專利名稱：來源于c型肝炎病毒的肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用于C型肝炎病毒感染的診斷及C型肝炎的治療的C型肝炎病毒(HCV)肽。
更詳細地說，本發(fā)明涉及HCV肽、含有HCV肽的多肽、編碼HCV肽或前述多肽的核苷酸、或識別上述物質(zhì)的抗體或類似抗體活性物質(zhì)、含有前述核苷酸的載體、使用HCV肽或前述多肽誘導細胞毒性T細胞的方法、或使用HCV肽、前述多肽、前述核苷酸或前述抗體·類似抗體活性物質(zhì)的C型肝炎病毒檢測方法、C型肝炎的診斷、預防或治療方法、及預后的預測方法，以及含有上述物質(zhì)的C型肝炎治療用藥物組合物。

背景技術：
病毒性肝炎主要為病毒經(jīng)口感染的A型肝炎與通過血液感染的B型肝炎，除此以外，也有主要通過輸血等感染的C型肝炎等。該C型肝炎是慢性化后轉(zhuǎn)移為肝硬化或肝癌的機率非常高的疾病之一。
C型肝炎病毒(HCV)是屬于黃病毒科的單鏈RNA病毒，日本有200萬人以上、世界中有1億7000萬人為C型肝炎病毒感染者。
對該C型肝炎實施干擾素與利巴韋林(Ribavirin)并用治療方法，但僅對3～4成的患者有效，對于大多數(shù)患者而言目前并無有效的治療方法。因此，盡快開發(fā)出安全有效且簡單的低成本診斷、及治療方法成為強烈的社會需求。
有證據(jù)顯示(WO89/04669)細胞性及體液性免疫應答兩者在抑制HCV感染方面發(fā)揮主要作用。在過去的十多年間，眾多研究發(fā)現(xiàn)高免疫原性的HCV肽，發(fā)現(xiàn)多種可誘導細胞性或體液性免疫應答的HCV肽(Hunziker et al.Mol Immunol.2001 Dec；38(6)475-84)。然而，這些肽并非都具有臨床效果，實際上無論為預防還是為治療，至今仍然皆沒有有效的免疫治療手段。認為主要原因在于上述肽的免疫原性較弱。
另外，本發(fā)明人等已提出數(shù)個由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別出的抗原肽具有在活體內(nèi)或活體外皆可導出細胞性免疫應答及體液性免疫應答雙方的能力(Gohara et al.J Immunother.2002 Sep-Oct；25(5)439-44，Mine et al.Clin Cancer Res.2001 Dec；7(12)3950-62，Tanaka et al.J Immunother.2003 Jul-Aug；26(4)357-66，Mine et al.Cancer Sci.2003 Jun；94(6)548-56)。
而且，由細胞性及體液性免疫應答兩者識別的HCV肽具有高于僅由細胞性免疫應答識別的肽的免疫原性。
作為順應社會需求的新對策之一，因已累積可誘導細胞性免疫應答及體液性免疫應答兩者的HCV肽與僅具有體液性免疫應答的肽相比，具有更高的免疫原性一連串認知，所以可舉出特別指定上述肽的對策。
在確認上述肽的同時，調(diào)查其是否可作為抑制HCV感染的新型治療方法及診斷手段的候補物質(zhì)是有益的。
因此，本發(fā)明人等針對與被HLA-A2及HLA-A24限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別的肽具有反應性的IgG是否可從HCV感染者的血清中檢測出進行調(diào)查，結果發(fā)現(xiàn)對幾個CTL表位具有特異性的IgG與不同的HLA class I型或不同的HCV基因型無關，可由大多數(shù)HCV感染患者中檢出。并且，由該結果得知，上述肽可提供以肽為基礎的預防及治療用新型方法，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的為提供一種HCV肽，其特征為，該HCV肽由細胞性免疫應答及體液性免疫應答識別、且具有高免疫原性。


發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述課題，本發(fā)明提供一種來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為序列中含有HLA結合基序(binding-motif)，且由C型肝炎病毒患者的血中抗體來識別。
本發(fā)明的優(yōu)選方案為提供一種具有序列表的序列號1～8、16、20及38中任一種表示的氨基酸序列的來源于C型肝炎病毒的肽、具有與該肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的來源于C型肝炎病毒的肽、及還具有由HLA-A2或HLA-A24限制性細胞毒性T細胞產(chǎn)生的識別性的來源于C型肝炎病毒的肽。
本發(fā)明的其它方案為提供含有該來源于C型肝炎病毒的肽的多肽。作為該方案發(fā)明的優(yōu)選方案，提供一種具有與該多肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的多肽、及還具有由HLA-A2或HLA-A24限制性細胞毒性T細胞產(chǎn)生的識別性的多肽。
另外，本發(fā)明的另一方案為提供一種核苷酸，其為編碼該來源于C型肝炎病毒的肽、或該多肽的核苷酸。
本發(fā)明的另一方案為提供一種抗體或類似抗體活性物質(zhì)，其可以免疫學的方式識別該來源于C型肝炎病毒的肽、或該多肽。
作為本發(fā)明的另一方案，提供一種含有上述核苷酸的載體。
另外，本發(fā)明的另一方案為提供一種細胞毒性T細胞的誘導方法，其特征為使用編碼該來源于C型肝炎病毒的肽、或該多肽的該核苷酸來誘導細胞毒性T細胞。
作為本發(fā)明的另一方案，提供一種C型肝炎病毒的檢測方法，其使用該來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
另外，作為本發(fā)明的另一方案，提供一種C型肝炎等HCV感染相關疾病的診斷方法，其使用上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
而且，另一方案為提供一種C型肝炎等HCV感染相關疾病的治療方法，其使用上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
本發(fā)明的另一方案為提供一種藥物組合物，其含有上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)作為有效成分。另外，作為優(yōu)選方案，提供一種藥物組合物，該藥物組合物為C型肝炎病毒疫苗。
作為本發(fā)明的另一方案，提供一種C型肝炎等HCV感染相關疾病的預后預測方法，其使用上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
本發(fā)明的另一方案為提供一種診斷C型肝炎或預后預測的試劑盒，其含有上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。



圖1是表示本發(fā)明中以ELISA法得到的HCV感染患者血中的IgG測定結果的圖。
圖2是表示本發(fā)明中以ELISA法得到的HCV感染患者血中的IgG測定結果的圖。
圖3是表示本發(fā)明中在圖1所示患者血清中的C-35肽反應性抗體的代表例的吸收·溶出實驗結果的圖。
圖4是表示本發(fā)明中的6種來自HCV的HLA-A24結合肽(No.3、12、13、25、32、38)的CTL誘導結果的圖。
圖5是表示本發(fā)明中的來自HCV的HLA-A2結合性肽(No.40至No.57)的CTL誘導結果的圖。
圖6是表示本發(fā)明中由51Cr游離試驗得到的肽刺激PBMC的細胞毒活性的代表性結果的圖。
圖7是表示本發(fā)明中由51Cr游離試驗得到的肽刺激PBMC的細胞毒活性的代表性結果的圖。
圖8是表示本發(fā)明中由使用抗CD8單克隆抗體的抑制試驗確認肽刺激PBMC的細胞毒性的HLA class I限制性的圖。
圖9是表示HCV感染患者血清中抗肽IgG的檢測圖。
圖10是表示HCV感染患者血清中抗肽IgG的檢測圖。
圖11是表示對HCV感染患者血清中的抗肽IgG的特異性進行調(diào)查的吸附試驗結果的圖。
