中心，通過LGCPromochemGmbH，Mercatorstr.51，Wesel，Germany或http:yVwww.lgcpromochem-atcc.com/敘；DSMZ:DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH=德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心，Braunschweig,Germany)。RT112:自原發(fā)性膀胱癌建立人類膀胱移行細胞癌，組織學(xué)分級G2，未記錄時期(Masters等人，CancerRes.46:3630-6，1986)。細胞獲自DSMZACC#418。RT4:自復(fù)發(fā)性膀胱癌建立的人類膀胱移行細胞癌，組織學(xué)分級Gl,T2期(Masters等人，1986，loc.cit.)。細胞獲自ATCC#HTB-2。VMCUB-1:自原發(fā)性膀胱癌建立人類膀胱移行細胞癌。未記錄時期以及組織學(xué)分級(Masters等人，1986，loc.cit.)。細胞獲自DSMZACC#400。J82:自原發(fā)性膀胱癌建立的人類膀胱移行細胞癌，組織學(xué)分級G3，T3期(Masters等人，1986，loc.cit.)。細胞獲自ATCC弁HTB-1。HT1197:自復(fù)發(fā)膀胱癌建立的人類膀胱移行細胞癌，組織學(xué)分級G4，T2期(Masters等人，1986,Ioc.cit.)。細胞獲自ATCC#CRL-1473。在補充有1%L-谷氨酰胺(Amimed#5-10K00曙H),1%MEMNEAA(MEM非必需氨基酸溶液)(Amimed#5-13K00-H),1%丙酮酸鈉(Amimed#5畫60F00-H)和10%FCS(Gibco，InvitrogenAG，Basel，Schweiz，#10082-147的MEMEBS(具有Earls基本鹽的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(Amimed,Allschwil，Switzerland,#l-31F0-I)中生長膀胱癌細胞系。SUM52:源自乳腺癌患者的胸腔積液樣本的人乳腺癌細胞系(Ethier等人，CancerRes.56:899-907，1996;Forozan等人，Br.J.Cancer81:132834，1999)。這一細胞系由Dr.NHynes，F(xiàn)riedrichMiescherInstitute,Basel,Switzerland提供。在補充有1。/。L-谷氨酰胺(Amimed#5-10K00-H)，2%FCS(Gibco#10082-147),0.1%BSA(Gibco#15260-037)，10mMHEPES(Gibco#15630-56),10拜T3(Sigma,Sigma-Aldrich，Inc.,St.Louis,MO,USA,#T6397)，l照/ml氫化可的松(Sigma#H0888)，胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補充劑(Gibco#51500-056)的HAM，SF12(Amimed#l-14F01隱I)中生長SUM52細胞。OPM2和KMSll:來自晚期疾病患者的人類多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞系。OPM2細胞獲自DSMZACC#50。KMSll細胞由Dr.TOtsuki，KawasakiMedicalSchool,Okayama，Japan提供。報道了兩種細胞系都攜帶t(4，14)易位并且表達FGF-IG的突變的、組成型活化形式。特別地，OPM2細胞在激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合袋中帶有突變，這導(dǎo)致笫650位賴氨酸改變成谷氨酸。KMSll細胞在受體的胞外結(jié)構(gòu)域中帶有突變，使第373位酪氨酸改變成半胱氨酸。在補充有1%L-谷氨酰胺(Amimed#5-10K00-H)和20%FCS(Gibco#10082-147)的RPMI1640(Gibco#21875)中生長兩種細胞系。1.2抗體表1列出了用于這一報道中的抗體:表1:抗體一抗<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>WB:Western印跡;IP:免疫沉淀；P-tyr:磷酸酪氨酸SantaCruz:SantCruzBiotechnology,Inc.UpstateBiotechnology:UpstateBiotechnology,Inc.,nowpartofMilliporeCorp.,Billerica，MA，USA.CellSignaling:CellSignalingTechnology,Inc.,Boston,MA，USA.Amersham:Amershamplc，Buckinhamshire，UnitedKingdom,現(xiàn)在是GEHealthcare的一部分。