專利名稱：：利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種制備方蛋白質分子量標準的方法，可用于生物科學和生物方法等領域。
背景技術：
：1、內含肽介導的反式剪接原理蛋白質內含肽(intein)是寄生在其它蛋白質中的一段多肽鏈。其編碼DM序列與正常蛋白的外顯子一起轉錄和翻譯，產生一條多肽鏈。然后從中切除與內含肽對應的序列，再把被寄生蛋白質的序列連接起來，成為有功能的蛋白質。這是一種蛋白質的自我剪接機制。一般來說，蛋白質內含肽有10個模體(motif),順序依次為N口AN2B化CDEHFGC口，其中A、N2、B、N"F、G屬于自我剪接域的模體，而C、D、E、H屬于歸位核酸內切酶域的模體(PerlerFB,OlsenGJ，AdamE.Compilationandanalysisofinteinsequences.NucleicAcidsRes.1997,25(6):1087;PerlerFB.InBase:theInteinDatabase.NucleicAcidsRes.2002，30(1):383)。對于內含肽行使剪接功能來說，歸位核酸內切酶結構域并不是必須的。藍藻S7"ec力0c7W/ssp.PCC6803的DM聚合酶III的a亞基(DnaE),分成兩段，dnaE-n基因編碼前774個氨基酸，dnaE-c基因編碼后423個氨基酸，這兩段間隔745kb。它們分別表達后，通過內含肽的相互識別，反式剪接到一起形成完整功能蛋白(見圖U。(SvmW,YangJ,LiuXQ.Synthetictwo-pieceandthree-piecesplitinteinsforproteintrans-splicing.JBiolChem.2004，279(34):35281)。2、蛋白質分子量標準的重要性蛋白質研究是生命科學中重要的組成部分，其中蛋白質分子量標準作為蛋白質的定性甚至定量研究的重要工具，可用于蛋白質電泳、蛋白質定量以及蛋白質印跡等。目前，蛋白質分子標準的來源較窄，尤其是高分子量蛋白質標準。目前市面上的眾多蛋白質分子量標準多是釆用的已知天然蛋白，分子量數值關系不是等比例(見表1)，實驗觀察時不是很明了。如果待檢測蛋白分子量恰好在兩個跨度較大的蛋白之間，那么檢測不出來。有些大型生物公司通過直接表達特定的重組蛋白來獲得整數大小分子量標準，但這種方法導致生產成本極高，如Invitrogen公司的BenchMarkProteinLadder,每毫升價格為2600元。利用內含肽的反式剪接方法，可以將不同分子量的蛋白質連接在一起，制作間隔均勻的蛋白質分子量標準。
發(fā)明內容本發(fā)明目的是:利用內含肽的反式剪接方法，將不同分子量的蛋白質連接在一起，制作間隔均勻的蛋白質分子量標準。利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，選擇一段在一定分子量間蛋白X,另選擇兩種互不兼容的內含肽A和B,將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Be;然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Bc-X-An)、終點1(Ac-X)、終點2(Be-X);通過上面五個蛋白的相互組合疊加，獲得多種分子量分布范圍的蛋白質分子量標準；該核酸分子編碼的蛋白包含已知蛋白和斷裂內含肽A的氨基末端部分。這一段特定分子量蛋白X(如10kD),兩種互不兼容的內含肽A和B(如藍藻分"ec力oc/W/ssp.PCC6803的DnaE和DnaB)，將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Be-X-An)、終點l(Ac-X)、終點2(Bc-X)。經研究發(fā)現，幾乎所有的內含肽基因都可以在歸位核酸內切酶編碼區(qū)被分割成兩部分，這兩個部分分別表達，再通過內含肽相互識別，重新組裝激活剪接活性，使兩端的蛋白連接起來。一定分子量間的蛋白X,如10kD,也可以在幾十至上百kD。具體定義如下起點已知分子量的蛋白和斷裂內含肽A的氨基部分(N端)相連的蛋白；中段l:已知分子量的蛋白一端連接斷裂內含肽A的羧基部分(C端)，另一端連接斷裂內含肽B的氨基部分(N端);中段2:已知分子量的蛋白一端連接斷裂內含肽B的羧基部分(C端)，另一端連接斷裂內含肽A的氨基部分(N端)；終點l-.已知分子量蛋白和斷裂內含肽B的羧基部分(C端)相連的蛋白；終點2:已知分子量蛋白和斷裂內含肽A的羧基部分(C端)相連的蛋白。具體實施例方式如藍藻5y/ec/7oc"/ssp.PCC6803的DnaE和DnaB,將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段l(Ac-X-Bn)、中段2(Be-X-An)、終點1(Ac-X)、終點2(Be-X)。首先讓"起點"蛋白和"終點2"蛋白反應，可以得到分子量為已知蛋白兩倍的蛋白；要是讓"起點"蛋白、"中段2"蛋白反應，然后再加入"終點l"蛋白反應，這樣就可以得到分子量為已知蛋白3倍的蛋白；要是讓"起點"蛋白、"中段l，'蛋白反應，然后再加入"中段2"蛋白反應，最后加入"終點2"蛋白，可以得到分子量為已知蛋白4倍的蛋白；依次循環(huán)重復，便可以得到分子量為已知蛋白任意整數倍的蛋白。然后利用這些不同分子量的蛋白制作蛋白質分子量標準(見圖2)。