專利名稱：：一類新穎的以蛋白質為基礎的治療用分子的制作方法相關申請的交叉引用本申請要求美國專利申請序列號為10/939,262的專利的優(yōu)先權，該專利申請日期為2004年9月10日，名稱為“一類新穎的治療用蛋白質分子(NovelClassofTherapeuticProteinBasedMolecules)”，且已通過引用整體結合到本文中。以下專利申請也通過引用整體結合到了本申請中申請日期為2003年11月21日的第10/718,986號美國專利申請，名稱為“一種廣譜抗病毒治療方法和預防方法(Broadsoectrumanti-viraltherapeuticsandprophylaxis)”；申請日期為2002年11月22日的第60/428,535號美國臨時專利申請，名稱為“一種廣譜抗病毒治療方法和預防方法(Broadsoectrumanti-viraltherapeuticsandprophylaxis)”；申請日期為2003年4月19日的第60/464,217號美國臨時專利申請，名稱為“一類廣譜抗病毒蛋白(Classofbroadspectrumanti-viralprotein)”；申請日期為2004年4月13日的第60/561,749號美國臨時專利申請，名稱為“一種抗微生物治療方法和預防方法(Anti-microbialtherapeuticsandprophylaxis)”；申請日期為2004年6月16日的第60/580,084號美國臨時專利申請，名稱為“一類廣譜抗微生物劑(Classofbroadspectrumanti-microbialagents)”。
背景技術：
：本發(fā)明涉及可用于預防和治療病原體對人類和動物患者的治療用組合物，特別涉及可用于預防和治療病毒或病菌感染的基于蛋白的治療用組合物。本發(fā)明也涉及用于預防或者改善過敏及發(fā)炎反應的基于蛋白的治療用組合物。本發(fā)明也涉及用于提高重組病毒轉導效率的基于蛋白的組合物，如用于基因治療的重組病毒。流行性感冒自從遠古時期就在人類中傳播，是一個具高度傳染力的急性呼吸道疾病。其特性是分年度周期性發(fā)生，并定期發(fā)生世界性大流行。因流感具有高發(fā)病率和死亡率，它對社會經濟直接或者間接的影響很巨大。每年僅在美國的流行就導致幾乎有300,000人住院治療和25,000人死亡。在上一世紀發(fā)生的4次大流行總共導致了數億人死亡?；谠缙诹餍袣v史的數學模型估計，下次大流行時可能將有89,000-207,000人死亡，出現1,800-4,200萬個就診病人和另外2,000-4,700個病人(Meltzer，MI，Cox，NJ和Fukuda，K.(1999)EmergInfectDis5659-671)。流感主要是由兩種類型的病毒感染導致流感病毒A和流感病毒B(第三種類型流感病毒C僅能導致輕微的類似普通感冒的癥狀)。他們屬于RNA病毒的正粘病毒科。A和B兩種類型的病毒均具有8個分節(jié)負鏈RNA基因組，包被在源自宿主細胞的脂質膜中。此病毒包膜上覆蓋著由三種類型的蛋白質組成的刺突負責將病毒附著到宿主細胞受體和介導病毒和細胞膜融合的血凝素(HA)、負責從寄主細胞釋放新病毒的唾液酸苷酶(NA)和數量不多的作為離子通道的M2蛋白質。流感A和B類型病毒的感染一般開始于上呼吸道粘膜的表面。病毒的復制主要限于上呼吸道，但可擴展到下呼吸道并導致支氣管肺炎，這可能致死。流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的病毒包膜蛋白。它在病毒感染過程中起著重要的作用。HA的重要性已被它是宿主免疫反應產生的保護性的中和抗體的主要作用目標的事實證實(Hayden，FG.(1996)InAntiviraldrugresistance(ed.D.D.Richma)，59-77頁.Chichester，UKJohnWilev&SonsLtd.)?，F在較清楚的是HA對病毒感染具有兩個不同的功能。