專利名稱：來源于c型肝炎病毒的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于C型肝炎病毒感染的診斷及C型肝炎的治療的C型肝炎病毒(HCV)肽。
更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及HCV肽、含有HCV肽的多肽、編碼HCV肽或前述多肽的核苷酸、或識(shí)別上述物質(zhì)的抗體或類似抗體活性物質(zhì)、含有前述核苷酸的載體、使用HCV肽或前述多肽誘導(dǎo)細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的方法、或使用HCV肽、前述多肽、前述核苷酸或前述抗體·類似抗體活性物質(zhì)的C型肝炎病毒檢測(cè)方法、C型肝炎的診斷、預(yù)防或治療方法、及預(yù)后的預(yù)測(cè)方法，以及含有上述物質(zhì)的C型肝炎治療用藥物組合物。
背景技術(shù)：
病毒性肝炎主要為病毒經(jīng)口感染的A型肝炎與通過血液感染的B型肝炎，除此以外，也有主要通過輸血等感染的C型肝炎等。該C型肝炎是慢性化后轉(zhuǎn)移為肝硬化或肝癌的機(jī)率非常高的疾病之一。
C型肝炎病毒(HCV)是屬于黃病毒科的單鏈RNA病毒，日本有200萬人以上、世界中有1億7000萬人為C型肝炎病毒感染者。
對(duì)該C型肝炎實(shí)施干擾素與利巴韋林(Ribavirin)并用治療方法，但僅對(duì)3～4成的患者有效，對(duì)于大多數(shù)患者而言目前并無有效的治療方法。因此，盡快開發(fā)出安全有效且簡(jiǎn)單的低成本診斷、及治療方法成為強(qiáng)烈的社會(huì)需求。
有證據(jù)顯示(WO89/04669)細(xì)胞性及體液性免疫應(yīng)答兩者在抑制HCV感染方面發(fā)揮主要作用。在過去的十多年間，眾多研究發(fā)現(xiàn)高免疫原性的HCV肽，發(fā)現(xiàn)多種可誘導(dǎo)細(xì)胞性或體液性免疫應(yīng)答的HCV肽(Hunziker et al.，Mol Immunol.2001 Dec；38(6)475-84)。然而，這些肽并非都具有臨床效果，實(shí)際上無論為預(yù)防還是為治療，至今仍然皆沒有有效的免疫治療手段。認(rèn)為主要原因在于上述肽的免疫原性較弱。
另外，本發(fā)明人等已提出數(shù)個(gè)由細(xì)胞傷害性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別出的抗原肽具有在活體內(nèi)或活體外皆可導(dǎo)出細(xì)胞性免疫應(yīng)答及體液性免疫應(yīng)答雙方的能力(Gohara et al.，J Immunother.2002Sep-Oct；25(5)439-44，Mine et al.，Clin Cancer Res.2001 Dec；7(12)3950-62，Tanaka et al.，J Immunother.2003Jul-Aug；26(4)357-66，Mine et al.，Cancer Sci.2003Jun；94(6)548-56)。
而且，由細(xì)胞性及體液性免疫應(yīng)答兩者識(shí)別的HCV肽具有高于僅由細(xì)胞性免疫應(yīng)答識(shí)別的肽的免疫原性。
作為順應(yīng)社會(huì)需求的新對(duì)策之一，因已累積可誘導(dǎo)細(xì)胞性免疫應(yīng)答及體液性免疫應(yīng)答兩者的HCV肽與僅具有體液性免疫應(yīng)答的肽相比，具有更高的免疫原性一連串認(rèn)知，所以可舉出特別指定上述肽的對(duì)策。
在確認(rèn)上述肽的同時(shí)，調(diào)查其是否可作為抑制HCV感染的新型治療方法及診斷手段的候補(bǔ)物質(zhì)是有益的。
因此，本發(fā)明人等針對(duì)與被HLA-A2及HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別的肽具有反應(yīng)性的IgG是否可從HCV感染者的血清中檢測(cè)出進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)幾個(gè)CTL表位具有特異性的IgG與不同的HLA class I型或不同的HCV基因型無關(guān)，可由大多數(shù)HCV感染患者中檢出。并且，由該結(jié)果得知，上述肽可提供以肽為基礎(chǔ)的預(yù)防及治療用新型方法，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的為提供一種HCV肽，其特征為，該HCV肽由細(xì)胞性免疫應(yīng)答及體液性免疫應(yīng)答識(shí)別、且具有高免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述課題，本發(fā)明提供一種來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為序列中含有HLA結(jié)合基序(binding-motif)，且由C型肝炎病毒患者的血中抗體來識(shí)別。
本發(fā)明的優(yōu)選方案為提供一種具有序列表的序列號(hào)1～8、16、20及38中任一種表示的氨基酸序列的來源于C型肝炎病毒的肽、具有與該肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的來源于C型肝炎病毒的肽、及還具有由HLA-A2或HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別性的來源于C型肝炎病毒的肽。
本發(fā)明的其它方案為提供含有該來源于C型肝炎病毒的肽的多肽。作為該方案發(fā)明的優(yōu)選方案，提供一種具有與該多肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的多肽、及還具有由HLA-A2或HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T細(xì)胞產(chǎn)生的識(shí)別性的多肽。
另外，本發(fā)明的另一方案為提供一種核苷酸，其為編碼該來源于C型肝炎病毒的肽、或該多肽的核苷酸。
本發(fā)明的另一方案為提供一種抗體或類似抗體活性物質(zhì)，其可以免疫學(xué)的方式識(shí)別該來源于C型肝炎病毒的肽、或該多肽。
作為本發(fā)明的另一方案，提供一種含有上述核苷酸的載體。
另外，本發(fā)明的另一方案為提供一種細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，其特征為使用編碼該來源于C型肝炎病毒的肽、或該多肽的該核苷酸來誘導(dǎo)細(xì)胞傷害性T細(xì)胞。
作為本發(fā)明的另一方案，提供一種C型肝炎病毒的檢測(cè)方法，其使用該來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
另外，作為本發(fā)明的另一方案，提供一種C型肝炎等HCV感染相關(guān)疾病的診斷方法，其使用上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
而且，另一方案為提供一種C型肝炎等HCV感染相關(guān)疾病的治療方法，其使用上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
本發(fā)明的另一方案為提供一種藥物組合物，其含有上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)作為有效成分。另外，作為優(yōu)選方案，提供一種藥物組合物，該藥物組合物為C型肝炎病毒疫苗。
作為本發(fā)明的另一方案，提供一種C型肝炎等HCV感染相關(guān)疾病的預(yù)后預(yù)測(cè)方法，其使用上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。
本發(fā)明的另一方案為提供一種診斷C型肝炎或預(yù)后預(yù)測(cè)的試劑盒，其含有上述來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸、或抗體、或類似抗體活性物質(zhì)。


圖1是表示本發(fā)明中以ELISA法得到的HCV感染患者血中的IgG測(cè)定結(jié)果的圖。
圖2是表示本發(fā)明中以ELISA法得到的HCV感染患者血中的IgG測(cè)定結(jié)果的圖。
圖3是表示本發(fā)明中在圖1所示患者血清中的C-35肽反應(yīng)性抗體的代表例的吸收·溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。
圖4是表示本發(fā)明中的6種來自HCV的HLA-A24結(jié)合肽(No.3、12、13、25、32、38)的CTL誘導(dǎo)結(jié)果的圖。
圖5是表示本發(fā)明中的來自HCV的HLA-A2結(jié)合性肽(No.40至No.57)的CTL誘導(dǎo)結(jié)果的圖。
圖6是表示本發(fā)明中由51Cr游離試驗(yàn)得到的肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害活性的代表性結(jié)果的圖。
圖7是表示本發(fā)明中由51Cr游離試驗(yàn)得到的肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害活性的代表性結(jié)果的圖。
圖8是表示本發(fā)明中由使用抗CD8單克隆抗體的抑制試驗(yàn)確認(rèn)肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害性的HLA class I限制性的圖。
圖9是表示HCV感染患者血清中抗肽IgG的檢測(cè)圖。
圖10是表示HCV感染患者血清中抗肽IgG的檢測(cè)圖。
圖11是表示對(duì)HCV感染患者血清中的抗肽IgG的特異性進(jìn)行調(diào)查的吸附試驗(yàn)結(jié)果的圖。
圖12是表示對(duì)HCV感染患者血清中的抗肽IgG的特異性進(jìn)行調(diào)查的溶出試驗(yàn)結(jié)果的圖。
圖13是表示由肽刺激PBMC導(dǎo)致IFN-γ產(chǎn)生的圖。
圖14是表示由肽刺激PBMC導(dǎo)致IFN-γ產(chǎn)生的圖。
圖15是表示肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害性的圖。
圖16是表示肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害性的圖。
圖17是表示對(duì)表達(dá)NS5A的細(xì)胞的肽刺激PBMC的CTL活性的圖。
圖18是表示對(duì)表達(dá)NS5A的細(xì)胞的肽刺激PBMC的CTL活性的圖。
圖19是表示對(duì)表達(dá)NS5A的細(xì)胞的肽刺激PBMC的CTL活性的圖。
圖20是表示抗NS5A-2132IgG活性的特異性的圖。
圖21是表示由抗NS5A-2132IgG導(dǎo)致的細(xì)胞增殖阻礙分析結(jié)果的圖。
圖22是表示抗NS5A-2132IgG的ADCC活性分析結(jié)果的圖。
圖23是表示各種疾病的抗C-35抗體及抗NS5A-2132抗體的檢測(cè)圖。
圖24是表示抗肽抗體的HLA或HCV基因型限制性的圖。
圖25是表示抗肽抗體的HLA或HCV基因型限制性的圖。
圖26是表示患者血清中抗NS5A-2132抗體的測(cè)定結(jié)果的圖。
圖27是表示患者血清中抗NS5A-2132IgG的測(cè)定結(jié)果的圖。
圖28是表示患者血清中抗NS5A抗體的水平及HCV RNA水平的圖。
圖29是表示世代研究(Cohort Study)的抗C-35抗體及抗NS5A-2132抗體的檢測(cè)圖。
圖30是表示世代研究(Cohort Study)的抗NS5A-2132抗體的檢測(cè)圖。
圖31是表示本發(fā)明中，由Luminex法得到的HCV感染患者血中IgG測(cè)定結(jié)果的圖。
圖32是表示本發(fā)明中由Luminex法得到的HCV感染患者血中IgG測(cè)定結(jié)果的圖。
圖33是表示使用本發(fā)明的肽的C型肝炎治療過程的圖。