發(fā)明具體表述；1核酸分子的構建1)"起點"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的3'口端側接編碼斷裂內含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；2)"中段l"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端側接編碼斷裂內含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列，3口端側接編碼斷裂內含肽B的氨基末端部分的核苷酸序列；3)"中段2"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端側接編碼斷裂內含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列，3口端側接編碼斷裂內含肽A的氯基末端部分的核苷酸序列；4)"終點1"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端側接編碼斷裂內含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列；5)"終點2"蛋白的核苦酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端側接編碼斷裂內含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列.2蛋白的表達抅建一宿主系統(tǒng)，讓上述5個核酸分子表達，得到我們所需要的蛋白3蛋白的連接根據不同的需求，讓上述產生的5種不同的蛋白在一定條件下反應，得到不同.分子量的蛋白。反應之后，進行純化。4蛋白分子量標準的制備利用步驟3產生的蛋白，制作蛋白質分子量標準。圖l.是內含肽介導的反式剪接示意圖。N表示DnaE的N端及其編碼基因的5'端，In表示內合肽的N端及其編碼部分的5'端，C表示DnaE的C端及其編碼基因的3'端，Ic表示內含肽的C端及其編碼部分的3'端圖2.是反應流程圖。A)圖示；B)起始反應與終止反應；C)延伸反應。具體實施例方式下面通過實施例，對本發(fā)明的方法方案作進一步具體的說明。實施實例l:生產起點、中段l、中段2、終點l、終點2。選擇大腸桿菌EscherichiacoliK12的gusA基因的1—85氨基酸，加上一個天冬氨酸(密碼子為GAU)，得到分子量為10000.23Da的蛋白序列，具體序列如下MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQR鼎ESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQKEVFIPKGWAGQRIVD。選擇藍藻Synechocystissp.PCC6803的DnaE內含肽和DnaB內含肽(http:〃www.neb-cora/neb/inteins.html)oDnaE內含肽氨基端序列如下CLSFGTEILTVEYGPLPIGKIVSEEINCSVYSVDPEGRVYTQAIAQ冊DRGEQEVLEYELEDGSVIRATSDHRFLTTDYQLLAIEEIFARQLDLLTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK。DnaE內含肽羧基端序列如下MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIMN。DnaB內含肽序列如下CISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCERAAKIATITQSPEIEKLSQSDIYTOSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHN。根據文獻報道(SunW,YangJ,UuXQ.Synthetictwo-pieceandthree-piecesplitinteinsforproteintrans-splicing.JBiolChem.2004,279(34):35281)，將DnaB內含肽兩端序列切下，氨基端序列如下CISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQ。羧基端序列如下LSPEIEKLSQSDIYW將上面這些序列組合，得到起點，MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIKNYAGNVWYQREVFIPKGMGQRIVDCLSFGTEILTVEYGPLPIGKIVSEEINCSVYSVDPEGRVYTQAIAQ冊DRGEQEVLEYELEDGSVIRATSDHRFLTTDYQLLAIEEIFARQLDLLTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK;中段1，MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIAANMLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVDCISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQ;中殺2，1SPEIEKJLSQSWW^IVSI-拓TGW現V冊LWPCPHNFV娜I寸WNiRPVfTPHEIKKLDGLWALTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK;終點1，MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIMNMLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVD;終點2，LSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHNMLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFN叫FADADIR附AGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVD。實施實例2:使用起點、中段l、中段2、終點1和終點2，生產蛋白質分子量標準。按"