1.3FGF-R抑制性化合物PD173074(此處也稱作抑制劑1)，是來自ParkeDavis的FGF-R特異性抑制劑(參見Mohammadi等人，EMBOJ.17:5896-5卯4)，已經(jīng)確認了其特異性和效能。其具有通式OMe(C2H5)2NOMe,、NNNNHH丄〇ANHTKI258/CHIR258(此處也稱作抑制劑2)，是來自Chiron的FGF-R抑制劑，已經(jīng)確認了其對抗FGFRl、FGFR2和FGFR3的活性。其具有通式H1.4免疫;冗淀/WB在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的1%Triton提M沖液("裂解緩沖43液"50mMTrispH7.5，150mMNaCl,ImMEGTA,5mMEDTA，1%Triton,2mM釩酸鈉，ImMPMSF和來自Hoffmann陽LaRoche,Basel,Switzerland的蛋白酶抑制混合物，#1187358001)中溶解細胞。通過在12000xg離心15min使裂解物澄清并且使用DC蛋白質(zhì)檢測試劑(BioRad，Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA，USA,#500-0116)(基于Bradford,M.的方法，參見Anal.Biochem.,72,248(1976)，利用CoomassieBlue,ICI的檢測法)以及牛血清白蛋白(BSA)標準來測定蛋白質(zhì)濃度。通過用l|Llg圖的標題中所示的抗體于水上孵育等量蛋白質(zhì)來進行免疫沉淀。用蛋白A畫或蛋白G曙sepharose(Sigma,#P-9424;Sigma，#P-3296)收集免疫復(fù)合物并用裂解緩沖液沖洗3次。通過在2x樣品緩沖液(20%SDS，20%甘油，160mMTrispH6.8,4%p-巰基乙醇，0.04%溴酚蘭)中煮沸來釋放結(jié)合的蛋白質(zhì)。將樣品(全部細胞裂解物或免疫復(fù)合物)進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并且將蛋白質(zhì)印跡在聚氟乙烯(PVDF)膜上。力口入一抗前，在20%馬血清(inVitromex，Geilenkirchen，Germany;#S0921)中在封閉濾紙，或者在a-FGF-R3(抗-FGF-R3抗體，"a-X，，通常表示抗X抗體,X表示抗體靶標)，細胞周期蛋白Dl或微管蛋白Western印跡情形下，用5%奶封閉。4吏用SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstrate檢測體系(Pierce,PierceBiotechnology,Inc.,Rockford，IL，USA;#34075，包括用于光強度的魯米那和增強劑)，用過氧化酶偶聯(lián)的抗鼠或抗兔AB使蛋白質(zhì)可視化。于60。C，在62.5mMTris-HClpH6.8;2%SDS;1/125P-巰基乙醇中洗脫膜30min。2結(jié)果2.1在依賴于FGF-R信號用于增殖的癌細胞系中FRS-2是酪氨酸磷酸化的由于FRS-2是FGF-R的底物，檢測了對于FGF-R抑制劑敏感的細胞系中FRS-2的磷酸酪氨酸水平，并且相對于抗性細胞系，推測具有高FGF-R活性。膀胱癌細胞系RT4和RT112，多發(fā)性骨髓瘤系OPM2和KMS11，以及乳腺癌系SUM52依賴于FGF-R之一并且它們的生長受到抑制劑1和/或抑制劑2的抑制。相反，膀胱癌系J82、VMCUB1或HT1197對于抑制劑1和抑制劑2的抑制有抗性。具體地，分別使用特異性抗體sc-121(SantaCruz)、sc-122(SantaCruz)和sc-124(SantaCruz)，通過Western印跡測定FGF-R1、FGF-R2和FGF-R4表達。為了測定FGF-R3的表達，首先用來自Sigma的抗體F-0425來免疫沉淀FGF-R3，然后使用來自Sigma的抗體F-0425對免疫復(fù)合物進行Western印跡。在96孔板中測量細胞增殖。在上面給出的生長培養(yǎng)基中以每孔lOOjil的體積接種細胞。對于RT112、RT4和SUM52,以8500個細胞/孑L接種，對于VMCUBl、J82、HT1197和KMSll，以5000個細胞/孔接種，對于OPM2,以30000個細胞/孔接種。接種24h后，分別加入含有FGF-R抑制劑1、FGFR抑制劑2或者(作為對照)DMSO的培養(yǎng)基。