圖34是表示使用本發(fā)明的肽的C型肝炎治療過程的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述來源于C型肝炎病毒的肽是含有HLA結(jié)合基序(binding-motif)、且可由C型肝炎病毒患者的血中抗體識(shí)別出的HCV肽。
另外，本發(fā)明的HCV肽在其序列中含有HLA結(jié)合基序，即，HLA-A2或HLA-A24結(jié)合基序。且該HCV肽由細(xì)胞性免疫應(yīng)答及體液性免疫應(yīng)答識(shí)別，同時(shí)，顯示較高的免疫原性。
作為上述HCV肽，例如可包含下述表1及表3所舉出的肽。本發(fā)明中特別優(yōu)選的HCV肽之一為包含具有以下氨基酸序列的HLA-A2結(jié)合性基序的肽C-35YLLPRRGPRL(序列號(hào)1)對(duì)于HCV感染者而言，對(duì)該肽的肽反應(yīng)性IgG抗體的檢測(cè)率及HCV感染癥特異性分別為93％與100％，非常高。另外，本發(fā)明中特別優(yōu)選的其它HCV肽為包含具有以下氨基酸序列的HLA-A24結(jié)合性基序的肽NS5A-2132RYAPACKPL(序列號(hào)2)E2-488HYAPRPCGI(序列號(hào)3)E1-213VYEAADMIM(序列號(hào)4)NS3-1081VYHGAGSKTL(序列號(hào)5)C-176IFLLALLSCL(序列號(hào)6)C-173SFSIFLLALL(序列號(hào)7)EYVLLLFLL(序列號(hào)8)PYIEQGMQL(序列號(hào)16)IFTITKILL(序列號(hào)20)SFAIKWEYVL(序列號(hào)38)
特別是NS5A-2132，對(duì)于多數(shù)HLA-A24陽性患者而言，可誘導(dǎo)細(xì)胞性免疫及體液性免疫兩者。
本發(fā)明的HCV肽也可為與該肽的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選為80％或80％以上、更優(yōu)選為90％或90％以上同源性的肽。
另外，本發(fā)明的HCV肽也可以進(jìn)一步含有由HLA-A2或HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T細(xì)胞(CTL)識(shí)別的肽。由在細(xì)胞內(nèi)制造的抗原蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)分解出的肽構(gòu)成的、可與該HLA結(jié)合的抗原肽中，每個(gè)HLA型均在該序列內(nèi)存在基序(motif)，細(xì)胞傷害性T細(xì)胞(CTL)可識(shí)別該抗原肽與HLA的復(fù)合體來破壞HCV感染細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽在該氨基酸序列中含有上述本發(fā)明的肽的氨基酸序列，該氨基酸的總數(shù)并無特別限定。另外，在本發(fā)明的多肽中，超過構(gòu)成該肽的氨基酸的其余氨基酸位于該肽的氨基酸N-末端及/或C-末端側(cè)、或上述兩側(cè)。因此，該多肽具有與上述肽的功能及作用實(shí)質(zhì)相同的功能及作用。需要說明的是，本說明書中，即使僅記載“肽”時(shí)，只要無特別否定時(shí)，均應(yīng)當(dāng)理解為包含“多肽”。
具有如上所述地定義的氨基酸序列的肽可使用下述方法得到一般的化學(xué)合成法，蛋白質(zhì)分子酶分解法，使用進(jìn)行了轉(zhuǎn)化、使編碼目標(biāo)氨基酸序列的堿基序列表達(dá)的宿主的基因重組技術(shù)等。
采用化學(xué)合成法制造作為目標(biāo)的該肽時(shí)，可依據(jù)一般的肽化學(xué)中公知的慣用方法進(jìn)行制造，例如使用肽合成機(jī)由固相合成法合成。如此得到的粗肽可由蛋白質(zhì)化學(xué)中一般使用的純化方法、例如鹽析法、極限過濾法、逆相色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等而純化。
另一方面，以基因重組技術(shù)生產(chǎn)所希望的該肽時(shí)，例如可以將編碼上述合成的目標(biāo)氨基酸序列的DNA片段插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，使用該表達(dá)載體對(duì)微生物或動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，從而得到所希望的該肽。作為可使用的表達(dá)載體，可使用該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)公知的質(zhì)粒、病毒載體等。
作為該肽生產(chǎn)技術(shù)中使用表達(dá)載體的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法，可使用公知方法，例如氯化鈣法、磷酸鈣共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofectin)法、電穿孔法(electroporation)等，可依據(jù)所使用的宿主細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)選擇。得到的肽的純化可采用上述純化法對(duì)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中回收的細(xì)胞提取液或培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化。
作為該發(fā)明的其它方案之一的核苷酸，包括含有上述來源于C型肝炎病毒的肽或上述多肽的寡核苷酸或聚核苷酸，包括核糖核苷酸或去氧核苷酸。另外，該核苷酸也可以利用本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行改變。該核苷酸的改變例如包含公知的標(biāo)記、甲基化、“caps”、由類似物取代1個(gè)或1個(gè)以上天然核苷酸、核苷酸內(nèi)改變等。核苷酸內(nèi)改變可舉出例如非離子性改變(例如，甲基磷酸、磷酸三酯、磷酰胺酯等)、離子性改變(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、例如蛋白質(zhì)(例如，核酸水解酶、毒素、抗體、信號(hào)肽等)的修飾部分的改變，利用螯合劑(例如金屬、硼等)的改變等。
上述核苷酸序列可提供一種被編碼在HCV的基因組中的HCV抗原的肽及多肽序列，另外，可以提供用作診斷試驗(yàn)或疫苗成分的有用的肽。
一旦獲得本發(fā)明的核苷酸，就可構(gòu)筑核苷酸探針及肽，上述核苷酸探針及肽在診斷HCV感染相關(guān)疾病方面，或篩選血液中或血液制劑中的HCV感染方面是有用的。由該核苷酸序列可合成例如24至30個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的DNA寡聚物。該核苷酸還可作為用于檢測(cè)受試者血清中的HCV RNA、或用于篩選血液或血液制劑中HCV存在的探針而使用。
另外，該核苷酸序列可設(shè)計(jì)、生產(chǎn)出作為診斷對(duì)HCV的抗體存在的試藥也有用的HCV特異性肽。且對(duì)于來自該序列的純化肽的抗體，也可用于檢測(cè)HCV感染者及HCV感染血液制劑中的HCV抗原。
作為本發(fā)明的另一方案之一的抗體包括來自該C型肝炎病毒的肽、對(duì)該多肽具有反應(yīng)性的嵌合抗體、改變抗體、單價(jià)抗體、Fab、F(ab’)2、Fab’、單鏈Fv(scFv)蛋白質(zhì)以及單一結(jié)構(gòu)域抗體。另外，該抗體可以免疫學(xué)的方式識(shí)別該肽或該多肽。
作為本發(fā)明的另一方案之一的載體為含有該核苷酸、可以將所選擇的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的構(gòu)筑物，可以在該宿主中表達(dá)不同種類的編碼序列。該表達(dá)載體可為克隆用載體或插入用載體任一。
作為克隆用載體例如可使用質(zhì)粒、病毒(例如腺病毒質(zhì)粒載體)等。另外，該克隆用載體是可轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、且具有在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核苷酸復(fù)制能力的復(fù)制子(例如，質(zhì)粒、染色體、病毒、粘粒等)。
另一方面，插入用載體雖在宿主細(xì)胞中不發(fā)揮復(fù)制子的作用，但其是為了穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主而具有將駐留物插入宿主中的復(fù)制子(典型例為染色體)內(nèi)的能力的載體。
作為本發(fā)明的其它方案之一，包括通過使用該肽誘導(dǎo)以HCV細(xì)胞作為目標(biāo)的細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的誘導(dǎo)方法為，例如在表達(dá)HLA-A2的細(xì)胞中添加該肽，使其表達(dá)在HLA-A2上，以由HLA-A2表達(dá)該肽的細(xì)胞刺激T細(xì)胞后，誘導(dǎo)該T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CTL。該方法中所使用的HLA-A2表達(dá)細(xì)胞可由HCV患者的血液中采集，但也可在非HLA-A2表達(dá)細(xì)胞中導(dǎo)入編碼HLA-A2的基因而制成。因此，本發(fā)明的該肽不僅可用于HCV檢測(cè)及診斷，也可作為C型肝炎病毒相關(guān)疾病的疫苗等藥物組合物使用。
另外，如上所述地誘導(dǎo)出的CTL因以HCV感染細(xì)胞作為目標(biāo)，攻擊該HCV感染細(xì)胞，因此，可與該肽同樣地用作細(xì)胞治療法等的藥物組合物。
而且，作為本發(fā)明的其它方案的該來源于C型肝炎病毒的肽、多肽、核苷酸及/或抗體、類似抗體活性物質(zhì)可用于檢測(cè)、診斷HCV感染。
HCV的檢測(cè)及HCV相關(guān)疾病的診斷，例如利用與編碼該肽的核酸序列的相互作用及/或反應(yīng)性，根據(jù)該肽存在的檢測(cè)、對(duì)應(yīng)核酸序列存在量的檢測(cè)、在該肽的個(gè)體中活體分布的確定/或來自個(gè)體的檢體中存在量的確定來進(jìn)行。換言之，可通過將該肽作為標(biāo)記物進(jìn)行檢定來進(jìn)行HCV的檢測(cè)及HCV相關(guān)疾病的診斷。另外，該測(cè)定可使用公知的測(cè)定方法進(jìn)行，作為這種測(cè)定方法，例如可舉出利用抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)、酶反應(yīng)系統(tǒng)、PCR反應(yīng)系統(tǒng)等的方法。
HCV相關(guān)疾病的治療效果的確認(rèn)及預(yù)后的預(yù)測(cè)可通過監(jiān)測(cè)罹患HCV相關(guān)疾病的受試者體內(nèi)具有對(duì)該肽的反應(yīng)性的抗體的血中濃度來進(jìn)行。特優(yōu)選測(cè)定出受試者血中的抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平。
作為本發(fā)明的另一方案的藥物組合物例如可舉出疫苗。疫苗由來源于C型肝炎病毒的肽、多肽及/或核苷酸組成，適當(dāng)含有醫(yī)學(xué)上可接受的助劑及/或載體。作為助劑可使用可強(qiáng)化免疫應(yīng)答的助劑，例如freund的不完全助劑、氫氧化鋁膠等。另外，作為載體例如可使用PBS、蒸餾水等稀釋劑、生理鹽水等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)其使用方式，例如通過口服、靜脈給藥或皮下給藥等非口服或經(jīng)皮途徑進(jìn)行給藥。作為其劑型例如可舉出片劑、顆粒劑、軟膠囊劑、硬膠囊劑、液劑、油劑、乳化劑等。該藥物組合物的給藥量，可依據(jù)給藥患者的癥狀等適當(dāng)改變，一般而言成人每日給藥量以該肽量計(jì)可以為0.1～10mg，給藥間隔可以為數(shù)日或數(shù)月一次。