圖12是表示對HCV感染患者血清中的抗肽IgG的特異性進行調(diào)查的溶出試驗結果的圖。
圖13是表示由肽刺激PBMC導致IFN-γ產(chǎn)生的圖。
圖14是表示由肽刺激PBMC導致IFN-γ產(chǎn)生的圖。
圖15是表示肽刺激PBMC的細胞毒性的圖。
圖16是表示肽刺激PBMC的細胞毒性的圖。
圖17是表示對表達NS5A的細胞的肽刺激PBMC的CTL活性的圖。
圖18是表示對表達NS5A的細胞的肽刺激PBMC的CTL活性的圖。
圖19是表示對表達NS5A的細胞的肽刺激PBMC的CTL活性的圖。
圖20是表示抗NS5A-2132IgG活性的特異性的圖。
圖21是表示由抗NS5A-2132IgG導致的細胞增殖阻礙分析結果的圖。
圖22是表示抗NS5A-2132IgG的ADCC活性分析結果的圖。
圖23是表示各種疾病的抗C-35抗體及抗NS5A-2132抗體的檢測圖。
圖24是表示抗肽抗體的HLA或HCV基因型限制性的圖。
圖25是表示抗肽抗體的HLA或HCV基因型限制性的圖。
圖26是表示患者血清中抗NS5A-2132抗體的測定結果的圖。
圖27是表示患者血清中抗NS5A-2132IgG的測定結果的圖。
圖28是表示患者血清中抗NS5A抗體的水平及HCV RNA水平的圖。
圖29是表示世代研究(Cohort Study)的抗C-35抗體及抗NS5A-2132抗體的檢測圖。
圖30是表示世代研究(Cohort Study)的抗NS5A-2132抗體的檢測圖。
圖31是表示本發(fā)明中，由Luminex法得到的HCV感染患者血中IgG測定結果的圖。
圖32是表示本發(fā)明中由Luminex法得到的HCV感染患者血中IgG測定結果的圖。
圖33是表示使用本發(fā)明的肽的C型肝炎治療過程的圖。
圖34是表示使用本發(fā)明的肽的C型肝炎治療過程的圖。

具體實施例方式 本發(fā)明所述來源于C型肝炎病毒的肽是含有HLA結合基序(binding-motif)、且可由C型肝炎病毒患者的血中抗體識別出的HCV肽。
另外，本發(fā)明的HCV肽在其序列中含有HLA結合基序，即，HLA-A2或HLA-A24結合基序。且該HCV肽由細胞性免疫應答及體液性免疫應答識別，同時，顯示較高的免疫原性。
作為上述HCV肽，例如可包含下述表1及表3所舉出的肽。本發(fā)明中特別優(yōu)選的HCV肽之一為包含具有以下氨基酸序列的HLA-A2結合性基序的肽 C-35YLLPRRGPRL(序列號1) 對于HCV感染者而言，對該肽的肽反應性IgG抗體的檢測率及HCV感染癥特異性分別為93％與100％，非常高。另外，本發(fā)明中特別優(yōu)選的其它HCV肽為包含具有以下氨基酸序列的HLA-A24結合性基序的肽 NS5A-2132RYAPACKPL(序列號2) E2-488HYAPRPCGI(序列號3) E1-213VYEAADMIM(序列號4) NS3-1081VYHGAGSKTL(序列號5) C-176IFLLALLSCL(序列號6) C-173SFSIFLLALL(序列號7) EYVLLLFLL(序列號8) PYIEQGMQL(序列號16) IFTITKILL(序列號20) SFAIKWEYVL(序列號38) 特別是NS5A-2132，對于多數(shù)HLA-A24陽性患者而言，可誘導細胞性免疫及體液性免疫兩者。
本發(fā)明的HCV肽也可為與該肽的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選為80％或80％以上、更優(yōu)選為90％或90％以上同源性的肽。
另外，本發(fā)明的HCV肽也可以進一步含有由HLA-A2或HLA-A24限制性細胞毒性T細胞(CTL)識別的肽。由在細胞內(nèi)制造的抗原蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)分解出的肽構成的、可與該HLA結合的抗原肽中，每個HLA型均在該序列內(nèi)存在基序(motif)，細胞毒性T細胞(CTL)可識別該抗原肽與HLA的復合體來破壞HCV感染細胞。
本發(fā)明的多肽在該氨基酸序列中含有上述本發(fā)明的肽的氨基酸序列，該氨基酸的總數(shù)并無特別限定。另外，在本發(fā)明的多肽中，超過構成該肽的氨基酸的其余氨基酸位于該肽的氨基酸N-末端及/或C-末端側、或上述兩側。因此，該多肽具有與上述肽的功能及作用實質(zhì)相同的功能及作用。需要說明的是，本說明書中，即使僅記載“肽”時，只要無特別否定時，均應當理解為包含“多肽”。
具有如上所述地定義的氨基酸序列的肽可使用下述方法得到一般的化學合成法，蛋白質(zhì)分子酶分解法，使用進行了轉(zhuǎn)化、使編碼目標氨基酸序列的堿基序列表達的宿主的基因重組技術等。
采用化學合成法制造作為目標的該肽時，可依據(jù)一般的肽化學中公知的慣用方法進行制造，例如使用肽合成機由固相合成法合成。如此得到的粗肽可由蛋白質(zhì)化學中一般使用的純化方法、例如鹽析法、極限過濾法、逆相色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等而純化。
另一方面，以基因重組技術生產(chǎn)所希望的該肽時，例如可以將編碼上述合成的目標氨基酸序列的DNA片段插入適當?shù)谋磉_載體中，使用該表達載體對微生物或動物細胞實施轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，從而得到所希望的該肽。作為可使用的表達載體，可使用該技術領域內(nèi)公知的質(zhì)粒、病毒載體等。
作為該肽生產(chǎn)技術中使用表達載體的宿主細胞轉(zhuǎn)化方法，可使用公知方法，例如氯化鈣法、磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofectin)法、電穿孔法(electroporation)等，可依據(jù)所使用的宿主細胞進行適當選擇。得到的肽的純化可采用上述純化法對從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中回收的細胞提取液或培養(yǎng)上清液進行純化。
作為該發(fā)明的其它方案之一的核苷酸，包括含有上述來源于C型肝炎病毒的肽或上述多肽的寡核苷酸或聚核苷酸，包括核糖核苷酸或去氧核苷酸。另外，該核苷酸也可以利用本領域的已知方法進行改變。該核苷酸的改變例如包含公知的標記、甲基化、“caps”、由類似物取代1個或1個以上天然核苷酸、核苷酸內(nèi)改變等。核苷酸內(nèi)改變可舉出例如非離子性改變(例如，甲基磷酸、磷酸三酯、磷酰胺酯等)、離子性改變(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、例如蛋白質(zhì)(例如，核酸水解酶、毒素、抗體、信號肽等)的修飾部分的改變，利用螯合劑(例如金屬、硼等)的改變等。
上述核苷酸序列可提供一種被編碼在HCV的基因組中的HCV抗原的肽及多肽序列，另外，可以提供用作診斷試驗或疫苗成分的有用的肽。
一旦獲得本發(fā)明的核苷酸，就可構筑核苷酸探針及肽，上述核苷酸探針及肽在診斷HCV感染相關疾病方面，或篩選血液中或血液制劑中的HCV感染方面是有用的。由該核苷酸序列可合成例如24至30個核苷酸或更長的DNA寡聚物。該核苷酸還可作為用于檢測受試者血清中的HCV RNA、或用于篩選血液或血液制劑中HCV存在的探針而使用。
另外，該核苷酸序列可設計、生產(chǎn)出作為診斷對HCV的抗體存在的試藥也有用的HCV特異性肽。且對于來自該序列的純化肽的抗體，也可用于檢測HCV感染者及HCV感染血液制劑中的HCV抗原。
作為本發(fā)明的另一方案之一的抗體包括來自該C型肝炎病毒的肽、對該多肽具有反應性的嵌合抗體、改變抗體、單價抗體、Fab、F(ab’)2、Fab’、單鏈Fv(scFv)蛋白質(zhì)以及單一結構域抗體。另外，該抗體可以免疫學的方式識別該肽或該多肽。
作為本發(fā)明的另一方案之一的載體為含有該核苷酸、可以將所選擇的宿主細胞轉(zhuǎn)化的構筑物，可以在該宿主中表達不同種類的編碼序列。該表達載體可為克隆用載體或插入用載體任一。