第一，HA負責將病毒附著到唾液酸細胞的受體上；第二，HA介導病毒進入靶細胞，引發(fā)病毒包膜和細胞膜的融合。HA作為前體蛋白HA0合成，HA0以三聚體分子形式從細胞器高爾基體轉移到細胞表面，然后被剪切成C端HA1(HA0的第328個殘基)和N端HA2。一般認為此剪切發(fā)生在細胞表面或在已釋放的病毒上。HAO被剪切成HA1/HA2對于HA結合到唾液酸受體上不是必需的。然而，一般認為這對于病毒的感染性來說是必要的(Klenk，HD和Rott，R.(1998)AdvVirRes.34247-281；Kido，H，Niwa，Y，Beppu，Y和Towatari，T.(1996)AdvanEnzymeRegul36325-347；Skehel，JJ和Wiley，DC.(2000)AnnuRevBiochem69531-569；Zambo，M.(2001)RevMedVirol11227-241.)。目前，流感通過流感疫苗和抗病毒化合物控制。滅活的流感疫苗目前用于全世界，特別是用在高危人群中。這些疫苗病毒在受精雞蛋中生長，通過化學手段滅活并純化。這些疫苗通常為三價的，包括典型的流感A病毒(H1N1和H3N2)和流感B病毒株。這些疫苗株需要經常更新以保持功效，世界健康組織(WHO)在協(xié)調這一工作。在流感流行期間，更新流感疫苗并供給市場通常需要8個月時間(Wood，J.(2000)PhilTransRSocLondB3561953-1960)。然而，歷史上流行流感曾在6個月內傳播到大多數大洲，并且預期未來流感會由于國際旅行增加而傳播更快(Gust，ID，Hampson，AW.，和Lavanchy，D.(2001)RevMedVirol1159-70)。所以，在未來的流感大流行的第一波中，不能得到一種有效的疫苗或者其很短缺的情況是不可避免的?？共《净衔镆殉蔀橹委焹纱瘟鞲斜┌l(fā)之間的病癥的首選藥物。目前，它們也是人們在疫苗不可用之前的控制流感的最初的時期內的僅有選擇。市場上目前有兩類抗病毒化合物M2抑制劑，如金剛烷胺和金剛烷乙胺；NA抑制劑，包括奧斯他韋(達菲)和扎那米韋(樂瑞沙)。兩種分子均被證實在預防和治療流感上有效。然而，將它們廣泛用于化學預防時仍需顧慮的兩個因素是其副作用和產生抗藥病毒的風險(Hayden，FG.(1996)InAntiviraldrugresistance(ed.D.D.Richman)，59-77頁.Chichester，UKJohnWiley&SonsLtd)。最重要的是，未來自然進化的或者在生物戰(zhàn)爭中通過基因工程人工創(chuàng)造的流感病毒株可能對所有可用的抗病毒化合物有抗性，并且這將導致全球性的破壞。總之，目前可用的疫苗和抗病毒化合物受限于一些其本質上的缺陷。將來的流感大流行需要使用新穎的治療和預防的藥物形式。呼吸道感染(RTI)是易傳染疾病的最常見且最有潛在危險的典型癥狀。臨床上RTI包括竇炎、耳炎、咽喉炎、支氣管炎和肺炎。根據病因學和流行病學研究，現已較明白，雖然許多微生物可能導致RTI，但在大多數情況下，僅有少數的病原體是RTI發(fā)生的病因。這些病原體包括肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他摩拉菌、流感病毒A及B和副流感病毒。除了導致CAP和AECB外，許多細菌病原體，如肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌，也通常引起急性竇炎和中耳炎并導致膿毒癥、腦膜炎等侵襲性感染。因此這些微生物在臨床上最具重要性。所有的呼吸道病原細菌的普遍特征之一是在上部氣管粘膜表面建立共生群，這些集群在感染前形成并且是感染發(fā)生的先決條件。細菌群在嬰兒出生后不久就出現了。人的一生中，在上部氣管，特別是鼻咽和口咽中，維持一個動態(tài)的微生物生態(tài)保留地，它獲得細菌，消滅細菌，繼而又重新獲得細菌。在大多數情況下，咽內細菌群落是無害的。