本說明書中所引用的所有專利及參考文獻(xiàn)內(nèi)容皆為本說明書的一部分。另外，作為本案所要求的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2003-330258號(hào)說明書及附圖的內(nèi)容皆引用作為本案說明書的一部分。
實(shí)施例由實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅為更具體說明本發(fā)明所舉例，本發(fā)明并不限定于以下的實(shí)施例。
需要說明的是，以下實(shí)施例所使用的氨基酸的簡(jiǎn)稱如下。
A為丙氨酸、C為胱氨酸、D為天門冬氨酸、E為谷氨酸、F為苯丙氨酸、G為甘氨酸、H為組氨酸、I為異亮氨酸、K為賴氨酸、L為亮氨酸、M為蛋氨酸、P為脯氨酸、R為精氨酸、S為絲氨酸、T為蘇氨酸、V為纈氨酸、Y表示酪氨酸。
實(shí)施例1與HCV感染者血清中的HCV肽具有反應(yīng)性的IgG的檢測(cè)肽使用具有來自HCV基因型1b蛋白質(zhì)的保存區(qū)域的HLA-A2結(jié)合性基序或HLA-A24結(jié)合性基序的合成肽(如表1)。作為陰性對(duì)照組使用具有HLA-A2結(jié)合性基序的來自HIV的肽。上述肽均使用市售品，其純度由逆相高壓液相色譜法進(jìn)行分析的結(jié)果為90％或90％以上。
表1


切斷值為1.83。
表2

檢測(cè)率按切斷值為陽性的患者的數(shù)目計(jì)算(平均±3SD)。
NS5A-2132為0.202，C-35為0.13。
統(tǒng)計(jì)解析以χ2試驗(yàn)進(jìn)行。
ELISA血清中的肽特異性IgG由ELISA測(cè)定。首先將各肽溶解于二甲基亞砜(DMSO)，于-80℃保存。將肽用含有作為交聯(lián)劑的二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)的0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液稀釋。在ELISA平板中，使肽按20μg/孔在4℃下反應(yīng)一夜而結(jié)合?？滓?.05％Tween20-PBS(PBST)清洗3次，平板以Block-Ace(注冊(cè)商標(biāo))密封，于4℃下放置一晚。將血漿或血清樣品用0.05％的Tween20-BlockAce分別稀釋100、200及400倍，每孔添加100μl所得的各樣品。樣品于37℃下培養(yǎng)2小時(shí)后，將平板用PBST清洗9次，每孔添加100μl稀釋1000倍的兔子抗人類IgG(γ鏈特異性)，并于37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。再以PBST清洗9次后，每孔添加100μl稀釋100倍的與老鼠抗兔子IgG共價(jià)鍵合的西洋芥末過氧化酶·葡聚糖聚合物，將平板于室溫下培養(yǎng)40分鐘。清洗平板后，每孔添加100μl四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)溶液，添加2.0M磷酸使反應(yīng)停止。切斷值由健康者的光密度對(duì)照組的平均±3SD算出。
肽特異性IgG的吸收及溶出將每孔100μl的血漿或血清樣品以0.05％Tween20-Block Ace(注冊(cè)商標(biāo))稀釋，使固定在平板的孔中的肽(每孔20μg)于37℃下吸收2小時(shí)。此操作重復(fù)3次后，利用ELISA測(cè)定上清液中的肽特異性IgG水平。將在初次吸附中結(jié)合于肽固定平板上的抗體用各孔為30μl的5M NaCl/50mM檸檬酸緩沖液(pH3.0)(以1.0M Tris-HCl的0.05％Tween20-Block Ace(pH7.5)進(jìn)行中和)進(jìn)行溶出，利用ELISA測(cè)定溶出的部分的肽特異性IgG水平。
肽特異性CTL測(cè)定肽特異性CTL的檢測(cè)中采用的方法可使用本領(lǐng)域的慣用方法。將PBMC添加至U底型96孔微量培養(yǎng)平板的各孔中，直至每孔含1×105個(gè)細(xì)胞，與10μM的肽同時(shí)于200μl的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。該培養(yǎng)基的組成為45％RPMI-1640、45％AIM-V(注冊(cè)商標(biāo))、10％牛胎血清(FCS)、100U/ml的干擾素2(IL-2)、與1mM MEM非必須氨基酸溶液。培養(yǎng)第3天、第6天、第9天時(shí)各除去一半培養(yǎng)基，換上含有所對(duì)應(yīng)的肽(20μg/ml)的新培養(yǎng)基。培養(yǎng)第12天采集培養(yǎng)后的細(xì)胞，進(jìn)行對(duì)應(yīng)的肽或作為陰性對(duì)照組的HIV肽中任一種產(chǎn)生對(duì)預(yù)先附著的CIR-A2402細(xì)胞或T2發(fā)生應(yīng)答的干擾素γ(IFN-γ)的能力的試驗(yàn)。對(duì)于各肽，使用4個(gè)孔，進(jìn)行2次測(cè)試。所得的值減去對(duì)HIV肽發(fā)生應(yīng)答的本底IFN-γ的產(chǎn)生。對(duì)于抑制測(cè)試，肽反應(yīng)性CTL使用CD8分離試劑盒進(jìn)行純化，該肽特異性IFN-γ的產(chǎn)生在20μg/ml的抗HLAclass I(W6/32，IgG2a)單克隆抗體、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)單克隆抗體或抗HLA class II(H-DR-1，IgG2a)單克隆抗體中的任一種的存在下進(jìn)行測(cè)定。從所得的值中減去本底IFN-γ的產(chǎn)生。
統(tǒng)計(jì)其值以平均值+/-SD表示。統(tǒng)計(jì)分析使用Mann-Whitney U檢定或標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來進(jìn)行。p＜0.05的值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
對(duì)HCV肽的抗體檢測(cè)對(duì)于12名HCV感染患者與10名健康者(HD)的血清，測(cè)定其對(duì)62種肽產(chǎn)生反應(yīng)的IgG水平(表1)。對(duì)各肽的抗體陽性率如表1所示。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)與HCV感染者的血中IgG進(jìn)行高比率反應(yīng)、且?guī)缀醪慌c健康人血清反應(yīng)的肽。
例如，No3的NS5A-2132(相當(dāng)于HCV的NS5A蛋白質(zhì)的第2132號(hào)至第2140號(hào)，以下相同故省略)、No11(NS3-1266)、No12(E2-488)、No13(E1-213)、No22(NS2-947)、No25(NS3-1081)、No32(C-176)、No38(C-173)、No40(C-35)、No62(NS5B-2990)等。由代表性的ELISA法所得的HCV感染患者的血中IgG測(cè)定結(jié)果如圖1及圖2所示。
圖1所示的患者血清中檢測(cè)出對(duì)C-35的IgG抗體。
圖2的(A)-(D)所示的4名患者血清中分別檢測(cè)出NS5A-2132(A)、NS3-1081(B)、E2-488及E1-213(C)、C-176及C-173(D)反應(yīng)性IgG抗體。這些肽反應(yīng)性抗體的肽特異性可由吸收及溶出試驗(yàn)加以確認(rèn)。
以圖1所示的患者血清中的C-35肽反應(yīng)性抗體的吸收·溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為代表例示于圖3。該抗體雖被C-35吸收，但未被作為無關(guān)系的肽的NS5A-2252吸收(圖3上段)。而且該抗體由C-35吸收部分溶出(圖3下段)。
表1中C-35肽反應(yīng)性抗體于HCV感染者中為100％，而健康人中為0％，顯示高HCV特異性。HCV的C-35肽的序列與各種病毒，例如HIV-1的tet蛋白質(zhì)(第54至第58號(hào)的氨基酸序列)或env蛋白質(zhì)(5-9、158-162、717-727的氨基酸序列)顯示部分同源性。另外，HTLV-1的各種蛋白質(zhì)(pol 724-755、rex 5-9、rex 310-313、tax 70-74等)皆顯示同源性。針對(duì)HCV感染癥相關(guān)疾病60例(慢性C型肝炎22例、肝硬化20例、肝癌18例)、B型肝炎病毒感染者24例、B型肝炎病毒疫苗接種者10例、健康人27例、自身免疫疾病患者22例、HTLV-I感染者10例、及HIV感染者3例、共計(jì)156例進(jìn)行雙盲檢定調(diào)查C-35肽反應(yīng)性抗體。其結(jié)果如表2所示。由該結(jié)果得知，C-35肽反應(yīng)性抗體的HCV特異性及檢測(cè)率分別為88.5％及93.3％。
肽特異性CTL活性的誘發(fā)將6種HLA-A24結(jié)合肽(No3、12、13、25、32、38)及18種HLA-A2結(jié)合肽(由No40至No57)與HLA-A24或HLA-A2陽性的HCV感染者各5名的末梢血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行培養(yǎng)。作為對(duì)照組，將該P(yáng)BMC與HIV肽進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)上述培養(yǎng)PBMC，調(diào)查對(duì)脈沖對(duì)應(yīng)的肽的C1R-A2402細(xì)胞或T2細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答的IFN-γ產(chǎn)生能力。其結(jié)果為6種HLA-A24結(jié)合肽(No3、12、13、25、32、38)可由10名HLA-A24陽性HCV患者的PBMC誘導(dǎo)出CTL(圖4)。另外，來自由HLA-A24結(jié)合性肽產(chǎn)生的(B)HCV的HLA-A2結(jié)合性肽(No40至No57)可由5名HLA-A2陽性HCV患者的PBMC誘導(dǎo)出CTL(圖5)。
而且，由肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害活性可采用51Cr游離試驗(yàn)加以確認(rèn)。其代表性結(jié)果如圖6及圖7所示。
圖6表示由來自HCV的HLA-A24結(jié)合性肽(No3、12、13、25、32、38)從HLA-A24陽性HCV患者PBMC誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞傷害活性。對(duì)附著誘導(dǎo)肽的C1R-A2402細(xì)胞(圖中以C1RA2402表示)的細(xì)胞傷害作用，與作為對(duì)照組的附著HIV肽的C1R-A2402細(xì)胞(圖中以C1RA2402HIV表示)相比顯著高。
圖7表示由來自HCV的HLA-A2結(jié)合性肽(No40、41)從HLA-A2陽性HCV患者末梢血PBMC誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞傷害活性。對(duì)附著誘導(dǎo)肽的T2細(xì)胞(圖中以T2表示)的細(xì)胞傷害作用，與對(duì)照組的附著HIV肽的T2細(xì)胞(圖中以T2HIV表示)相比為顯著高。
由結(jié)果得知，這些PBMC對(duì)預(yù)先填裝了對(duì)應(yīng)肽(作為陰性對(duì)照組的HIV肽除外)的C1R-A2402及T2細(xì)胞顯示有意差水平的細(xì)胞傷害性。
該細(xì)胞傷害性的HLA class I限制性使用抗CD8單克隆抗體的抑制試驗(yàn)來確認(rèn)(圖8)。圖8表示利用CTL活性的抗CD8抗體進(jìn)行抑制的代表例。由來源于HCV的HLA-A2結(jié)合性肽(No40)由HLA-A2陽性HCV患者PBMC誘導(dǎo)出的CTL細(xì)胞傷害活性可被抗CD8抗體抑制，但未被抗CD4或?qū)φ战M的抗CD14抗體抑制。