作為克隆用載體例如可使用質(zhì)粒、病毒(例如腺病毒質(zhì)粒載體)等。另外，該克隆用載體是可轉(zhuǎn)化宿主細胞、且具有在細胞內(nèi)進行核苷酸復制能力的復制子(例如，質(zhì)粒、染色體、病毒、粘粒等)。
另一方面，插入用載體雖在宿主細胞中不發(fā)揮復制子的作用，但其是為了穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主而具有將駐留物插入宿主中的復制子(典型例為染色體)內(nèi)的能力的載體。
作為本發(fā)明的其它方案之一，包括通過使用該肽誘導以HCV細胞作為目標的細胞毒性T細胞的誘導方法。本發(fā)明的誘導方法為，例如在表達HLA-A2的細胞中添加該肽，使其表達在HLA-A2上，以由HLA-A2表達該肽的細胞刺激T細胞后，誘導該T細胞轉(zhuǎn)化為CTL。該方法中所使用的HLA-A2表達細胞可由HCV患者的血液中采集，但也可在非HLA-A2表達細胞中導入編碼HLA-A2的基因而制成。因此，本發(fā)明的該肽不僅可用于HCV檢測及診斷，也可作為C型肝炎病毒相關疾病的疫苗等藥物組合物使用。
另外，如上所述地誘導出的CTL因以HCV感染細胞作為目標，攻擊該HCV感染細胞，因此，可與該肽同樣地用作細胞治療法等的藥物組合物。
而且，作為本發(fā)明的其它方案的該來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸及/或抗體、類似抗體活性物質(zhì)可用于檢測、診斷HCV感染。
HCV的檢測及HCV相關疾病的診斷，例如利用與編碼該肽的核酸序列的相互作用及/或反應性，根據(jù)該肽存在的檢測、對應核酸序列存在量的檢測、在該肽的個體中活體分布的確定/或來自個體的檢體中存在量的確定來進行。換言之，可通過將該肽作為標記物進行檢定來進行HCV的檢測及HCV相關疾病的診斷。另外，該測定可使用公知的測定方法進行，作為這種測定方法，例如可舉出利用抗原抗體反應系統(tǒng)、酶反應系統(tǒng)、PCR反應系統(tǒng)等的方法。
HCV相關疾病的治療效果的確認及預后的預測可通過監(jiān)測罹患HCV相關疾病的受試者體內(nèi)具有對該肽的反應性的抗體的血中濃度來進行。特優(yōu)選測定出受試者血中的抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平。
作為本發(fā)明的另一方案的藥物組合物例如可舉出疫苗。疫苗由來源于C型肝炎病毒的肽、多肽及/或核苷酸組成，適當含有醫(yī)學上可接受的助劑及/或載體。作為助劑可使用可強化免疫應答的助劑，例如freund的不完全助劑、氫氧化鋁膠等。另外，作為載體例如可使用PBS、蒸餾水等稀釋劑、生理鹽水等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)其使用方式，例如通過口服、靜脈給藥或皮下給藥等非口服或經(jīng)皮途徑進行給藥。作為其劑型例如可舉出片劑、顆粒劑、軟膠囊劑、硬膠囊劑、液劑、油劑、乳化劑等。該藥物組合物的給藥量，可依據(jù)給藥患者的癥狀等適當改變，一般而言成人每日給藥量以該肽量計可以為0.1～10mg，給藥間隔可以為數(shù)日或數(shù)月一次。
本說明書中所引用的所有專利及參考文獻內(nèi)容皆為本說明書的一部分。另外，作為本案所要求的優(yōu)先權的基礎的日本專利申請2003-330258號說明書及附圖的內(nèi)容皆引用作為本案說明書的一部分。
實施例 由實施例更詳細地說明本發(fā)明。但這些實施例僅為更具體說明本發(fā)明所舉例，本發(fā)明并不限定于以下的實施例。
需要說明的是，以下實施例所使用的氨基酸的簡稱如下。
A為丙氨酸、C為胱氨酸、D為天門冬氨酸、E為谷氨酸、F為苯丙氨酸、G為甘氨酸、H為組氨酸、I為異亮氨酸、K為賴氨酸、L為亮氨酸、M為蛋氨酸、P為脯氨酸、R為精氨酸、S為絲氨酸、T為蘇氨酸、V為纈氨酸、Y表示酪氨酸。
實施例1與HCV感染者血清中的HCV肽具有反應性的IgG的檢測 肽 使用具有來自HCV基因型1b蛋白質(zhì)的保存區(qū)域的HLA-A2結合性基序或HLA-A24結合性基序的合成肽(如表1)。作為陰性對照組使用具有HLA-A2結合性基序的來自HIV的肽。上述肽均使用市售品，其純度由逆相高壓液相色譜法進行分析的結果為90％或90％以上。
表1 切斷值為1.83。
表2 檢測率按切斷值為陽性的患者的數(shù)目計算(平均±3SD)。
NS5A-2132為0.202，C-35為0.13。
統(tǒng)計解析以χ2試驗進行。
ELISA 血清中的肽特異性IgG由ELISA測定。首先將各肽溶解于二甲基亞砜(DMSO)，于-80℃保存。將肽用含有作為交聯(lián)劑的二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)的0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液稀釋。在ELISA平板中，使肽按20μg/孔在4℃下反應一夜而結合?？滓?.05％Tween20-PBS(PBST)清洗3次，平板以Block-Ace(注冊商標)密封，于4℃下放置一晚。將血漿或血清樣品用0.05％的Tween20-BlockAce分別稀釋100、200及400倍，每孔添加100μl所得的各樣品。樣品于37℃下培養(yǎng)2小時后，將平板用PBST清洗9次，每孔添加100μl稀釋1000倍的兔子抗人類IgG(γ鏈特異性)，并于37℃下培養(yǎng)2小時。再以PBST清洗9次后，每孔添加100μl稀釋100倍的與老鼠抗兔子IgG共價鍵合的西洋芥末過氧化酶·葡聚糖聚合物，將平板于室溫下培養(yǎng)40分鐘。清洗平板后，每孔添加100μl四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)溶液，添加2.0M磷酸使反應停止。切斷值由健康者的光密度對照組的平均±3SD算出。
肽特異性IgG的吸收及溶出 將每孔100μl的血漿或血清樣品以0.05％Tween20-Block Ace(注冊商標)稀釋，使固定在平板的孔中的肽(每孔20μg)于37℃下吸收2小時。此操作重復3次后，利用ELISA測定上清液中的肽特異性IgG水平。將在初次吸附中結合于肽固定平板上的抗體用各孔為30μl的5M NaCl/50mM檸檬酸緩沖液(pH3.0)(以1.0M Tris-HCl的0.05％Tween20-Block Ace(pH7.5)進行中和)進行溶出，利用ELISA測定溶出的部分的肽特異性IgG水平。
肽特異性CTL測定 肽特異性CTL的檢測中采用的方法可使用本領域的慣用方法。將PBMC添加至U底型96孔微量培養(yǎng)平板的各孔中，直至每孔含1×105個細胞，與10μM的肽同時于200μl的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。該培養(yǎng)基的組成為45％RPMI-1640、45％AIM-V(注冊商標)、10％牛胎血清(FCS)、100U/ml的干擾素2(IL-2)、與1mM MEM非必須氨基酸溶液。培養(yǎng)第3天、第6天、第9天時各除去一半培養(yǎng)基，換上含有所對應的肽(20μg/ml)的新培養(yǎng)基。培養(yǎng)第12天采集培養(yǎng)后的細胞，進行對應的肽或作為陰性對照組的HIV肽中任一種產(chǎn)生對預先附著的CIR-A2402細胞或T2發(fā)生應答的干擾素γ(IFN-γ)的能力的試驗。對于各肽，使用4個孔，進行2次測試。所得的值減去對HIV肽發(fā)生應答的本底IFN-γ的產(chǎn)生。對于抑制測試，肽反應性CTL使用CD8分離試劑盒進行純化，該肽特異性IFN-γ的產(chǎn)生在20μg/ml的抗HLAclass I(W6/32，IgG2a)單克隆抗體、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)單克隆抗體或抗HLA class II(H-DR-1，IgG2a)單克隆抗體中的任一種的存在下進行測定。從所得的值中減去本底IFN-γ的產(chǎn)生。
統(tǒng)計 其值以平均值+/-SD表示。統(tǒng)計分析使用Mann-Whitney U檢定或標準試驗來進行。p＜0.05的值有統(tǒng)計學意義。