然而，當寄主的情況發(fā)生變化時，一些微生物可能侵犯相鄰的組織或者血流而導致疾病。鼻咽除了作為細菌和病毒進入粘膜及侵襲性感染的港口外，也是個體間病原微生物傳播的主要源頭，并也是具抗生素抗性的細菌被選擇的地方(Garcia-Rodriguez和Martinez，JAntimicrobChemother，(2002)50(SupplS2)，59-73；Soriano和Rodriguez-Cerrato，JAntimicrobChemother，(2002)50SupplS2，51-58)。臨床上很確信，易感RTI的個體易成為病原細菌的持續(xù)的和循環(huán)的攜帶者(Garcia-Rodriguez和Martinez，JAntimicrobChemother，(2002)50(SupplS2)，59-73；Mbaki等，TohkuJExp.Med.，(1987)153(2)，111-121)。幽門螺桿菌是導致胃炎和胃潰瘍的人類病原體。此細菌寄生于人胃并附著在胃竇的上皮細胞。已被證實此細菌的粘附是以幽門螺桿菌連接素I和II為媒介而結合到上皮表面的唾液酸上。Siglecs(唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素)是結合于唾液酸上的免疫球蛋白(Ig)超家族，主要在造血系統(tǒng)細胞中表達。已發(fā)現至少有11種Siglecs，且它們似乎作為配基專門識別細胞表面的唾液酸。人們相信Siglecs結合到唾液酸介導細胞-細胞粘附和相互作用(Crocker和Varki，TrendsImmunol.，(2001)22(6)，337-342；Angata和Brinkman-VanderLinden，Biochim.Biophys.Acta，(2002)1572(2-3)，294-316)。Siglec-8(SAF-2)是一種粘附分子，嚴格限于嗜曙紅細胞、嗜堿細胞、肥大細胞表面，這些細胞是過敏癥狀，包括過敏性鼻炎、哮喘和濕疹的主要效應細胞。人們認為Siglec-8負責介導將三種類型過敏細胞補充到氣管、肺和其它過敏位點。Siglec-1(唾液酸糖蛋白)和Siglec-2(CD22)是巨噬細胞和B細胞上的粘附分子，兩種細胞類型在免疫反應中起中心作用，導致發(fā)炎。重組病毒，尤其是腺病毒伴隨病毒(AAV)，可用于轉移野生型囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子(CFTR)基因到上皮細胞，以糾正導致囊腫性纖維化的基因缺陷(Flotte和Carter，MethodsEnzymol.，(1998)292，717-732)。臨床上用AAV載體試驗，已顯示其能夠將CFTR基因有效地轉移到上皮細胞上并安全釋放，伴隨有低水平的基因轉移(Wagner等，Lancet，(1998)351(9117)，1702-1703)。與腺病毒載體相比，AAV使基因表達更穩(wěn)定并降低了細胞免疫性。然而，體內AAV在肺中的轉導效率相當低(Wagner等，Lancet，(1998)351(9117)，1702-1703)。需要一種可以提高體內AAV轉導效率的方法，以在囊腫纖維化的治療方面充分挖掘基因療法的治療潛力。已證實帶負電荷的碳水化合物，例如唾液酸，抑制AAV載體向高度分化的氣管上皮細胞的轉導效率，并且通過用糖苷酶，包括一種唾液酸苷酶和內糖苷酶H，處理氣管上皮細胞，增強了此AAV載體的轉導效率(Bals等，JVirol.，(1999)73(7)，6085-6088)。發(fā)明概述本發(fā)明認識到目前的預防和治療病原體感染的療法常常很難及時供利用，可能帶來不需要的副作用，并可能產生抗藥病原菌株。本發(fā)明也認識到目前治療過敏和發(fā)炎的方式效果有局限，并且具有副作用。此外，本發(fā)明也認識到目前重組病毒的方法所具有的轉導效率低和基因治療的效果不令人滿意。