實(shí)施例2對(duì)HLA-A24陽性HCV感染患者血清中的HCV肽具有反應(yīng)性的IgG檢測(cè)受試者在更大范圍內(nèi)，對(duì)HLA-A24陽性的HCV感染患者，檢測(cè)對(duì)HCV肽具有反應(yīng)性的IgG。60名HCV1b+患者采用第2代或第3代免疫測(cè)試進(jìn)行判斷，抗HCV抗體(Ab)為血清陽性。患者血清中的HCV的基因型采用RT-PCR進(jìn)行判定。血清取樣時(shí)的患者診斷通過生化學(xué)分析、超音波檢查、計(jì)算機(jī)連動(dòng)斷層攝影、及組織學(xué)觀察來進(jìn)行。診斷結(jié)果如下所示慢性肝炎(CH，n＝24)、肝硬化(LC，n＝18)、及肝細(xì)胞癌(HCC，n＝18)。作為陰性對(duì)照，使用有正常肝功能，無肝炎病毒病歷的20名健康提供者(HD)的血清樣品。
肽及肽反應(yīng)性抗體的測(cè)定使用來自HCV1b蛋白質(zhì)保存良好的區(qū)域、基于與HLA-A24分子的高結(jié)合中心(Bioinformatics and Molecular Analysis Section，NIH，Bethesda，MD)選擇的44種合成肽。作為陰性對(duì)照組使用具有HLA-A24結(jié)合基序的來自HIV的肽(RYLRDQQLLGI(序列號(hào)63))。結(jié)合評(píng)分及序列如表3所示。為了篩選肽對(duì)血清IgG的反應(yīng)性，使用由BioSyntehsis(Lewisville，TX)或SynPep(Dublin，CA)購得的上述脫鹽等級(jí)(＞70％)的肽。之后的實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)純化的肽(＞90％)。肽特異性IgG的血漿水平由酶抗體法(ELISA)測(cè)定。血漿樣品的抗肽IgG的特異性試驗(yàn)利用肽反應(yīng)性IgG的吸收及溶出來進(jìn)行。
肽特異性CTL的測(cè)定在肽特異性CTL前體細(xì)胞的檢測(cè)中使用的方法如Hida等(CancerImmunol Immunother 2002；51219-228)所記載的內(nèi)容。阻礙試驗(yàn)使用20μg/ml的抗HLA class I(W6/32，IgG2a)、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)、抗CD4(Nu-Th/i，IgG1b)、及抗HLA-class II(H-DR-1，IgG)單克隆抗體。
對(duì)由NS5A基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的肽刺激PBMC的CTL活性NS5A、HLA-A2402及HLA-A2601的cDNA分別利用RT-PCR由Huh7(NNU50-1)細(xì)胞、C1R-A2402細(xì)胞及KE4-CTL細(xì)胞得到，在表達(dá)載體pCR3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)中進(jìn)行克隆(cloning)。Huh7(NNU50-1)細(xì)胞株是來自感染HCV1b的細(xì)胞株的復(fù)制子細(xì)胞，由NS3表達(dá)NS5B的蛋白質(zhì)(Kishine et al.，Biochem Biophys ResCommun 2002；293993-999)。其次，將100ng的NS5A、HLA-A2402或NS5A、及HLA-A2601cDNA(作為陰性對(duì)照組)混合在含有0.6μl的Fugene6(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的100μl的Opti-MEM(Invitrogen)中，進(jìn)行30分鐘的培養(yǎng)。其次將100μl的混合物添加于COS-7細(xì)胞(1×104細(xì)胞)中，將其培養(yǎng)6小時(shí)。將100μl含有20％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基添加到混合物中，培養(yǎng)COS-7細(xì)胞2天，加入NS5A 2132-2140刺激PBMC(2×105細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)18小時(shí)后，取出100μl的上清液，對(duì)3孔進(jìn)行ELISA測(cè)定得到IFN-γ濃度。為了制造出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞株，將pCR3.1-NS5A或pCR3.1-HLA-A3101(陰性對(duì)照)中的任一種使用Gene Pulser(BioRAD，Richmond，CA)，在C1R-A2402細(xì)胞子，利用電穿孔法(electroporation)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將上述細(xì)胞在新霉素(G418)的存在下培養(yǎng)30～40天，回收新霉素抗性細(xì)胞。轉(zhuǎn)染子中的NS5A蛋白質(zhì)的表達(dá)由使用抗NS5多克隆抗體(Abcam Limited，Cambridge，UK)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析。
增殖阻礙及抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞傷害(ADCC)將Huh7細(xì)胞株在平底96孔微量培養(yǎng)平板的孔中，于各種血清存在下培養(yǎng)24、48及72小時(shí)。培養(yǎng)后以細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(10μl/孔)(Dojindo，Japan)計(jì)算Huh7細(xì)胞。為了進(jìn)行ADCC測(cè)定，將由HLA-A24陽性的HD新分離出的PBMC，在含有各種患者或HD(作為陰性對(duì)照)的不活化血清(56℃，30分鐘)的10％FCS及RPMI-1640培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1.5小時(shí)。將C1R-A2402細(xì)胞及C1R細(xì)胞(作為陰性對(duì)照)與NS5A2132-2140肽(10μM)一起培養(yǎng)2小時(shí)，以Na251CrO4進(jìn)行1.5小時(shí)的放射性標(biāo)記，經(jīng)清洗后作為目標(biāo)細(xì)胞使用。將肽刺激PBMC于96U底微量培養(yǎng)平板的孔中以40、20及10比1的效應(yīng)子與目標(biāo)細(xì)胞之比(E/T)，與目標(biāo)細(xì)胞一同進(jìn)行培養(yǎng)。在37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，回收無細(xì)胞上清液，測(cè)定ADCC活性(Shomura，et al.，Br J Cancer 2004；901563-1571)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用標(biāo)準(zhǔn)t檢定及Mann-Whitney U檢定進(jìn)行。P＜0.05的值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
對(duì)HCV-肽的體液性免疫應(yīng)答的檢測(cè)為了篩選對(duì)肽的體液性免疫應(yīng)答，對(duì)感染HCV-1b的12名患者的血漿，測(cè)定對(duì)44種肽的各IgG反應(yīng)性水平。使用10名HD的血漿作為陰性對(duì)照組。肽反應(yīng)性IgG的水平利用ELISA測(cè)定連續(xù)稀釋的血漿樣品，得到各樣品的吸光度(OD)。將1∶100的血漿稀釋的上述肽的切斷值作為0.18OD{10名HD平均(0.08)+2SD(0.05×2)}。對(duì)NS5A-2132、C-176、E2-488、E1-213、C-173、及NS3-1081肽為有意義水平(1∶100的血清稀釋下＞0.18OD)的IgG反應(yīng)性在12名患者的血漿中分別可以檢測(cè)出12、11、10、9、8及5名(圖9)。如預(yù)測(cè)所述，上述肽中的任一種對(duì)10名HD的血漿均不具有反應(yīng)性。對(duì)肽特異性IgG的肽反應(yīng)性歸納如表3所示。
表3.對(duì)HCV限制性肽及肽特異性IgGa)的反應(yīng)性


a)12名HCV-1b+患者血清中肽特異性IgG水平利用ELISA進(jìn)行測(cè)定。決定切斷值為0.18。
b)對(duì)HLA-A24分子的肽結(jié)合評(píng)分使用Bioinformatics andMolecular Analysis Section，NIH，Bethesda，MD(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)進(jìn)行檢索。
就具有90％或90％以上純度的上述6種肽、及陰性對(duì)照肽對(duì)由60名HCV1b+患者(CH，n＝24；LC，n＝18；及HCC，n＝18)及20名HD的血清得到的各血清樣品的反應(yīng)性進(jìn)行試驗(yàn)(圖10)。
對(duì)上述各樣品的100∶1稀釋值進(jìn)行制圖。IgG(OD值)的平均值±SD如下所述NS5A-2132(0.48±0.36)、E2-488(0.18±0.19)、E1-213(0.10±0.21)、NS3-1081(0.036±0.14)、C-176(0.09±0.14)及C-173(0.04±0.13)。*表示Mann-Whitney U檢定得到的P＜0.05。對(duì)NS5A-2132、E2-488、E1-213、或C-173具有反應(yīng)性的IgG的平均水平比HD高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在NS3-1081或C-176的情況下并非如此。對(duì)NS5A-2132、E2-488、E1-213、C-173、NS3-10810、及C-176肽顯示有意義水平的反應(yīng)性的IgG(1∶100的血清稀釋下＞0.101 OD)在接受試驗(yàn)的60名患者血漿中可分別得到57(95％)、44(73％)、28(47％)、23(38％)、21(35％)、及17(28％)的檢測(cè)結(jié)果。相對(duì)于此，所有20名HD的血清均未檢測(cè)出有意義水平的IgG(圖10)。
其次，對(duì)上述各肽具有反應(yīng)性的IgG的肽特異性利用吸收及溶出試驗(yàn)加以確認(rèn)。使各血清樣品在37℃下被對(duì)應(yīng)的肽或無關(guān)系的肽(HIV；作為陰性對(duì)照組使用)中的任一種吸收3次，利用ELISA測(cè)定出肽特異性IgG(圖11)。溶出試驗(yàn)中，用對(duì)應(yīng)的肽或無關(guān)系的肽溶出第一次吸收后結(jié)合在肽固定化平板上的IgG分子后，利用ELISA測(cè)定出溶出部分中的肽特異性IgG的水平。對(duì)于代表性結(jié)果，3次測(cè)定的OD值平均值±SD如圖所示(圖12)。*表示兩邊標(biāo)準(zhǔn)t檢定得到的P＜0.05。
如預(yù)測(cè)所示，對(duì)6種肽的各IgG雖被所有對(duì)應(yīng)的肽吸收，但未被無關(guān)系的肽(HIV肽)吸收。而且，該IgG由對(duì)應(yīng)的肽從結(jié)合部分溶出，但未被無關(guān)系的肽溶出。綜合這些結(jié)果可知，與各肽具有反應(yīng)性的IgG對(duì)來自HCV1b的肽具有特異性。