對HCV肽的抗體檢測 對于12名HCV感染患者與10名健康者(HD)的血清，測定其對62種肽產(chǎn)生反應的IgG水平(表1)。對各肽的抗體陽性率如表1所示。其結果發(fā)現(xiàn)多個與HCV感染者的血中IgG進行高比率反應、且?guī)缀醪慌c健康人血清反應的肽。
例如，No3的NS5A-2132(相當于HCV的NS5A蛋白質(zhì)的第2132號至第2140號，以下相同故省略)、No11(NS3-1266)、No12(E2-488)、No13(E1-213)、No22(NS2-947)、No25(NS3-1081)、No32(C-176)、No38(C-173)、No40(C-35)、No62(NS5B-2990)等。由代表性的ELISA法所得的HCV感染患者的血中IgG測定結果如圖1及圖2所示。
圖1所示的患者血清中檢測出對C-35的IgG抗體。
圖2的(A)-(D)所示的4名患者血清中分別檢測出NS5A-2132(A)、NS3-1081(B)、E2-488及E1-213(C)、C-176及C-173(D)反應性IgG抗體。這些肽反應性抗體的肽特異性可由吸收及溶出試驗加以確認。
以圖1所示的患者血清中的C-35肽反應性抗體的吸收·溶出實驗結果作為代表例示于圖3。該抗體雖被C-35吸收，但未被作為無關系的肽的NS5A-2252吸收(圖3上段)。而且該抗體由C-35吸收部分溶出(圖3下段)。
表1中C-35肽反應性抗體于HCV感染者中為100％，而健康人中為0％，顯示高HCV特異性。HCV的C-35肽的序列與各種病毒，例如HIV-1的tet蛋白質(zhì)(第54至第58號的氨基酸序列)或env蛋白質(zhì)(5-9、158-162、717-727的氨基酸序列)顯示部分同源性。另外，HTLV-1的各種蛋白質(zhì)(pol 724-755、rex 5-9、rex 310-313、tax 70-74等)皆顯示同源性。針對HCV感染癥相關疾病60例(慢性C型肝炎22例、肝硬化20例、肝癌18例)、B型肝炎病毒感染者24例、B型肝炎病毒疫苗接種者10例、健康人27例、自身免疫疾病患者22例、HTLV-I感染者10例、及HIV感染者3例、共計156例進行雙盲檢定調(diào)查C-35肽反應性抗體。其結果如表2所示。由該結果得知，C-35肽反應性抗體的HCV特異性及檢測率分別為88.5％及93.3％。
肽特異性CTL活性的誘發(fā) 將6種HLA-A24結合肽(No3、12、13、25、32、38)及18種HLA-A2結合肽(由No40至No57)與HLA-A24或HLA-A2陽性的HCV感染者各5名的末梢血單核細胞(PBMC)進行培養(yǎng)。作為對照組，將該PBMC與HIV肽進行培養(yǎng)。對上述培養(yǎng)PBMC，調(diào)查對脈沖對應的肽的C1R-A2402細胞或T2細胞發(fā)生應答的IFN-γ產(chǎn)生能力。其結果為6種HLA-A24結合肽(No3、12、13、25、32、38)可由10名HLA-A24陽性HCV患者的PBMC誘導出CTL(圖4)。另外，來自HCV的HLA-A2結合性肽(No40至No57)可由5名HLA-A2陽性HCV患者的PBMC誘導出CTL(圖5)。
而且，由肽刺激PBMC的細胞毒活性可采用51Cr游離試驗加以確認。其代表性結果如圖6及圖7所示。
圖6表示由來自HCV的HLA-A24結合性肽(No3、12、13、25、32、38)從HLA-A24陽性HCV患者PBMC誘導的CTL的細胞毒活性。對附著誘導肽的C1R-A2402細胞(圖中以C1RA2402表示)的細胞毒作用，與作為對照組的附著HIV肽的C1R-A2402細胞(圖中以C1RA2402HIV表示)相比顯著高。
圖7表示由來自HCV的HLA-A2結合性肽(No40、41)從HLA-A2陽性HCV患者末梢血PBMC誘導的CTL的細胞毒活性。對附著誘導肽的T2細胞(圖中以T2表示)的細胞毒作用，與對照組的附著HIV肽的T2細胞(圖中以T2HIV表示)相比為顯著高。
由結果得知，這些PBMC對預先填裝了對應肽(作為陰性對照組的HIV肽除外)的C1R-A2402及T2細胞顯示有意差水平的細胞毒性。
該細胞毒性的HLA class I限制性使用抗CD8單克隆抗體的抑制試驗來確認(圖8)。圖8表示利用CTL活性的抗CD8抗體進行抑制的代表例。由來源于HCV的HLA-A2結合性肽(No40)由HLA-A2陽性HCV患者PBMC誘導出的CTL細胞毒活性可被抗CD8抗體抑制，但未被抗CD4或?qū)φ战M的抗CD14抗體抑制。
實施例2對HLA-A24陽性HCV感染患者血清中的HCV肽具有反應性的IgG檢測 受試者 在更大范圍內(nèi)，對HLA-A24陽性的HCV感染患者，檢測對HCV肽具有反應性的IgG。60名HCV1b+患者采用第2代或第3代免疫測試進行判斷，抗HCV抗體(Ab)為血清陽性。患者血清中的HCV的基因型采用RT-PCR進行判定。血清取樣時的患者診斷通過生化學分析、超音波檢查、計算機連動斷層攝影、及組織學觀察來進行。診斷結果如下所示慢性肝炎(CH，n＝24)、肝硬化(LC，n＝18)、及肝細胞癌(HCC，n＝18)。作為陰性對照，使用有正常肝功能，無肝炎病毒病歷的20名健康提供者(HD)的血清樣品。
肽及肽反應性抗體的測定 使用來自HCV1b蛋白質(zhì)保存良好的區(qū)域、基于與HLA-A24分子的高結合中心(Bioinformatics and Molecular Analysis Section，NIH，Bethesda，MD)選擇的44種合成肽。作為陰性對照組使用具有HLA-A24結合基序的來自HIV的肽(RYLRDQQLLGI(序列號63))。結合評分及序列如表3所示。為了篩選肽對血清IgG的反應性，使用由BioSyntehsis(Lewisville，TX)或SynPep(Dublin，CA)購得的上述脫鹽等級(＞70％)的肽。之后的實驗使用經(jīng)純化的肽(＞90％)。肽特異性IgG的血漿水平由酶抗體法(ELISA)測定。血漿樣品的抗肽IgG的特異性試驗利用肽反應性IgG的吸收及溶出來進行。
肽特異性CTL的測定 在肽特異性CTL前體細胞的檢測中使用的方法如Hida等(CancerImmunol Immunother 2002；51219-228)所記載的內(nèi)容。阻礙試驗使用20μg/ml的抗HLA class I(W6/32，IgG2a)、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)、抗CD4(Nu-Th/i，IgG1b)、及抗HLA-class II(H-DR-1，IgG)單克隆抗體。
對由NS5A基因進行了轉(zhuǎn)染的細胞的肽刺激PBMC的CTL活性 NS5A、HLA-A2402及HLA-A2601的cDNA分別利用RT-PCR由Huh7(NNU50-1)細胞、C1R-A2402細胞及KE4-CTL細胞得到，在表達載體pCR3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)中進行克隆(cloning)。Huh7(NNU50-1)細胞株是來自感染HCV1b的細胞株的復制子細胞，由NS3表達NS5B的蛋白質(zhì)(Kishine et al.Biochem Biophys ResCommun 2002；293993-999)。其次，將100ng的NS5A、HLA-A2402或NS5A、及HLA-A2601cDNA(作為陰性對照組)混合在含有0.6μl的Fugene6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的100μl的Opti-MEM(Invitrogen)中，進行30分鐘的培養(yǎng)。其次將100μl的混合物添加于COS-7細胞(1×104細胞)中，將其培養(yǎng)6小時。將100μl含有20％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基添加到混合物中，培養(yǎng)COS-7細胞2天，加入NS5A 2132-2140刺激PBMC(2×105細胞/孔)。培養(yǎng)18小時后，取出100μl的上清液，對3孔進行ELISA測定得到IFN-γ濃度。為了制造出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子細胞株，將pCR3.1-NS5A或pCR3.1-HLA-A3101(陰性對照)中的任一種使用Gene Pulser(BioRAD，Richmond，CA)，在C1R-A2402細胞子，利用電穿孔法(electroporation)進行轉(zhuǎn)染。將上述細胞在新霉素(G418)的存在下培養(yǎng)30～40天，回收新霉素抗性細胞。轉(zhuǎn)染子中的NS5A蛋白質(zhì)的表達由使用抗NS5多克隆抗體(Abcam Limited，Cambridge，UK)進行蛋白質(zhì)印跡法分析。