72h后，室溫(RT)加入25pl/孔的戊二醛(20%)固定細胞10min。然后用200^1/孔H20洗滌細胞兩次并加入lOO^il的亞甲基藍(0.05%)。RT孵育10min后，用200pl/孔H20洗滌細胞3次。加入20(Vl/孔HC1(3%)并于RT在板振蕩器上醉育30min，測量650nm處的光密度(OD)。使用Excel組件來計算提供50%增殖抑制的抑制劑l的濃度。表2總結(jié)了結(jié)果。對于每種給出的細胞系，如上面所示表征了FGF-R依賴性以^t抑制劑1和/或抑制劑2的敏感性。通過增殖檢測的手段評估了抑制劑1和抑制劑2對于細胞生存力的影響；所示的IC50為若干獨立檢測法的平均IC50(以N給出他們的數(shù)量)。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>癌癥類型細胞系抑制劑1IC50(nM)±SDn抑制劑2IC50(nM)±SDnRT11214±3760±205RT428±815134±584膀脫癌VMCUBl>30002>20003J82>30002>30002HT1197>30002>30002乳腺癌S畫52NDl卯±584多發(fā)性O(shè)PM2148±319ND骨髓瘤KMS1150±144931SD:標準差ND:未測定在所有對FGF-R抑制劑敏感的細胞系中，F(xiàn)RS-2-磷酸酪氨酸水平都升高，但是在抗性細胞系J82、HT1197、VMCUBl中未檢測到FRS-2-磷酸酪氨酸水平或者非常低(圖1)。2.2FGF-R抑制阻斷了FRS-2酪氨酸磷酸化特異性FGF-R-抑制劑抑制劑1和FGF-R抑制劑抑制劑2消除了在顯示為由該化合物抑制生長的癌細胞系中的FRS-2酪氨酸磷酸化。這一結(jié)果表明這些細胞系中，F(xiàn)GF-R負責(zé)FRS-2磷酸化(圖2)。按圖2的標題以及圖2所示處理所示出的癌細胞系。注意FRS-2蛋白經(jīng)常顯示出由于MAPK對絲氨^/蘇氨酸殘基的磷酸化而造成的不同的電泳遷移率(Lax等人，2002)。2.3FGF-R而非EGF-R或INS-R配體資導(dǎo)了FRS-2磷酸化檢測了與FGF-R無關(guān)的其他RTK的活化是否也可以調(diào)節(jié)FRS-2磷酸46化。在RT112細胞中，EGF和胰島素活化MAPK，然而，他們沒有誘導(dǎo)磷酸-FRS-2。類似地，在RT4細胞中，EGF強烈地誘導(dǎo)pMAPK而非磷酸-FRS-2。如所期待的，aFGF有效地增加細胞系中的FRS-2磷酸酪氨酸(圖3)。3討論顯示了FRS-2是FGF-R家族成員的下游底物并且作為用于FGF-R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所涉及的多種蛋白質(zhì)的對接分子起至關(guān)重要的作用。鑒定了一組呈現(xiàn)出顯著升高的磷酸-FRS-2水平并且對于FGF-R抑制非常敏感的人類癌癥細胞系，表明了在這些細胞系中有活化的FGF-R-FRS-2信號。作為對它的證明，特異性的FGF-R抑制劑抑制劑1徹底抑制了FRS-2鱗酸化。此外，只有FGF-R配體(aFGF)而非EGF-R或INS-R配體可以進一步增加FRS-2磷酸化。因此，這些結(jié)果證明磷酸-FRS-2作為生物標記來選擇細胞類型，尤其是患者細胞類型是有用的，并且因此選擇具有組成型FGF-R信號及因此具有潛能來應(yīng)答FGF-R抑制劑的患者群體。此外，可以篩選用于對抑制劑進行實驗的細胞系，因此允i午建立用于篩選潛在藥物的適合的檢測體系。權(quán)利要求1.一種鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號調(diào)節(jié)，尤其是抑制敏感的細胞的方法，包括測定在生物樣品中FGF-R底物2(FRS-2)、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，作為針對此類對抑制的敏感性的生物標記。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將FRS-2的酪氨酸的磷酸化狀態(tài)作為生物標記。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中將不存在調(diào)節(jié)物時FRS-2或其變體中砩酸化，尤其是酪氨酸磷酸化的陽性發(fā)現(xiàn)用作涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的抑制可以有效地影響信號，尤其是有效地抑制信號的指示。4.