發(fā)明內容"部分的"發(fā)明概述"一節(jié)的流程操作。表l.常用蛋白質分子量標準參照物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1.利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是選擇一段一定分子量的已知蛋白X，另選擇兩種互不兼容的內含肽A和B，將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc；然后將它們組成五個重組蛋白，即起點蛋白(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)蛋白、中段2蛋白(Bc-X-An)、終點1蛋白(Ac-X)、終點2蛋白(Bc-X)；通過上面五個蛋白的相互組合連接疊加，獲得多種分子量分布范圍的蛋白質分子量標準。2、根據權利要求1所述的利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是五種非天然形成的蛋白分子構成1)一種蛋白包含一定分子量的已知蛋白和斷裂內含肽A的氨基末端部分；2)—種蛋白包含斷裂內.含肽A的羧基末端部分，一定分子量的已知蛋白和斷裂內含肽B的氨基末端部分；3)—種蛋白包含斷裂內含肽B的羧基末端部分，一定分子量的已知蛋白和斷裂內含肽A的氨基末端部分；4)一種蛋白包含斷裂.內含肽A的羧基末端部分和一定分子量的已知蛋白；5)—種蛋白包含斷裂內含肽B的羧基末端部分和一定分子量的已知蛋白。3、根據權利要求l所述的利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是1)編碼"起點"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的3'端側接編碼斷裂內含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；2)編碼"中段l"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'端側接編碼斷裂內含肽A的羧基末端部分的核苦酸序列，3'端側接編碼斷裂內含肽B的氨基末端部分的核苷酸序列；3)編碼"中段2"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'端側接編碼斷裂內含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列，3'端側接編碼斷裂內含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；4)編碼"終點l"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'端側接編碼斷裂內含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列；5)編碼"終點2"蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'端側接編碼斷裂內含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列。4、根據權利要求1所述的利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是選擇大腸桿菌EscherichiacoliK12的gusA基因的1-85氨基酸，加上一個天冬氨酸(密碼子為GAU),得到分子量為10000.23Da的蛋白序列，作為蛋白X;另選擇藍藻J/加c力oc/W/、sp.PCC6803的DnaE和DnaB分別作為內含肽A和B。將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段l(Ac-X-Bn)、中段2(Be-X-An)、終點1(Ac-X)、終點2(Bc-X);首先讓"起點"蛋白和"終點2"蛋白反應，得到分子量為已知蛋白兩倍的蛋白；讓"起點"蛋白、"中段2"蛋白反應，然后再加入"終點r蛋白反應，得到分子量為已知蛋白3倍的蛋白；讓"起點"蛋白、"中段l"蛋白反應，然后再加入"中段2"蛋白反應，最后加入"終點2"蛋白，得到分子量為已知蛋白4倍的蛋白；依次循環(huán)重復，便可以得到分子量為已知蛋白任意整數倍的蛋白。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，選擇一段一定分子量的已知蛋白X，另選擇兩種互不兼容的內含肽A和B，將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc；然后將它們組成五個重組蛋白，即起點蛋白(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)蛋白、中段2蛋白(Bc-X-An)、終點1蛋白(Ac-X)、終點2蛋白(Bc-X)；通過上面五個蛋白的相互組合連接疊加，獲得多種分子量分布范圍的蛋白質分子量標準?？捎糜诘鞍踪|電泳、蛋白質定量以及蛋白質印跡等。文檔編號G01N1/28GK101281201SQ20081002484公開日2008年10月8日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權日2008年5月7日發(fā)明者靜劉,張云華,張鵬飛,宕李,凱王,強王,王海燕,陳建群申請人:南京大學