肽特異性細(xì)胞性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)將由感染HCV1b的HLA-A24陽性患者(n＝12，6名CH，3名LC，3名HCC)及未感染HCV的HLA-A24陽性的HD(n＝5)得到的PBMC，與6種肽(純度＞90％)或?qū)φ誋IV肽一同培養(yǎng)13天，研究應(yīng)答以對(duì)應(yīng)的肽實(shí)施了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞的IFN的產(chǎn)生。將由HLA-A24陽性HCV1b+的患者(n＝12)及HD(n＝5)得到的PBMC用6種肽在4個(gè)孔(15×104/孔)中進(jìn)行刺激。在培養(yǎng)的第14天，回收各孔所得的肽刺激PBMC(80-120×104/孔)后，分成等量的4份。分別對(duì)其中的2個(gè)就與以對(duì)應(yīng)肽實(shí)施了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答、產(chǎn)生IFN-γ的能力進(jìn)行試驗(yàn)。剩下的2個(gè)則以使用陰性對(duì)照肽(HIV)的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。減去作為背景的對(duì)HIV肽(＜50pg/ml)發(fā)生應(yīng)答所產(chǎn)生的IFN-γ。*表示利用兩邊標(biāo)準(zhǔn)t檢定得到的P＜0.05。
C-173、C-176、E1-213、E2-488、NS3-1081、及NS5A-2132的HCV肽在12名患者中分別有1、3、4、6、2及7名(圖13、14)、及在5名HD中分別有0、0、1、1、1及1名誘導(dǎo)出有意義水平(p＜0.05)的IFN-γ產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未示出)。上述6種肽之中，NS5A-2132肽在12名患者中有7名的PBMC及接受試驗(yàn)的60名HCV1b+患者中有57名的血清中，由細(xì)胞性免疫及體液性免疫被識(shí)別。
上述肽刺激PBMC的細(xì)胞傷害性利用6小時(shí)的51Cr游離測(cè)試加以確定(圖15)。將利用IFN-γ產(chǎn)生測(cè)試(上述)顯示陽性應(yīng)答的肽刺激PBMC，在體外僅在IL-2中進(jìn)行培養(yǎng)，使其增殖。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)的6小時(shí)51Cr游離測(cè)試，對(duì)利用對(duì)應(yīng)的肽或HIV肽(陰性對(duì)照)實(shí)施了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞的細(xì)胞傷害性，以3種不同的E/T細(xì)胞比進(jìn)行試驗(yàn)。代表結(jié)果如圖所示。其值以特異性溶解％的平均值±SD表示。*表示利用兩邊標(biāo)準(zhǔn)t檢定得到的P＜0.05。以NS5A-2132、E2-488、或E1-213肽刺激的PBMC對(duì)預(yù)先負(fù)荷對(duì)應(yīng)的肽的C1R-A2402細(xì)胞顯示有意義水平的細(xì)胞傷害性，但在HIV肽中并未顯示(圖15)。
將圖15所示實(shí)驗(yàn)中使用的肽刺激PBMC，在20μg/ml的抗HLA-class I(W6/32，IgG2a)、抗HLA-class II(H-DR-1，IgG2a)、抗CD8(Nu-Ts/c，IgG2a)、及抗CD4(Nu-Th/i，IgG1)單克隆抗體(mAb)的存在下，對(duì)以對(duì)應(yīng)的肽實(shí)施了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞的細(xì)胞傷害性進(jìn)行試驗(yàn)?？笴D14(JML-H14，IgG2a)mAb作為陰性對(duì)照組使用。以3種不同的E/T比進(jìn)行6小時(shí)51Cr游離測(cè)試。其值以特異性傷害％的平均值±SD表示(圖16)。*表示利用兩邊標(biāo)準(zhǔn)t檢定得到的P＜0.05。
以3種肽分別實(shí)施了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞的細(xì)胞傷害性雖被抗HLA-class I(W6/32)或CD8單克隆抗體(mAb)阻礙，但未被試驗(yàn)的其它mAb中的任一種阻礙。這表示肽特異性細(xì)胞傷害性主要以由CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的HLA-class I限制性為媒介(圖16)。相對(duì)于此，以殘余的3種肽(C-173、C-176、或NS3-1081)刺激的PBMC中無法測(cè)出上述細(xì)胞傷害性(數(shù)據(jù)未示出)。
然后，將以NS5A及HLA-A2401基因?qū)嵤┝藭簳r(shí)性共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞使用，由此對(duì)NS5A-2132肽刺激PBMC是否識(shí)別出自然過程中產(chǎn)生的肽進(jìn)行調(diào)查。作為陰性對(duì)照，使用以NS5A及HLA-A2601基因?qū)嵤┝藭簳r(shí)性共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞。對(duì)由患者#1及#2得到的NS5A-2132肽刺激PBMC可識(shí)別出以NS5A及HLA-A2401基因?qū)嵤┝藭簳r(shí)性共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞、產(chǎn)生IFN-γ的活性進(jìn)行試驗(yàn)。作為陰性對(duì)照，使用以NS5A及HLA-A2601基因進(jìn)行了暫時(shí)性共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞。其值以E/T比20∶1的3次測(cè)試的IFN-γ產(chǎn)生％的平均值±SD表示(圖17)。*表示利用兩邊標(biāo)準(zhǔn)t檢定得到的P＜0.05。
如預(yù)測(cè)所述，由顯示CTL活性(圖13)的患者#1及#2得到的肽刺激PBMC可識(shí)別經(jīng)NS5A及HLA-A2401基因共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，產(chǎn)生有意義量的IFN-γ(圖17)。相對(duì)于此，上述PBMC并不與作為陰性對(duì)照使用的具有NS5A及HLA-A2601基因的COS-7細(xì)胞反應(yīng)。另外，由不顯示CTL活性的其它2名患者(#3及#4)得到的肽刺激PBMC也未因經(jīng)NS5A及HLA-A2401基因共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的識(shí)別而產(chǎn)生有意義量的IFN-γ(無數(shù)據(jù))。
接下來，對(duì)以NS5A基因穩(wěn)定地進(jìn)行轉(zhuǎn)染、用作目標(biāo)細(xì)胞的C1R-A2402細(xì)胞的細(xì)胞傷害性進(jìn)行試驗(yàn)。以NS5A基因穩(wěn)定地進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細(xì)胞的HLA-A24分子的表達(dá)、及以HLA-A31基因(陰性對(duì)照)穩(wěn)定地進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細(xì)胞的HLA-A31分子的表達(dá)，使用FACScan進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)算分析加以確認(rèn)(圖18)。
然后，以由NS5A基因穩(wěn)定地進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞傷害性由6小時(shí)51Cr游離測(cè)試進(jìn)行試驗(yàn)。將以陰性對(duì)照基因(HLA-A3101)穩(wěn)定地進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細(xì)胞作為陰性對(duì)照使用，將以NS5A-2132肽實(shí)施了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞作為陽性對(duì)照使用。以3個(gè)不同的E/T比進(jìn)行6小時(shí)51Cr游離測(cè)試。其值以特異性溶解的％平均值±SD表示。*表示利用兩邊標(biāo)準(zhǔn)t檢定得到的P＜0.05。以NS5A-2132肽實(shí)施了刺激的PBMC，與對(duì)以陰性對(duì)照基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細(xì)胞的細(xì)胞傷害性比較，顯示比用NS5A基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的C1R-A2402細(xì)胞、及用對(duì)應(yīng)的肽預(yù)先進(jìn)行了脈沖的未轉(zhuǎn)染C1R-A2402細(xì)胞雙方更高水平的細(xì)胞傷害性(圖19)。這些結(jié)果暗示NS5A-2132肽刺激PBMC可良好地識(shí)別HCV1b+細(xì)胞的HLA-A2402分子上自然過程產(chǎn)生的肽。
對(duì)抗NS5A-2132IgG做進(jìn)一步研究為了更好地了解抗肽IgG的生物學(xué)作用的可能性，利用吸收及溶出測(cè)定，對(duì)抗NS5A-2132IgG是否可識(shí)別全NS5蛋白質(zhì)進(jìn)行調(diào)查。NS5A-2132及HIV肽分別作為陽性對(duì)照及陰性對(duì)照使用(吸收試驗(yàn)及溶出試驗(yàn)的詳細(xì)內(nèi)容如上所述)。結(jié)果抗肽IgG在全NS5蛋白質(zhì)中未被吸收，也未被溶出(圖20)。這表示該肽IgG未與全NS5蛋白質(zhì)反應(yīng)。
接下來，將Huh7細(xì)胞在患者血清(由2名血清具有高水平抗NS5A-2132活性的HCV1b+患者得到的血清)的存在下培養(yǎng)3天。作為陰性對(duì)照組，使用由2名HD得到的血清及FCS?？缮娴腍uh7(NNU50-1)細(xì)胞數(shù)目以細(xì)胞計(jì)算試劑盒8(10μl/孔)計(jì)算，算出3次測(cè)定所得的平均值。任一試驗(yàn)血清在上述培養(yǎng)條件下均不阻礙Huh7(NNU50-1)細(xì)胞的增殖(圖21)。另外，對(duì)抗NS5A-2132IgG是否具有媒介ADCC活性的能力進(jìn)行調(diào)查。將由HLA-A24陽性的HD新分離出的PBMC，在上述4種不活化血清的存在下，對(duì)用該肽預(yù)先進(jìn)行了脈沖的C1R-A2402細(xì)胞的細(xì)胞傷害性進(jìn)行試驗(yàn)。然而，這些條件下任一試驗(yàn)血清均未顯示ADCC活性(圖22)。
實(shí)施例3.HCV感染者的預(yù)后預(yù)測(cè)受試者血清為由1995年至2002年的世代研究(Cohort Study)中具有HCV相關(guān)疾病的33名患者所得。33名患者的詳細(xì)調(diào)查結(jié)果如表4所示。具有慢性肝炎(CH，n＝68)、肝硬化(LC，n＝43)、及肝細(xì)胞癌(HCC，n＝52)的病患血清也用于分析。這些患者在最初血清采樣時(shí)，利用生化學(xué)及組織學(xué)所見、超音波檢查、及計(jì)算機(jī)連續(xù)斷層攝影進(jìn)行診斷?？笻CV抗體由化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)試(CLEIA)試劑盒(LumipulseII HCV，F(xiàn)ujirebio Inc.，Tokyo，Japan)、或第2代或第3代酶免疫測(cè)試試驗(yàn)(SRL，Tokyo，Japan)進(jìn)行測(cè)定。血清中的HCV-RNA可使用RT-PCR(SRL，Tokyo，Japan)進(jìn)行檢測(cè)。HCV基因型是由患者血清中的HCV以RT-PCR(SRL，Tokyo，Japan)直接定序來決定的。也由未感染HCV的受試者中得到血清。包括具有自身免疫疾病的24名受試者(6名全身性紅斑性狼瘡患者、1名白塞病患者及17名異位性皮膚炎患者)、17例B型肝炎病毒(HBV)感染(HBV表面抗原為陽性)、3名感染人類免疫不全病毒(HIV)的患者、及10例人類T細(xì)胞白血病病毒型I(HTLV-1)感染。作為陰性對(duì)照，對(duì)由不具HBV肝炎病毒或無疫苗接種經(jīng)歷、具有正常肝臟功能的37名受試者得到的血清進(jìn)行試驗(yàn)。