才艮據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中將存在和不存在涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的抑制劑時，孵育后的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)進行比較以便鑒定對于給予該抑制劑有應(yīng)答的細胞，其中將磷酸化的抑制的發(fā)現(xiàn)當作該可期望應(yīng)答的指示。5艮據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中術(shù)語FGF-R或變體包括FGF-R的所有那些形式或變體，其由于結(jié)合一一優(yōu)選具有解離常數(shù)為10-3或更強，更優(yōu)選為It)—5或更強，還更優(yōu)選為10-7或更強---種或多種成纖維細胞生長因子而活化，或者優(yōu)選組成型活化，仍舊能夠磷酸化FRS-2以產(chǎn)生其磷酸酪氨酸形式，如用抗磷酸酪氨酸抗體所闡述，并且其包括當分別與FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3或FGF-R4之一相比時，有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少85%或更高同一性，還更優(yōu)選90%或更高同一性，又更優(yōu)選95%或更高同一性，非常優(yōu)選98。/?；蚋咄恍缘男蛄?，優(yōu)選由該序列組成，并且其中術(shù)語FGF-R底物2(FRS-2)、其變體或其包括酪氨酸的片段包括還能夠與FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3和/或FGF-R4結(jié)合的FRS-2的那些形式，尤其是與FRSJa或FRS-鄰具有70%或更高同一性，更優(yōu)選至少約85%或更高同一性，還更優(yōu)選約90%或更高同一性，又更優(yōu)選約95%或更高同一性，非常優(yōu)選98。/?；蚋咄恍缘腇RS-2變體，或其包括磷酸酪氨酸的片段。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項的方法，包括至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段，然后用能夠識別FRS-2、其變體或其片段的磷酸化形式，尤其是其中包括的磷酸酪氨酸的生物特異性識別劑來測定磷酸化的，尤其是酪氨酸磷酸化的存在或量，其中標記并且給予所述生物特異性識別劑或者在給予后能夠結(jié)合所述生物特異性識別劑的進一步的生物特異性識別分子，從而允許檢測FRS-2或其變體或其片段的磷酸化形式。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中將包括磷酸酪氨酸的FRS-2、其包括磷酸酪氨酸的變體，或者其包括磷酸酪氨酸的片段用作生物標記，其指示顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)，尤其是抑制敏感的細胞，并且優(yōu)選包括使用抗磷酸酪氨酸抗體形式的生物特異性識別劑來測定所迷FRS-2、其變體或片段中酪氨酸磷酸化的存在或量。8.—種使用在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中鑒定的磷酸化作為用于細胞或組織或器官的生物標記的方法或在FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中鑒定的磷酸化的應(yīng)用，所述細胞或組織或器官顯示出異?；钴S，尤其是組成型活化的FGF-R信號，尤其是可用FGF-R或其變體的抑制劑進行治療并對于此種抑制劑有應(yīng)答，所述方法或應(yīng)用包括通過能夠識別FRS-2中磷酸酪氨酸的生物特異性識別劑，測定來自生物樣品的FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段中磷酸化酪氨酸的存在，磷酸化的陽性發(fā)現(xiàn)表明異?；钴S，尤其是組成型活化的FGF-R信號。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，進一步包括為了將對于涉及FGF-R或其變體的信號的抑制劑有應(yīng)答的細胞或組織或器官與不應(yīng)答的此類細胞或組織或器官區(qū)分，比較不存在以及存在由FGF-R或其變體介導(dǎo)的信號的抑制劑時酪氨酸磷酸化狀態(tài)，存在抑制劑時，酪氨酸磷酸化的降低表示此種應(yīng)答性。10.