增殖阻礙及抗體依賴性細胞性細胞毒(ADCC) 將Huh7細胞株在平底96孔微量培養(yǎng)平板的孔中，于各種血清存在下培養(yǎng)24、48及72小時。培養(yǎng)后以細胞計數(shù)試劑盒-8(10μl/孔)(Dojindo，Japan)計算Huh7細胞。為了進行ADCC測定，將由HLA-A24陽性的HD新分離出的PBMC，在含有各種患者或HD(作為陰性對照)的不活化血清(56℃，30分鐘)的10％FCS及RPMI-1640培養(yǎng)基中預培養(yǎng)1.5小時。將C1R-A2402細胞及C1R細胞(作為陰性對照)與NS5A2132-2140肽(10μM)一起培養(yǎng)2小時，以Na251CrO4進行1.5小時的放射性標記，經(jīng)清洗后作為目標細胞使用。將肽刺激PBMC于96U底微量培養(yǎng)平板的孔中以40、20及10比1的效應子與目標細胞之比(E/T)，與目標細胞一同進行培養(yǎng)。在37℃培養(yǎng)6小時后，回收無細胞上清液，測定ADCC活性(Shomura，et al.Br J Cancer 2004；901563-1571)。
統(tǒng)計學 統(tǒng)計學分析使用標準t檢定及Mann-Whitney U檢定進行。P＜0.05的值有統(tǒng)計學意義。
對HCV-肽的體液性免疫應答的檢測 為了篩選對肽的體液性免疫應答，對感染HCV-1b的12名患者的血漿，測定對44種肽的各IgG反應性水平。使用10名HD的血漿作為陰性對照組。肽反應性IgG的水平利用ELISA測定連續(xù)稀釋的血漿樣品，得到各樣品的吸光度(OD)。將1∶100的血漿稀釋的上述肽的切斷值作為0.18OD{10名HD平均(0.08)+2SD(0.05×2)}。對NS5A-2132、C-176、E2-488、E1-213、C-173、及NS3-1081肽為有意義水平(1∶100的血清稀釋下＞0.18OD)的IgG反應性在12名患者的血漿中分別可以檢測出12、11、10、9、8及5名(圖9)。如預測所述，上述肽中的任一種對10名HD的血漿均不具有反應性。對肽特異性IgG的肽反應性歸納如表3所示。
表3.對HCV限制性肽及肽特異性IgGa)的反應性 a)12名HCV-1b+患者血清中肽特異性IgG水平利用ELISA進行測定。決定切斷值為0.18。
b)對HLA-A24分子的肽結合評分使用Bioinformatics andMolecular Analysis Section，NIH，Bethesda，MD(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)進行檢索。
就具有90％或90％以上純度的上述6種肽、及陰性對照肽對由60名HCV1b+患者(CH，n＝24；LC，n＝18；及HCC，n＝18)及20名HD的血清得到的各血清樣品的反應性進行試驗(圖10)。
對上述各樣品的100∶1稀釋值進行制圖。IgG(OD值)的平均值±SD如下所述NS5A-2132(0.48±0.36)、E2-488(0.18±0.19)、E1-213(0.10±0.21)、NS3-1081(0.036±0.14)、C-176(0.09±0.14)及C-173(0.04±0.13)。*表示Mann-Whitney U檢定得到的P＜0.05。對NS5A-2132、E2-488、E1-213、或C-173具有反應性的IgG的平均水平比HD高，且有統(tǒng)計學意義，但在NS3-1081或C-176的情況下并非如此。對NS5A-2132、E2-488、E1-213、C-173、NS3-10810、及C-176肽顯示有意義水平的反應性的IgG(1∶100的血清稀釋下＞0.101OD)在接受試驗的60名患者血漿中可分別得到57(95％)、44(73％)、28(47％)、23(38％)、21(35％)、及17(28％)的檢測結果。相對于此，所有20名HD的血清均未檢測出有意義水平的IgG(圖10)。
其次，對上述各肽具有反應性的IgG的肽特異性利用吸收及溶出試驗加以確認。使各血清樣品在37℃下被對應的肽或無關系的肽(HIV；作為陰性對照組使用)中的任一種吸收3次，利用ELISA測定出肽特異性IgG(圖11)。溶出試驗中，用對應的肽或無關系的肽溶出第一次吸收后結合在肽固定化平板上的IgG分子后，利用ELISA測定出溶出部分中的肽特異性IgG的水平。對于代表性結果，3次測定的OD值平均值±SD如圖所示(圖12)。*表示兩邊標準t檢定得到的P＜0.05。
如預測所示，對6種肽的各IgG雖被所有對應的肽吸收，但未被無關系的肽(HIV肽)吸收。而且，該IgG由對應的肽從結合部分溶出，但未被無關系的肽溶出。綜合這些結果可知，與各肽具有反應性的IgG對來自HCV1b的肽具有特異性。
肽特異性細胞性免疫應答的誘導 將由感染HCV1b的HLA-A24陽性患者(n＝12，6名CH，3名LC，3名HCC)及未感染HCV的HLA-A24陽性的HD(n＝5)得到的PBMC，與6種肽(純度＞90％)或?qū)φ誋IV肽一同培養(yǎng)13天，研究應答以對應的肽實施了脈沖的C1R-A2402細胞的IFN的產(chǎn)生。將由HLA-A24陽性HCV1b+的患者(n＝12)及HD(n＝5)得到的PBMC用6種肽在4個孔(15×104/孔)中進行刺激。在培養(yǎng)的第14天，回收各孔所得的肽刺激PBMC(80-120×104/孔)后，分成等量的4份。分別對其中的2個就與以對應肽實施了脈沖的C1R-A2402細胞發(fā)生應答、產(chǎn)生IFN-γ的能力進行試驗。剩下的2個則以使用陰性對照肽(HIV)的細胞進行試驗。減去作為背景的對HIV肽(＜50pg/ml)發(fā)生應答所產(chǎn)生的IFN-γ。*表示利用兩邊標準t檢定得到的P＜0.05。
C-173、C-176、E1-213、E2-488、NS3-1081、及NS5A-2132的HCV肽在12名患者中分別有1、3、4、6、2及7名(圖13、14)、及在5名HD中分別有0、0、1、1、1及1名誘導出有意義水平(p＜0.05)的IFN-γ產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未示出)。上述6種肽之中，NS5A-2132肽在12名患者中有7名的PBMC及接受試驗的60名HCV1b+患者中有57名的血清中，由細胞性免疫及體液性免疫被識別。
上述肽刺激PBMC的細胞毒性利用6小時的51Cr游離測試加以確定(圖15)。將利用IFN-γ產(chǎn)生測試(上述)顯示陽性應答的肽刺激PBMC，在體外僅在IL-2中進行培養(yǎng)，使其增殖。然后，利用標準的6小時51Cr游離測試，對利用對應的肽或HIV肽(陰性對照)實施了脈沖的C1R-A2402細胞的細胞毒性，以3種不同的E/T細胞比進行試驗。代表結果如圖所示。其值以特異性溶解％的平均值±SD表示。*表示利用兩邊標準t檢定得到的P＜0.05。以NS5A-2132、E2-488、或E1-213肽刺激的PBMC對預先負荷對應的肽的C1R-A2402細胞顯示有意義水平的細胞毒性，但在HIV肽中并未顯示(圖15)。
將圖15所示實驗中使用的肽刺激PBMC，在20μg/ml的抗HLA-class I(W6/32，IgG2a)、抗HLA-class II(H-DR-1，IgG2a)、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)、及抗CD4(Nu-Th/i，IgG1)單克隆抗體(mAb)的存在下，對以對應的肽實施了脈沖的C1R-A2402細胞的細胞毒性進行試驗。抗CD14(JML-H14，IgG2a)mAb作為陰性對照組使用。以3種不同的E/T比進行6小時51Cr游離測試。其值以特異性毒％的平均值±SD表示(圖16)。*表示利用兩邊標準t檢定得到的P＜0.05。