表41995年及2002年的診斷結(jié)果

CH，慢性肝炎；LC，肝硬化；HCC，肝癌；ASC，無癥候性健康載體肽純度為90％或90％以上的以下2個(gè)肽由BIOSYNTHESIS(Lewisville，TX)購得；HCV1b中心蛋白質(zhì)35-44(YLLPRRGPRL(序列號(hào)1)；可誘導(dǎo)HLA-A2限制性CTL活性)，及HCV1bNS5A蛋白質(zhì)2132-2140(RYAPACKPL(序列號(hào)2)；可誘導(dǎo)HLA-A24限制性CTL活性)。作為陰性對(duì)照，使用具有HLA-2A結(jié)合基序(SLYNTVATL(序列號(hào)64))及HLA-A24結(jié)合基序(RYLRDQQLLGI(序列號(hào)63))的來源于HIV的肽。
對(duì)肽具有反應(yīng)性的抗體測(cè)定肽特異性IgG的水平可由酶抗體法(ELISA)測(cè)定。簡(jiǎn)言之，將各肽溶解于二甲亞砜(DMSO)，-20℃下保存。將用含有作為化學(xué)交聯(lián)劑的二琥珀酰亞胺二辛酸酯(DSS)(PIERCE，Rockford，1L)的0.1M碳酸緩沖液稀釋的肽(20μg/孔)結(jié)合于ELISA平板上。以0.05％Tween20-PBS(PBST)將孔清洗3次。平板以Block Ace(Yukijirushi，Tokyo，Japan)在4℃下封阻一晚。將血清樣品以0.05％Tween20-BlockAce稀釋100倍、200倍、400倍，將100μl/孔的樣品加入各孔中。37℃下培養(yǎng)2小時(shí)后，將平板用PBST清洗9次，與100μl/孔的1000倍稀釋兔子抗人類IgG(γ鏈特異性)(DAKO，Glostrup，Denmark)一同在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。清洗9次后，將100μl/孔的1∶100稀釋抗兔子IgG結(jié)合西洋芥末過氧化酶·葡聚糖聚合物(En Vision，DAKO)添加于各孔中，將平板在室溫下培養(yǎng)40分鐘。清洗后，添加100μl/孔的四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)溶液(KPL，Guildford，UK)，加入1.0M磷酸使反應(yīng)停止。
統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用χ2檢定進(jìn)行，p＜0.05的值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
交叉反應(yīng)性、HLA限制性、及基因型限制性研究對(duì)來源于HCV1b的肽具有反應(yīng)性的2種抗體的交叉反應(yīng)。研究60名HCV患者、及未含在世代研究中的患者(CH，n＝22，LC，n＝21，及HCC，n＝17)的血清對(duì)中心的35-44(C-35)及NS5A的2132-2140(NS5A-2132)的肽的反應(yīng)性。也取得具有自身免疫疾病的24名受試者、HBV感染的17例及HTLV-1感染的10例受試者的血清。將由37名HD取得的血清作為陰性對(duì)照使用。連續(xù)稀釋的血清樣品的肽反應(yīng)性IgG水平利用ELISA進(jìn)行測(cè)定。給出各樣品的吸光度(OD)值。給出稀釋為100∶1的血清的OD代表性結(jié)果。切斷值設(shè)定為0.093(由HD的OD平均+2SD)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用χ2檢定進(jìn)行，p＜0.05的值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果檢測(cè)出HCV陽性患者的56/60(93.3％)為有意義水平的抗C-35IgG，在3組(CH，LC，及HCC患者)之間的IgG水平不存在有意義差(圖23)。除去HTLV-1患者，由其它組得到的血清對(duì)抗C-35抗體不顯示陽性。對(duì)HTLV-1+受試者的8/10例的血清檢測(cè)出較低、但是有意義水平的抗C-35IgG。檢測(cè)出患者的45/60(75％)為有意義水平的抗NS5A-2132IgG。IgG水平在3組間，CH患者較高，LC為中等程度，HCC患者較低(p＜0.05vsCH)(圖23)。對(duì)于由其它組得到的血清，進(jìn)行試驗(yàn)的大部分病例的抗NS5A-2132IgG也顯示陽性。而且3/37的HD的血清的抗NS5A-2132IgG也顯示陽性。
接下來，對(duì)具有HCV相關(guān)疾病的29名病患研究HLA-class IA表達(dá)型、與抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平間的相關(guān)性。HLA-class IA表達(dá)型可由標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)方法決定。9名患者為HLA-2A陽性、13名患者為A24陽性、及剩下7名患者為A2陰性，A24陰性。抗C-35及抗NA5A 2132利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定，各患者100∶1的血清稀釋時(shí)的OD值如圖所示。任一抗體不管其HLA-class IA表達(dá)型的差異，均在大部分HCV感染者中被檢出(圖24)。
然后，對(duì)于HCV-1b(n＝29)、HCV-2a(n＝16)及HCV-2b感染(n＝3)的患者，使用雙盲檢定研究HCV基因型與抗C-35IgG或抗NS5A-2132IgG的水平間的相關(guān)性。HCV基因型可通過將患者血清中的HCV直接定序來決定。所有受試者的稀釋100∶1時(shí)的結(jié)果如圖25所示?？笴-35及抗NA5A 2132利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定，各患者的100∶1的血清稀釋時(shí)的OD值如圖所示。切斷值設(shè)定為0.093(由HD的OD平均+2SD)。
抗C-35抗體分別在26/30的HCV-1b、15/15的HCV-2a、及3/3的HCV-2b感染者中被檢出。同樣地抗NS5A-2132抗體分別在23/30的HCV-1b、10/16的HCV-2a、及3/3的HCV-2b感染者的血清中被檢測(cè)出(圖25)。這些結(jié)果表示，在HCV陽性患者中，不管HLA-class IA亞型的差異、及HCV基因型的差異，均可檢出抗C-35抗體及抗NS5A-2132抗體雙方。
以上的結(jié)果表示抗NS5A-2132抗體的水平與HCV感染個(gè)體的預(yù)后相關(guān)，但與抗C-35抗體并無關(guān)系。
然后，重新準(zhǔn)備CH(n＝24)、LC(n＝22)、HCC(n＝26)、HD(n＝9)的血清，測(cè)定抗NS5A-2132IgG的水平(圖26)。CH、LC、HCC及HD組的平均值±SD分別為0.51±0.24、0.27±0.20、0.26±0.23、0.08±0.07。LC及HCC患者的抗NS5A-2132抗體的水平明顯低于CH患者(p＜0.05，高于HD。為了將上述結(jié)果與利用標(biāo)準(zhǔn)第3代測(cè)試進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)于所有血清使用市售的試劑盒(第3代測(cè)試，SRL)測(cè)定抗HCV抗體的水平。其水平以指數(shù)表示(左邊柱狀圖)。以指數(shù)表示的抗HCV水平與抗NS5A-2132水平之間的關(guān)系如右邊柱狀圖表示。利用第3代測(cè)試測(cè)定的抗HCV抗體水平在3組間并無有意義的差異(CH，10±2.7；LC，11±1.4；HCC，11±1.1)(圖27)。而且，對(duì)于這些血清使用市售的試劑盒(SRL，Japan)測(cè)定HCV RNA水平。HCC患者的HCV RNA水平(360±269.6)比CH患者(610±347.3)或LC患者(610±246.4)低(p＜0.05)(圖28)。然而，抗NS5A抗體的水平與HCV RNA水平之間并無明確相關(guān)性(圖28)。
世代研究的結(jié)果為了在各個(gè)水平下進(jìn)一步調(diào)查抗NS5A-2132抗體與HCV陽性患者的預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)1990年至2002年進(jìn)行的每年篩選HCV感染居民的世代研究所得的樣品進(jìn)行2種抗體的血清水平研究。為了進(jìn)行該研究，于1995年及2002年由相同個(gè)體取樣2次，33名患者共計(jì)66份血清。1995年時(shí)上述33名患者的診斷為，CH(n＝17)、LC(n＝1)、無癥候性載體(ASC)(n＝4)、及HCV感染的過去病例(自然康復(fù)個(gè)體)(n＝11)，2002年時(shí)為CH(n＝13)、LC(n＝4)、HCC(n＝2)、無癥候性載體(ASC)(n＝1)、及HCV感染的過去病例(n＝13)。即，7年間26名患者中并未觀察到疾病的進(jìn)展，而剩下7名患者中則觀察到疾病的進(jìn)展(表4)。以1995年及2002年的100∶1血清稀釋時(shí)測(cè)定的各病患中抗C-35抗體及抗NS5A-2132IgG的OD值如圖29所示。如預(yù)測(cè)所述，33病例中的大部分，不論疾病狀態(tài)如何，1995年測(cè)定的抗C-35抗體水平與2002年測(cè)定的水平幾乎相等。相對(duì)于此，對(duì)于疾病進(jìn)展的7名患者而言，1995年測(cè)定的抗NS5A抗體水平在2002年測(cè)定時(shí)減少。另一方面，對(duì)于疾病未進(jìn)展的25例中的大部分而言，該值與2002年的測(cè)定值幾乎相等。疾病進(jìn)展的7名患者的血清中1995年的抗NS5A-2132抗體的中央值±SD(0.67±0.13)與2002年的測(cè)定值(0.27±0.11)相比有意義地高(p＜0.05)。
然后，將33名受試者分為5組(CH、LC、HCC、HCV感染的過去病例〔康復(fù)的個(gè)體〕，及ASC)，將2002年的100∶1血清稀釋時(shí)的2種抗體的水平進(jìn)行制圖(圖30)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用χ2檢定進(jìn)行。p＜0.05中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？笴-35抗體的水平在CH、LC及HCC組皆高，已痊愈的個(gè)體組變得非常低或無法檢測(cè)出。另一方面，抗NS5A-2132抗體的水平在CH、康復(fù)個(gè)體及ASC組較高，LC組為中等程度，HCC患者最低(p＜0.05vsCH)。
實(shí)施例4由luminex法檢測(cè)與HLA-A24+HCV感染患者血清的HCV肽具有反應(yīng)性的IgG使用認(rèn)為靈敏度高于ELISA法的Luminex法，與實(shí)施例1相同，進(jìn)行與HLA-A24+HCV感染患者血清的HCV肽具有反應(yīng)性的IgG的檢測(cè)。
對(duì)肽對(duì)微小珠子的結(jié)合將肽分別如下所述地結(jié)合在依據(jù)制造者的指示將各螢光色素含有量識(shí)別編碼化(以下稱為顏色編碼)的微小珠子(Luminex公司制，xMAP Multi-Analyte COOH Beads)上。在過濾平板的各孔中放入100μl經(jīng)顏色編碼化的未調(diào)制的微小珠子，經(jīng)吸引后以清洗用緩沖液(磷酸緩沖液生理食鹽水(PBS)(pH7.4±0.1)、Tween(注冊(cè)商標(biāo))20(0.05％v/v))清洗2次后同時(shí)吸引各孔。接下來放入50μl 0.1M MES(2-嗎啉代乙磺酸)緩沖液(pH7.0)，各孔添加各10μl的EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽)(1mg/ml/0.1M MES緩沖液(pH7.0))。在各孔內(nèi)混合數(shù)百μl的肽(1mg/ml，0.1M MES緩沖液，pH7.0)與該經(jīng)過清洗的微小珠子。然后，將與肽混合的微小珠子在暗處、室溫下反應(yīng)20分鐘后，再在各孔中添加10μl EDC(1mg/ml/0.1M MES緩沖液(pH7.0))，在暗處、室溫下使其反應(yīng)20分鐘，將該操作重復(fù)2次。吸引剩余液體后，在各孔中添加100μl 1Mtris-鹽酸緩沖液(pH7.0)，在暗處、室溫下使其反應(yīng)15分鐘。接下來，將各孔的珠子用上述清洗用緩沖液進(jìn)行3次清洗，在Block-Ace(注冊(cè)商標(biāo))中放入0.05％疊氮化鈉后調(diào)整以保存用溶液進(jìn)行回收。