包括用于FGF-R或其變體的生物特異性識別劑以及能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑的試劑盒，用于從生物樣品中鑒定對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)的信號的調(diào)節(jié)，尤其是抑制敏感的細胞，所述試劑盒包括用于測定生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)的工具，該磷酸化狀態(tài)作為用于此種對抑制的敏感性的生物標記。11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑盒，包括能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑，尤其是抗磷酸酪氨酸抗體作為確定磷酸化狀態(tài)的工具以用于從細胞或組織或器官鑒定對涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)的信號的調(diào)節(jié)，尤其是抑制敏感的細胞，包括測定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)，尤其是用于允許測定FGF-R信號的異常活躍，更尤其是FGF-R信號的組成型活化。12.—種能夠識別FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式的生物特異性識別劑，用于鑒定顯示出對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)，尤其是抑制有敏感性的細胞，尤其是顯示出FGF-R信號異?；钴S，更尤其是組成型活化的細胞。13.能夠識別磷酸化的FRS-2或其變體或其包括酪氨酸的片段的生物特異性識別劑在制備診斷物中的應(yīng)用，該診斷物用于從來自生物樣品的細胞或組織中鑒定對于涉及成纖維細胞生長因子受體(FGF-R)或其變體的信號的調(diào)節(jié)敏感的細胞，所述鑒定包括測定FGF-R底物2(FRS-2)，其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化狀態(tài)。14.根據(jù)權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中生物特異性識別劑能夠鑒定FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式，更優(yōu)選為抗磷酸酪氨酸抗體。15.—種鑒定增殖需要針對增殖的FGF受體活化，尤其是組成型FGF受體活化，并且應(yīng)答FGF-R信號抑制的細胞的方法，包括a)在不存在FGF-R抑制劑下，將分離的細胞或組織樣品加入培養(yǎng)基，以及在不存在FGF，存在FGF-R受體抑制劑下將平行樣品加入培養(yǎng)基，b)從所述樣品中至少部分純化FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段；c)測定所述樣品中FRS-2的磷酸化狀態(tài)；和d)比較受到抑制劑處理的樣品和沒有受到處理的樣品中的磷酸化狀態(tài)，存在抑制劑時的磷酸化減少表明適于鑒定可用于治療包括FGF-R信號異?；钴S的癥狀的抑制劑的細胞。16.—種診斷對于用FGF-R信號的抑制劑治療有應(yīng)答的疾病的方法，包括鑒定來自患者的生物樣品中FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的磷酸化形式。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中鑒定以能夠識別FRS-2、其變體或其包括酪氨酸的片段的酪氨酸磷酸化形式的生物特異性識別劑，尤其是抗磷酸酪氨酸抗體進行。全文摘要本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即顯示出FGF-R底物2(FRS-2)(尤其是酪氨酸)磷酸化的細胞相比于缺乏此種磷酸化的細胞而言，允許在例如來自顯示出此種磷酸化的患者的生物樣品的細胞中，用成纖維細胞生長因子受體信號的調(diào)節(jié)物(尤其是抑制劑)進行治療將會成功的預(yù)測。因此，F(xiàn)RS-2的磷酸化可以用作針對成功治療可能性的生物標記。本發(fā)明涉及應(yīng)用此生物標記的多種方法、應(yīng)用、試劑盒和使用的試劑。文檔編號G01N33/574GK101632021SQ200880006158公開日2010年1月20日申請日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日發(fā)明者C·加西亞-埃切維里亞,D·格勞斯波塔,V·瓜格納諾申請人:諾瓦提斯公司