以3種肽分別實施了脈沖的C1R-A2402細胞的細胞毒性雖被抗HLA-class I(W6/32)或CD8單克隆抗體(mAb)阻礙，但未被試驗的其它mAb中的任一種阻礙。這表示肽特異性細胞毒性主要以由CD8+T細胞產(chǎn)生的HLA-class I限制性為媒介(圖16)。相對于此，以殘余的3種肽(C-173、C-176、或NS3-1081)刺激的PBMC中無法測出上述細胞毒性(數(shù)據(jù)未示出)。
然后，將以NS5A及HLA-A2401基因?qū)嵤┝藭簳r性共轉(zhuǎn)染的COS-7細胞作為目標細胞使用，由此對NS5A-2132肽刺激PBMC是否識別出自然過程中產(chǎn)生的肽進行調(diào)查。作為陰性對照，使用以NS5A及HLA-A2601基因?qū)嵤┝藭簳r性共轉(zhuǎn)染的COS-7細胞。對由患者#1及#2得到的NS5A-2132肽刺激PBMC可識別出以NS5A及HLA-A2401基因?qū)嵤┝藭簳r性共轉(zhuǎn)染的COS-7細胞作為目標細胞、產(chǎn)生IFN-γ的活性進行試驗。作為陰性對照，使用以NS5A及HLA-A2601基因進行了暫時性共轉(zhuǎn)染的COS-7細胞。其值以E/T比20∶1的3次測試的IFN-γ產(chǎn)生％的平均值±SD表示(圖17)。*表示利用兩邊標準t檢定得到的P＜0.05。
如預測所述，由顯示CTL活性(圖13)的患者#1及#2得到的肽刺激PBMC可識別經(jīng)NS5A及HLA-A2401基因共轉(zhuǎn)染的COS-7細胞，產(chǎn)生有意義量的IFN-γ(圖17)。相對于此，上述PBMC并不與作為陰性對照使用的具有NS5A及HLA-A2601基因的COS-7細胞反應。另外，由不顯示CTL活性的其它2名患者(#3及#4)得到的肽刺激PBMC也未因經(jīng)NS5A及HLA-A2401基因共轉(zhuǎn)染的COS-7細胞的識別而產(chǎn)生有意義量的IFN-γ(無數(shù)據(jù))。
接下來，對以NS5A基因穩(wěn)定地進行轉(zhuǎn)染、用作目標細胞的C1R-A2402細胞的細胞毒性進行試驗。以NS5A基因穩(wěn)定地進行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細胞的HLA-A24分子的表達、及以HLA-A31基因(陰性對照)穩(wěn)定地進行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細胞的HLA-A31分子的表達，使用FACScan進行流動細胞計算分析加以確認(圖18)。
然后，以由NS5A基因穩(wěn)定地進行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細胞作為目標細胞的細胞毒性由6小時51Cr游離測試進行試驗。將以陰性對照基因(HLA-A3101)穩(wěn)定地進行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細胞作為陰性對照使用，將以NS5A-2132肽實施了脈沖的C1R-A2402細胞作為陽性對照使用。以3個不同的E/T比進行6小時51Cr游離測試。其值以特異性溶解的％平均值±SD表示。*表示利用兩邊標準t檢定得到的P＜0.05。以NS5A-2132肽實施了刺激的PBMC，與對以陰性對照基因進行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細胞的細胞毒性比較，顯示比用NS5A基因進行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細胞、及用對應的肽預先進行了脈沖的未轉(zhuǎn)染C1R-A2402細胞雙方更高水平的細胞毒性(圖19)。這些結果暗示NS5A-2132肽刺激PBMC可良好地識別HCV1b+細胞的HLA-A2402分子上自然過程產(chǎn)生的肽。
對抗NS5A-2132IgG做進一步研究 為了更好地了解抗肽IgG的生物學作用的可能性，利用吸收及溶出測定，對抗NS5A-2132IgG是否可識別全NS5蛋白質(zhì)進行調(diào)查。NS5A-2132及HIV肽分別作為陽性對照及陰性對照使用(吸收試驗及溶出試驗的詳細內(nèi)容如上所述)。結果抗肽IgG在全NS5蛋白質(zhì)中未被吸收，也未被溶出(圖20)。這表示該肽IgG未與全NS5蛋白質(zhì)反應。
接下來，將Huh7細胞在患者血清(由2名血清具有高水平抗NS5A-2132活性的HCV1b+患者得到的血清)的存在下培養(yǎng)3天。作為陰性對照組，使用由2名HD得到的血清及FCS?？缮娴腍uh7(NNU50-1)細胞數(shù)目以細胞計算試劑盒8(10μl/孔)計算，算出3次測定所得的平均值。任一試驗血清在上述培養(yǎng)條件下均不阻礙Huh7(NNU50-1)細胞的增殖(圖21)。另外，對抗NS5A-2132IgG是否具有媒介ADCC活性的能力進行調(diào)查。將由HLA-A24陽性的HD新分離出的PBMC，在上述4種不活化血清的存在下，對用該肽預先進行了脈沖的C1R-A2402細胞的細胞毒性進行試驗。然而，這些條件下任一試驗血清均未顯示ADCC活性(圖22)。
實施例3.HCV感染者的預后預測 受試者 血清為由1995年至2002年的世代研究(Cohort Study)中具有HCV相關疾病的33名患者所得。33名患者的詳細調(diào)查結果如表4所示。具有慢性肝炎(CH，n＝68)、肝硬化(LC，n＝43)、及肝細胞癌(HCC，n＝52)的病患血清也用于分析。這些患者在最初血清采樣時，利用生化學及組織學所見、超音波檢查、及計算機連續(xù)斷層攝影進行診斷?？笻CV抗體由化學發(fā)光酶免疫測試(CLEIA)試劑盒(LumipulseII HCV，F(xiàn)ujirebio Inc.Tokyo，Japan)、或第2代或第3代酶免疫測試試驗(SRL，Tokyo，Japan)進行測定。血清中的HCV-RNA可使用RT-PCR(SRL，Tokyo，Japan)進行檢測。HCV基因型是由患者血清中的HCV以RT-PCR(SRL，Tokyo，Japan)直接定序來決定的。也由未感染HCV的受試者中得到血清。包括具有自身免疫疾病的24名受試者(6名全身性紅斑性狼瘡患者、1名白塞病患者及17名異位性皮膚炎患者)、17例B型肝炎病毒(HBV)感染(HBV表面抗原為陽性)、3名感染人類免疫不全病毒(HIV)的患者、及10例人類T細胞白血病病毒型I(HTLV-1)感染。作為陰性對照，對由不具HBV肝炎病毒或無疫苗接種經(jīng)歷、具有正常肝臟功能的37名受試者得到的血清進行試驗。
表41995年及2002年的診斷結果 CH，慢性肝炎；LC，肝硬化；HCC，肝癌； ASC，無癥候性健康載體 肽 純度為90％或90％以上的以下2個肽由BIOSYNTHESIS(Lewisville，TX)購得；HCV1b中心蛋白質(zhì)35-44(YLLPRRGPRL(序列號1)；可誘導HLA-A2限制性CTL活性)，及HCV1bNS5A蛋白質(zhì)2132-2140(RYAPACKPL(序列號2)；可誘導HLA-A24限制性CTL活性)。作為陰性對照，使用具有HLA-2A結合基序(SLYNTVATL(序列號64))及HLA-A24結合基序(RYLRDQQLLGI(序列號63))的來源于HIV的肽。