微小珠子混合物的調(diào)制調(diào)制各孔的微小珠子時(shí)，將在如上所述地經(jīng)過顏色編碼化的微小珠子上結(jié)合肽得到的珠子溶液放入過濾平板，使每孔中約有5000個(gè)微小珠子(各孔中1種珠子約1μl)。另外，混合10種等量的如上所述地調(diào)制的微小珠子，用上述清洗用緩沖液(PBS，TWEEN(注冊(cè)商標(biāo))20(0.05％v/v))稀釋至總量約25μl，調(diào)制珠子混合物。
樣品的調(diào)制使用血清。將血清使用反應(yīng)用緩沖液(PBS(pH7.4±0.1)、Tween(注冊(cè)商標(biāo))20(0.05％v/v)、牛胎血清白蛋白(BSA)10mg/ml)稀釋至100～1000倍，分別調(diào)制100μl的血清稀釋液。
抗肽抗體測(cè)定作為生物素化二次抗體，將生物素化羊抗人類IgG(γ鏈特異性)用上述反應(yīng)用緩沖液稀釋后進(jìn)行使用。作為螢光色素標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白，將經(jīng)PE(藻紅素)標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(SRPE)1mg/ml用上述反應(yīng)用緩沖液稀釋(1/50稀釋)至20μl進(jìn)行使用。
過濾平板的各孔中放入100μl上述清洗用緩沖液，繼續(xù)吸引除去。該清洗操作進(jìn)行2次。然后，在各孔中放入25μl上述珠子混合物，將該96孔的過濾平板用該清洗用緩沖液清洗2次。清洗后，在所有孔中分別放入100μl上述樣品。接下來，封住過濾平板，在暗處、室溫下使用平板震蕩器(300rpm)震蕩2小時(shí)后，進(jìn)行吸引。繼續(xù)在各孔中分別放入100μl上述清洗用緩沖液，吸引除去。該清洗操作進(jìn)行3次。
然后，在各孔中分別放入100μl作為生物素化二次抗體的生物素化羊抗人類IgG(γ鏈特異性)，封住過濾平板，在暗處、室溫下使用平板震蕩器(300rpm)震蕩1小時(shí)。然后，進(jìn)行吸引，在各孔中分別放入100μl上述清洗用緩沖液，吸引除去。該清洗操作進(jìn)行3次。
接下來，在各孔中分別加入100μl SRPE，封住過濾平板，在暗處、室溫下使用平板震蕩器(300rpm)震蕩30分鐘。然后進(jìn)行吸引，在各孔中分別放入100μl上述清洗用緩沖液，吸引除去。該清洗操作進(jìn)行3次。然后，在各孔中分別放入100μl該清洗用緩沖液，使用平板震蕩器(300rpm)震蕩2～3分鐘后，將得到的50μl樣品用螢光閃爍計(jì)數(shù)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖31及32、及表5所示。
表5

實(shí)施例5使用來源于C型肝炎病毒的肽疫苗的HCV感染治療對(duì)HLA-A2陽性或HLA-A24陽性的HCV感染者，研究使用本發(fā)明的來源于C型肝炎病毒的肽的疫苗的抗病毒效果。受試者均為感染HCV1b、且對(duì)利用干擾素與利巴韋林的治療無反應(yīng)的患者。來源于C型肝炎病毒的肽C-35、NS5A-2132、E2-488、E1-213及NS3-1081在適合GMP的條件下合成、純化、制成凍干粉末進(jìn)行保存。C-35、NS5A-2132、E2-488及NS3-1081的肽溶解在少量的DMSO(1mg/10～25μl)中，E1-213溶解在7％碳酸氫鈉注射液(碳酸氫鈉)(1mg/15μl)中。分別以注射用生理食鹽水進(jìn)行稀釋(1～2mg/ml)，通過0.22μm濾器滅菌。該溶液與等量助劑(Montanide ISA-51)混合，得到乳化劑注射劑。其中對(duì)HLA-A2陽性的3名受試者給予C-35注射劑，對(duì)HLA-A24陽性的5名受試者給予NS5A-2132注射劑。給藥方式為2星期內(nèi)，每次將含有0.3mg肽的乳化劑注射于側(cè)腹部。持續(xù)監(jiān)測(cè)HCVRNA的量及GOT、GPT、γ-GTP、AFP的值。
結(jié)果如圖33及圖34所示。由上述圖可知，接受試驗(yàn)的受試者在疫苗給藥開始后幾乎全部出現(xiàn)HCV RNA的量顯著降低，證明本發(fā)明的肽作為抗HCV疫苗是有效的。
產(chǎn)業(yè)上的利用性本發(fā)明的來源于C型肝炎病毒的肽將HLA結(jié)合基序包含在其序列中，被與C型肝炎病毒具有反應(yīng)的抗體識(shí)別，同時(shí)，還具有由HLA-A2或HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的識(shí)別性。
因此，本發(fā)明的來源于C型肝炎病毒的肽可用作對(duì)HCV感染所引起的疾病有效的疫苗。
序列表<110>久留米大學(xué)<120>來源于C型肝炎病毒的肽<130>PIK9002WO<150>JP 2003-330258<151>2003-09-22<160>64<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>1Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu1 5 10<210>2<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>2Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>3His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>4Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met1 5<210>5<211>10<212>PRT
<213>C型肝炎病毒<400>5Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>6Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu1 5 10<210>7<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>7Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10<210>8<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>8Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>9Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>10Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu1 5<210>11
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1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>17Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>18Pro Tyr Phe Val Arg Ala His Gly Leu1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>19Gln Phe Lys Gln Lys Ala Ile Gly Leu1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>20Ile Phe Thr Ile Thr Lys Ile Leu Leu1 5<210>21<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>21Gly Tyr Ile Pro Ile Val Gly Ala Pro Leu1 5 10<210>22<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒
<400>22Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu1 5 10<210>23<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>23His Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Lys Leu1 5 10<210>24<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>24Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu1 5 10<210>25<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>25Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu1 5 10<210>26<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>26Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Lyr Lys Val Leu1 5 10<210>27<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>27Ala Tyr Ala Leu Tyr Gly Val Trp Pro Leu1 5 10<210>28<211>10
<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>28His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile1 5 10<210>29<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>29Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile1 5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>30Thr Phe Leu Val Gly Leu Asn Gln Tyr Leu1 5 10<210>31<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>31Val Phe Val Gly Leu Ile Leu Leu Thr Leu1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>32Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu1 5 10<210>33<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>33Leu Phe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu1 5 10