本發(fā)明提供預防和治療病原感染的新的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供可以在細胞外活動的化合物以預防病原對細胞的感染。本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案為治療用化合物，其具有將自身錨定到靶細胞的表面的錨定域，并且具有可在細胞外活動以防止病毒和細菌等病原感染靶細胞的治療域。一方面，本發(fā)明提供一種基于蛋白的組合物，用于預防或者治療病原感染。此組合物由一種化合物組成，此化合物含有至少一個治療域和至少一個可附著到或者接近靶細胞的細胞膜的錨定域，其中治療域含有至少一種能防止病原感染靶細胞的具有細胞外活性的肽或蛋白質。本發(fā)明在此方面的實施方案中，此至少一治療域具有預防或者阻止病原對靶細胞的感染的抑制活性。在一優(yōu)選的實施方案中，此活性可抑制一種蛋白酶的活性，這種蛋白酶可加工感染靶細胞必需的病毒蛋白。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，此化合物包括一個治療域，其可以抑制流感病毒的HA蛋白的加工，并且此錨定域可將此化合物附著到呼吸上皮細胞的表面。在本發(fā)明的一些實施方案中，至少一個治療域具催化活性。在一個優(yōu)選實施方案中，此催化活性移走感染靶細胞所必需的靶細胞表面的一部分。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，此治療域是唾液酸酶，其可在上皮靶細胞的表面消化唾液酸成分，并且此錨定域是人類蛋白的GAG結合域，它可在上皮細胞的表面結合肝素或者硫酸乙酰肝素成分。在另一方面，本發(fā)明包括治療或者防止病原在生物體內的感染的藥物組合物。藥物組合物包括本發(fā)明中的一種化合物，該化合物包括至少一個治療域和至少一個錨定域。此藥物組合物也可包括溶液、穩(wěn)定劑、填充物和類似物。在某些優(yōu)選的實施方案中，此藥物組合物以吸入劑的形式配成。在一些優(yōu)選的實施方案中，此藥物組合物配成鼻噴霧劑。本發(fā)明的另一個方面是此藥物組合物含至少一種唾液酸酶。此唾液酸酶可為從任何來源中分離出的蛋白，舉例說來，如一種細菌或者哺乳動物源的，或可以是與一種自然中存在的唾液酸基本同源的重組蛋白。含唾液酸酶的藥物組合物可調制成鼻、氣管、支氣管、口腔或者局部用藥，或者可配成可注射的溶液或者滴眼液。含唾液酸酶的藥物組合物可用于治療或防止病原感染，用于治療或者預防過敏或發(fā)炎反應，或用于增強基因治療時重組病毒的轉導效率。本發(fā)明的另一個方面是一種唾液酸催化域蛋白。在這一方面，此蛋白質所含的唾液酸酶催化域并非整個唾液酸酶，其來源于被認為是唾液酸酶催化域的蛋白質。唾液酸酶催化域蛋白可包括其他蛋白質序列，例如(但不局限于)源于其他蛋白的功能結構域。含這種唾液酸酶的藥用組合物可被調制成鼻子、氣管、支氣管、口腔或者局部用藥，或者可配成可注射的溶液或者滴眼液。含這種唾液酸酶的藥物化合物可用于治療或預防病原感染，用于治療或者預防過敏或發(fā)炎反應，或用于增強基因治療時重組病毒的轉導效率。在另一方面，本發(fā)明包括治療或者預防病原感染的方法。在優(yōu)選的實施方案中，此方法包括賦予生物體唾液酸酶活性，例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白，包括唾液酸酶催化域融合蛋白，以便預防或者治療感染。病原體可以是病毒或者細菌。此方法包括應用本發(fā)明化合物的有效藥量到至少一種生物體靶細胞。優(yōu)選地，藥物組合物可通過噴霧劑、吸入劑或者局部用藥藥劑而得以應用。本發(fā)明也提供新的治療過敏和發(fā)炎的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明提供可以在細胞外活動以預防或阻止發(fā)炎細胞粘附和活動的化合物。