對肽具有反應性的抗體測定 肽特異性IgG的水平可由酶抗體法(ELISA)測定。簡言之，將各肽溶解于二甲亞砜(DMSO)，-20℃下保存。將用含有作為化學交聯(lián)劑的二琥珀酰亞胺二辛酸酯(DSS)(PIERCE，Rockford，1L)的0.1M碳酸緩沖液稀釋的肽(20μg/孔)結合于ELISA平板上。以0.05％Tween20-PBS(PBST)將孔清洗3次。平板以Block Ace(Yukijirushi，Tokyo，Japan)在4℃下封阻一晚。將血清樣品以0.05％Tween20-BlockAce稀釋100倍、200倍、400倍，將100μl/孔的樣品加入各孔中。37℃下培養(yǎng)2小時后，將平板用PBST清洗9次，與100μl/孔的1000倍稀釋兔子抗人類IgG(γ鏈特異性)(DAKO，Glostrup，Denmark)一同在37℃下培養(yǎng)2小時。清洗9次后，將100μl/孔的1∶100稀釋抗兔子IgG結合西洋芥末過氧化酶·葡聚糖聚合物(En Vision，DAKO)添加于各孔中，將平板在室溫下培養(yǎng)40分鐘。清洗后，添加100μl/孔的四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)溶液(KPL，Guildford，UK)，加入1.0M磷酸使反應停止。
統(tǒng)計學 統(tǒng)計學分析使用χ2檢定進行，p＜0.05的值有統(tǒng)計學意義。
交叉反應性、HLA限制性、及基因型限制性 研究對來源于HCV1b的肽具有反應性的2種抗體的交叉反應。研究60名HCV患者、及未含在世代研究中的患者(CH，n＝22，LC，n＝21，及HCC，n＝17)的血清對中心的35-44(C-35)及NS5A的2132-2140(NS5A-2132)的肽的反應性。也取得具有自身免疫疾病的24名受試者、HBV感染的17例及HTLV-1感染的10例受試者的血清。將由37名HD取得的血清作為陰性對照使用。連續(xù)稀釋的血清樣品的肽反應性IgG水平利用ELISA進行測定。給出各樣品的吸光度(OD)值。給出稀釋為100∶1的血清的OD代表性結果。切斷值設定為0.093(由HD的OD平均+2SD)。統(tǒng)計學分析使用χ2檢定進行，p＜0.05的值有統(tǒng)計學意義。
結果檢測出HCV陽性患者的56/60(93.3％)為有意義水平的抗C-35IgG，在3組(CH，LC，及HCC患者)之間的IgG水平不存在有意義差(圖23)。除去HTLV-1患者，由其它組得到的血清對抗C-35抗體不顯示陽性。對HTLV-1+受試者的8/10例的血清檢測出較低、但是有意義水平的抗C-35IgG。檢測出患者的45/60(75％)為有意義水平的抗NS5A-2132IgG。IgG水平在3組間，CH患者較高，LC為中等程度，HCC患者較低(p＜0.05vsCH)(圖23)。對于由其它組得到的血清，進行試驗的大部分病例的抗NS5A-2132IgG也顯示陽性。而且3/37的HD的血清的抗NS5A-2132IgG也顯示陽性。
接下來，對具有HCV相關疾病的29名病患研究HLA-class IA表達型、與抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平間的相關性。HLA-class IA表達型可由標準血清學方法決定。9名患者為HLA-2A陽性、13名患者為A24陽性、及剩下7名患者為A2陰性，A24陰性?？笴-35及抗NA5A 2132利用標準ELISA測定，各患者100∶1的血清稀釋時的OD值如圖所示。任一抗體不管其HLA-class IA表達型的差異，均在大部分HCV感染者中被檢出(圖24)。
然后，對于HCV-1b(n＝29)、HCV-2a(n＝16)及HCV-2b感染(n＝3)的患者，使用雙盲檢定研究HCV基因型與抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平間的相關性。HCV基因型可通過將患者血清中的HCV直接定序來決定。所有受試者的稀釋100∶1時的結果如圖25所示?？笴-35及抗NA5A 2132利用標準ELISA測定，各患者的100∶1的血清稀釋時的OD值如圖所示。切斷值設定為0.093(由HD的OD平均+2SD)。
抗C-35抗體分別在26/30的HCV-1b、15/15的HCV-2a、及3/3的HCV-2b感染者中被檢出。同樣地抗NS5A-2132抗體分別在23/30的HCV-1b、10/16的HCV-2a、及3/3的HCV-2b感染者的血清中被檢測出(圖25)。這些結果表示，在HCV陽性患者中，不管HLA-class IA亞型的差異、及HCV基因型的差異，均可檢出抗C-35抗體及抗NS5A-2132抗體雙方。
以上的結果表示抗NS5A-2132抗體的水平與HCV感染個體的預后相關，但與抗C-35抗體并無關系。
然后，重新準備CH(n＝24)、LC(n＝22)、HCC(n＝26)、HD(n＝9)的血清，測定抗NS5A-2132IgG的水平(圖26)。CH、LC、HCC及HD組的平均值±SD分別為0.51±0.24、0.27±0.20、0.26±0.23、0.08±0.07。LC及HCC患者的抗NS5A-2132抗體的水平明顯低于CH患者(p＜0.05，高于HD。為了將上述結果與利用標準第3代測試進行測定的結果進行比較，對于所有血清使用市售的試劑盒(第3代測試，SRL)測定抗HCV抗體的水平。其水平以指數(shù)表示(左邊柱狀圖)。以指數(shù)表示的抗HCV水平與抗NS5A-2132水平之間的關系如右邊柱狀圖表示。利用第3代測試測定的抗HCV抗體水平在3組間并無有意義的差異(CH，10±2.7；LC，11±1.4；HCC，11±1.1)(圖27)。而且，對于這些血清使用市售的試劑盒(SRL，Japan)測定HCV RNA水平。HCC患者的HCV RNA水平(360±269.6)比CH患者(610±347.3)或LC患者(610±246.4)低(p＜0.05)(圖28)。然而，抗NS5A抗體的水平與HCV RNA水平之間并無明確相關性(圖28)。
世代研究的結果 為了在各個水平下進一步調(diào)查抗NS5A-2132抗體與HCV陽性患者的預后的相關性，對1990年至2002年進行的每年篩選HCV感染居民的世代研究所得的樣品進行2種抗體的血清水平研究。為了進行該研究，于1995年及2002年由相同個體取樣2次，33名患者共計66份血清。1995年時上述33名患者的診斷為，CH(n＝17)、LC(n＝1)、無癥候性載體(ASC)(n＝4)、及HCV感染的過去病例(自然康復個體)(n＝11)，2002年時為CH(n＝13)、LC(n＝4)、HCC(n＝2)、無癥候性載體(ASC)(n＝1)、及HCV感染的過去病例(n＝13)。即，7年間26名患者中并未觀察到疾病的進展，而剩下7名患者中則觀察到疾病的進展(表4)。以1995年及2002年的100∶1血清稀釋時測定的各病患中抗C-35抗體及抗NS5A-2132IgG的OD值如圖29所示。如預測所述，33病例中的大部分，不論疾病狀態(tài)如何，1995年測定的抗C-35抗體水平與2002年測定的水平幾乎相等。相對于此，對于疾病進展的7名患者而言，1995年測定的抗NS5A抗體水平在2002年測定時減少。另一方面，對于疾病未進展的25例中的大部分而言，該值與2002年的測定值幾乎相等。疾病進展的7名患者的血清中1995年的抗NS5A-2132抗體的中央值±SD(0.67±0.13)與2002年的測定值(0.27±0.11)相比有意義地高(p＜0.05)。
然后，將33名受試者分為5組(CH、LC、HCC、HCV感染的過去病例〔康復的個體〕，及ASC)，將2002年的100∶1血清稀釋時的2種抗體的水平進行制圖(圖30)。統(tǒng)計學分析使用χ2檢定進行。p＜0.05中有統(tǒng)計學意義。抗C-35抗體的水平在CH、LC及HCC組皆高，已痊愈的個體組變得非常低或無法檢測出。另一方面，抗NS5A-2132抗體的水平在CH、康復個體及ASC組較高，LC組為中等程度，HCC患者最低(p＜0.05vsCH)。
實施例4由luminex法檢測與HLA-A24+HCV感染患者血清的HCV肽具有反應性的IgG 使用認為靈敏度高于ELISA法的Luminex法，與實施例1相同，進行與HLA-A24+HCV感染患者血清的HCV肽具有反應性的IgG的檢測。