<210>34<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>34Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His Leu1 5 10<210>35<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>35Ala Phe Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro Leu1 5 10<210>36<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>36Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu1 5 10<210>37<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>37Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu1 5 10<210>38<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>38Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu1 5 10<210>39<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>39
Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val1 5<210>40<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>40Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val1 5 10<210>41<211>8<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>41Ile Leu His Thr Pro Gly Cys Val1 5<210>42<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>42Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val1 5<210>43<211>11<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>43Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val1 5 10<210>44<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>44Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val1 5<210>45<211>9<212>PRT
<213>C型肝炎病毒<400>45Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val1 5<210>46<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>46Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>47Thr Gly Ala Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr1 5 10<210>48<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>48Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ala Val1 5<210>49<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>49Leu Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val1 5 10<210>50<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>50Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val1 5<210>51
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1 5<210>57<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>57His Tyr Arg Asp Val Leu Lys Glu Met1 5<210>58<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>58Trp Phe Met Trp Cys Leu Leu Leu Leu1 5<210>59<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>59Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu1 5<210>60<211>9<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>60Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu1 5<210>61<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒<400>61Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe1 5 10<210>62<211>10<212>PRT<213>C型肝炎病毒
<400>62Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu1 5 10<210>63<211>11<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>63Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile1 5 10<210>64<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>64Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu1 權(quán)利要求
1.一種來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為，序列中含有HLA結(jié)合基序，且被從C型肝炎病毒患者中檢測(cè)出的抗體識(shí)別。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為，該肽具有序列號(hào)1～8、16、20及38中任一種表示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為，該肽具有與序列號(hào)1～8、16、20及38中的任一種氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為，該肽還具有利用HLA-A2或HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的識(shí)別性。
5.一種多肽，其特征為含有如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽。
6.一種多肽，其特征為，該多肽具有與權(quán)利要求5所述的多肽的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求5或6所述的多肽，其特征為，該多肽還具有利用HLA-A2或HLA-A24限制性細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的識(shí)別性。
8.一種核苷酸，其特征為，該核苷酸編碼如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、或如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、或具有與這些肽互補(bǔ)的序列。
9.一種抗體或類似抗體活性物質(zhì)，其特征為識(shí)別如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、或如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽。
10.一種載體，其特征為含有如權(quán)利要求8所述的核苷酸。
11.一種細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，其特征為使用如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒來的肽、或如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽誘導(dǎo)出細(xì)胞傷害性T細(xì)胞。
12.一種肝炎病毒的檢測(cè)方法，其特征為使用如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求8所述的核苷酸、或如權(quán)利要求9所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)。
13.一種C型肝炎病毒感染癥的診斷方法，其特征為使用如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求8所述的核苷酸、或如權(quán)利要求9所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)。
14.一種C型肝炎病毒感染癥的預(yù)防或治療方法，其特征為使用如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求8所述的核苷酸、或如權(quán)利要求9所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)。
15.一種藥物組合物，其特征為含有如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求8所述的核苷酸、或如權(quán)利要求9所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)作為有效成分。
16.如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征為，藥物組合物為C型肝炎病毒疫苗。
17.一種C型肝炎病毒感染癥的預(yù)后預(yù)測(cè)方法，其特征為使用如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求8所述的核苷酸、或如權(quán)利要求9所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)。
18.一種診斷C型肝炎病毒感染癥或預(yù)測(cè)預(yù)后的試劑盒，其特征為含有如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的來源于C型肝炎病毒的肽、如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的多肽、如權(quán)利要求8所述的核苷酸、或如權(quán)利要求9所述的抗體或類似抗體活性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于C型肝炎病毒的肽，其特征為序列中含有HLA結(jié)合基序(binding－motif)，且由從C型肝炎病毒(HCV)患者體內(nèi)檢測(cè)出的抗體來識(shí)別。本發(fā)明的肽可用于C型肝炎病毒的診斷及C型肝炎的治療、及預(yù)后的預(yù)測(cè)。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1856503SQ20048002744
公開日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者伊東恭悟, 山田亮, 佐田通夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社綠多肽