一些優(yōu)選的實施方案中的用于治療過敏或發(fā)炎的化合物包括至少一個具有所述的細胞外活性的治療域和至少一個錨定此化合物到靶細胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括賦予生物體唾液酸酶活性，例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白，包括唾液酸酶催化域融合蛋白，以便預防或者治療過敏或者發(fā)炎反應。過敏或者發(fā)炎反應可以是哮喘、過敏性鼻炎、皮膚情況如濕疹，或對植物或動物毒素的反應。此方法包括應用本發(fā)明化合物的有效藥量到至少一個生物體的靶細胞。更優(yōu)選地，藥物組合物可通過噴霧劑、吸入劑或者局部用藥藥劑而得以應用。本發(fā)明也提供在基因治療中通過重組的病毒載體提高基因轉移效率的新的組合物和方法。特別是本發(fā)明提供可在細胞外活動的化合物以便減少物理或化學障礙對基因治療載體(如AAV載體)的轉導的阻礙。本發(fā)明通過重組病毒載體提高基因轉導效率的一些優(yōu)選的化合物包括至少一個具有細胞外活性的治療域和至少一個錨定此化合物到靶細胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括賦予生物體唾液酸酶活性，例如唾液酸酶或者唾液酸酶催化域蛋白，包括唾液酸酶催化域融合蛋白，以通過重組的病毒載體促進向靶細胞的轉導。此方法包括應用本發(fā)明的化合物的有效量和可一種重組病毒載體到至少一種靶細胞。本發(fā)明的藥物組合物可通過噴霧劑、吸入劑或者局部用藥藥劑而得以應用。圖1是抑肽酶氨基酸一級結構的示意圖。圖2顯示4個人類基因的GAG結合序列PF4，人血小板因子4；IL8，人白細胞介素8；ATIII，人抗凝血酶III；ApoE，人載脂蛋白E；AAMP-人脈管關聯(lián)遷移蛋白。圖3是人唾液酸酶NEU2和NEU4序列比對。圖4是比較細菌和真菌唾液酸酶底物特異性的表格。圖5顯示編碼His6-AvCD的構建體#1的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的NcoI和HindIII位點以粗體顯示。圖6顯示編碼AR-AvCD的構建體#2的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的NcoI和HindIII位點以粗體顯示。圖7顯示ARG4S-AvCD的構建體#3的核苷酸和氨基酸序列。用于克隆到pTrc99a的NcoI和HindIII位點以粗體顯示。圖8為一實驗數據圖，顯示AR-標簽促進α(2，6)-連接的唾液酸移出MDCK細胞。Y坐標為用各種重組的AvCD(構建體#1)(菱形)或重組的AvCD(構建體#2)(方形)的稀釋劑處理后MDCK細胞表面上的α(2，6)-連接的唾液酸的百分率。圖9是顯示用來自構建體#2重組AR-AcCD蛋白或從產尿素節(jié)桿菌分離的唾液酸酶處理的MDCK細胞得到的對流感病毒的抗感染效果。供試病毒株有A/WS/33(H1N1)；A/PR/8(H1N1)；A/日本/305/57(H2N2)；A/維多利亞/504/2000(H3N3)；A/香港/8/68(H3N2)；B/Lee/40；7.B/馬里蘭/1/59和土耳其/Wis/66(H9N2)。圖10為重組AR-AvCD唾液酸酶和重組AR-G4S-AvCD唾液酸酶對流感病毒擴增的抑制水平圖。供試病毒株有A/PR/8(H1N1)；A/WS/33(H1N1)；A/日本/305/57(H2N2)；A/香港/8/68(H3N2)；B/Lee/40；7.B/馬里蘭/1/59和土耳其/Wis/66(H9N2)。圖11顯示重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白局部用藥減少了流感病毒A(H1N1)病毒感染的雪貂的發(fā)炎反應。(A)感染后在顯示的時間內來自受感染的動物的鼻分泌物的發(fā)炎細胞總數。