對肽對微小珠子的結合 將肽分別如下所述地結合在依據(jù)制造者的指示將各螢光色素含有量識別編碼化(以下稱為顏色編碼)的微小珠子(Luminex公司制，xMAP Multi-Analyte COOH Beads)上。在過濾平板的各孔中放入100μl經(jīng)顏色編碼化的未調(diào)制的微小珠子，經(jīng)吸引后以清洗用緩沖液(磷酸緩沖液生理食鹽水(PBS)(pH7.4±0.1)、Tween(注冊商標)20(0.05％v/v))清洗2次后同時吸引各孔。接下來放入50μl 0.1M MES(2-嗎啉代乙磺酸)緩沖液(pH7.0)，各孔添加各10μl的EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽)(1mg/ml/0.1M MES緩沖液(pH7.0))。在各孔內(nèi)混合數(shù)百μl的肽(1mg/ml，0.1M MES緩沖液，pH7.0)與該經(jīng)過清洗的微小珠子。然后，將與肽混合的微小珠子在暗處、室溫下反應20分鐘后，再在各孔中添加10μl EDC(1mg/ml/0.1M MES緩沖液(pH7.0))，在暗處、室溫下使其反應20分鐘，將該操作重復2次。吸引剩余液體后，在各孔中添加100μl 1Mtris-鹽酸緩沖液(pH7.0)，在暗處、室溫下使其反應15分鐘。接下來，將各孔的珠子用上述清洗用緩沖液進行3次清洗，在Block-Ace(注冊商標)中放入0.05％疊氮化鈉后調(diào)整以保存用溶液進行回收。
微小珠子混合物的調(diào)制 調(diào)制各孔的微小珠子時，將在如上所述地經(jīng)過顏色編碼化的微小珠子上結合肽得到的珠子溶液放入過濾平板，使每孔中約有5000個微小珠子(各孔中1種珠子約1μl)。另外，混合10種等量的如上所述地調(diào)制的微小珠子，用上述清洗用緩沖液(PBS，TWEEN(注冊商標)20(0.05％v/v))稀釋至總量約25μl，調(diào)制珠子混合物。
樣品的調(diào)制 使用血清。將血清使用反應用緩沖液(PBS(pH7.4±0.1)、Tween(注冊商標)20(0.05％v/v)、牛胎血清白蛋白(BSA)10mg/ml)稀釋至100～1000倍，分別調(diào)制100μl的血清稀釋液。
抗肽抗體測定 作為生物素化二次抗體，將生物素化羊抗人類IgG(γ鏈特異性)用上述反應用緩沖液稀釋后進行使用。作為螢光色素標記鏈霉抗生物素蛋白，將經(jīng)PE(藻紅素)標記的鏈霉抗生物素蛋白(SRPE)1mg/ml用上述反應用緩沖液稀釋(1/50稀釋)至20μl進行使用。
過濾平板的各孔中放入100μl上述清洗用緩沖液，繼續(xù)吸引除去。該清洗操作進行2次。然后，在各孔中放入25μl上述珠子混合物，將該96孔的過濾平板用該清洗用緩沖液清洗2次。清洗后，在所有孔中分別放入100μl上述樣品。接下來，封住過濾平板，在暗處、室溫下使用平板震蕩器(300rpm)震蕩2小時后，進行吸引。繼續(xù)在各孔中分別放入100μl上述清洗用緩沖液，吸引除去。該清洗操作進行3次。
然后，在各孔中分別放入100μl作為生物素化二次抗體的生物素化羊抗人類IgG(γ鏈特異性)，封住過濾平板，在暗處、室溫下使用平板震蕩器(300rpm)震蕩1小時。然后，進行吸引，在各孔中分別放入100μl上述清洗用緩沖液，吸引除去。該清洗操作進行3次。
接下來，在各孔中分別加入100μl SRPE，封住過濾平板，在暗處、室溫下使用平板震蕩器(300rpm)震蕩30分鐘。然后進行吸引，在各孔中分別放入100μl上述清洗用緩沖液，吸引除去。該清洗操作進行3次。然后，在各孔中分別放入100μl該清洗用緩沖液，使用平板震蕩器(300rpm)震蕩2～3分鐘后，將得到的50μl樣品用螢光閃爍計數(shù)系統(tǒng)進行測定。結果如圖31及32、及表5所示。
表5 實施例5使用來源于C型肝炎病毒的肽疫苗的HCV感染治療 對HLA-A2陽性或HLA-A24陽性的HCV感染者，研究使用本發(fā)明的來源于C型肝炎病毒的肽的疫苗的抗病毒效果。受試者均為感染HCV1b、且對利用干擾素與利巴韋林的治療無反應的患者。來源于C型肝炎病毒的肽C-35、NS5A-2132、E2-488、E1-213及NS3-1081在適合GMP的條件下合成、純化、制成凍干粉末進行保存。C-35、NS5A-2132、E2-488及NS3-1081的肽溶解在少量的DMSO(1mg/10～25μl)中，E1-213溶解在7％碳酸氫鈉注射液(碳酸氫鈉)(1mg/15μl)中。分別以注射用生理食鹽水進行稀釋(1～2mg/ml)，通過0.22μm濾器滅菌。該溶液與等量助劑(Montanide ISA-51)混合，得到乳化劑注射劑。其中對HLA-A2陽性的3名受試者給予C-35注射劑，對HLA-A24陽性的5名受試者給予NS5A-2132注射劑。給藥方式為2星期內(nèi)，每次將含有0.3mg肽的乳化劑注射于側腹部。持續(xù)監(jiān)測HCVRNA的量及GOT、GPT、γ-GTP、AFP的值。
結果如圖33及圖34所示。由上述圖可知，接受試驗的受試者在疫苗給藥開始后幾乎全部出現(xiàn)HCV RNA的量顯著降低，證明本發(fā)明的肽作為抗HCV疫苗是有效的。
產(chǎn)業(yè)上的利用性 本發(fā)明的來源于C型肝炎病毒的肽將HLA結合基序包含在其序列中，被與C型肝炎病毒具有反應的抗體識別，同時，還具有由HLA-A2或HLA-A24限制性細胞毒性T細胞的識別性。
因此，本發(fā)明的來源于C型肝炎病毒的肽可用作對HCV感染所引起的疾病有效的疫苗。
序列表
權利要求
1.一種來源于C型肝炎病毒的肽，所述肽在序列中含有HLA結合基序，且被從C型肝炎病毒患者中檢測出的抗體識別，其特征為，該肽具有序列號2～8、16、20及38中任一種表示的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的來源于C型肝炎病毒的肽，該肽具有與序列號2～8、16、20及38中的任一種氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
3.如權利要求1或2所述的來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為，該肽還具有利用HLA-A2或HLA-A24限制性細胞毒性T細胞的識別性。
4.一種多肽，其特征為含有如權利要求1至3中任一項所述的來源于C型肝炎病毒的肽。
5.一種多肽，其特征為，該多肽具有與權利要求4所述的多肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
6.如權利要求4或5所述的多肽，其特征為，該多肽還具有利用HLA-A2或HLA-A24限制性細胞毒性T細胞的識別性。
7.一種核苷酸，其特征為，該核苷酸編碼如權利要求1至3中任一項所述的來源于C型肝炎病毒的肽、或如權利要求4至6中任一項所述的多肽、或具有與這些肽互補的序列。
8.一種抗體或類似抗體活性物質(zhì)，其特征為識別如權利要求1至3中任一項所述的來源于C型肝炎病毒的肽、或如權利要求4至6中任一項所述的多肽。
9.一種載體，其特征為含有如權利要求7所述的核苷酸。
10.一種細胞毒性T細胞的誘導方法，其特征為使用如權利要求1至3中任一項所述的來源于C型肝炎病毒的肽、或如權利要求4至6中任一項所述的多肽在體外誘導出細胞毒性T細胞。
11.一種藥物組合物，其特征為含有如權利要求1至3中任一項所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權利要求4至6中任一項所述的多肽、如權利要求7所述的核苷酸、或如權利要求8所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)作為有效成分。
12.如權利要求11所述的藥物組合物，其特征為，藥物組合物為C型肝炎病毒疫苗。
13.一種診斷C型肝炎病毒感染癥或預測預后的試劑盒，其特征為含有如權利要求1至3中任一項所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權利要求4至6中任一項所述的多肽、如權利要求7所述的核苷酸、或如權利要求8所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為序列中含有HLA結合基序(binding-motif)，且由從C型肝炎病毒(HCV)患者體內(nèi)檢測出的抗體來識別。本發(fā)明的肽可用于C型肝炎病毒的診斷及C型肝炎的治療、及預后的預測。
文檔編號G01N33/53GK101230096SQ200810080938
公開日2008年7月30日 申請日期2004年9月22日 優(yōu)先權日2003年9月22日
發(fā)明者伊東恭悟, 山田亮, 佐田通夫 申請人:株式會社綠多肽