(B)測定了受感染的雪貂的無細胞鼻分泌物中的蛋白質濃度。受感染的雪貂用配藥液處理(方塊)或者用來自構建體#2的重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白(三角形)。未受感染的動物也用重組AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白處理(菱形)。統(tǒng)計學顯著值用*(p<0.05)和**(p<0.01)標記。圖12以表格顯示本發(fā)明中兩種唾液酸酶催化域融合蛋白對病毒復制的抑制，細胞保護EC50’C值和選擇指數。所有的EC50值單位為mU/ml。圖13以表格顯示用本發(fā)明中的唾液酸酶催化域融合蛋白處理的雪貂和用對照配藥液處理的雪貂呼吸道中病毒的復制情況。發(fā)明詳述定義除有特別定義外，所有在此用到的技術和科學術語具有的含義和本發(fā)明所屬領域普通技術人員普遍理解的一致。一般來說，在此用到的術語和產品或描述的實驗過程為大家熟知并且通常在所屬領域應用。這些流程用的是常規(guī)的方法，如在所屬領域各種一般的文獻中所提供。當一個術語以單數形式規(guī)定出來，發(fā)明者也提出此屬于的復數形式。當和部分的參考文獻中用到的術語和定義意思有分歧時，本專利申請用到的此術語使用在此給出的定義意思。在公開過程中使用的下列術語，除非另有規(guī)定，可被理解為下面的含義“病原體”可為任何病毒或者微生物體，其可感染細胞、組織或者有機體。病原體可為病毒、細菌或者原生動物?！鞍屑毎笨蔀槿魏慰杀徊≡w感染的細胞，或者可與發(fā)炎細胞作用的任何細胞，或者是通過重組病毒轉移外源基因的預計的宿主細胞?！爸亟M病毒”或者“重組病毒載體”，“基因治療病毒載體”或者“基因治療載體”的定義是遺傳工程化的病毒，其包括一個或更多的外源基因。當靶細胞被重組病毒轉導時，外源基因被轉移到靶細胞。轉移到靶細胞的基因可在細胞中表達以便提供預計的治療效果。目前，大多數普遍應用的基因治療病毒載體都基于4種病毒類型逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)和單純皰疹I型病毒?！鞍l(fā)炎細胞”為那些執(zhí)行或者參與免疫系統(tǒng)發(fā)炎反應的細胞。發(fā)炎細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、NK細胞和單核細胞?！翱深A防病原體感染靶細胞的細胞外活性”是任何一種能通過作用靶細胞或者在靶細胞外表面附近阻礙或者阻止病原體感染靶細胞的活性?？深A防病原體感染靶細胞的細胞外活性可為一種活性如(但不限于)催化活性或者抑制活性。例如，催化活性可為一種酶活性，其可降解病原體、靶細胞或者在靶細胞附近的一個或者更多的實體(例如連接子、受體或者酶，但不限于此)，此實體對感染過程有貢獻。催化活性也可修飾病原體、靶細胞或者在靶細胞附近的一個或者更多的實體，導致此實體的促進感染能力被削弱。抑制活性可為這樣一種活性，其可結合到受體或者連接子，防止此受體或者連接子結合到某部位，在此部位結合對于促進感染過程是必需的。抑制活性也可是一種防止酶或者受體行使對于促進感染過程必需的功能的一種酶或者受體的抑制因子。靶細胞的外部包括靶細胞膜本身，也包括包圍靶細胞的細胞外環(huán)境，包括細胞外基質、細胞間隙和魯米諾空間。對上皮細胞而言，靶細胞外部也包括形成魯米諾內襯的細胞膜頂端或魯米諾表面，以及魯米諾表面的細胞外環(huán)境。“可預防病原體對靶細胞的感染的細胞外活性”可為任何化學實體，包括蛋白質、多肽、肽、核酸和肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合體、脂質、類固醇、脂肪酸、碳水化合物等和包括這成分的任意組合。優(yōu)選地，此活性由肽或者蛋白質組成，或與肽或蛋白質偶聯(lián)。“可提高重組病毒的轉導效率或基因轉化效率的細胞外活性”可為任何一種可減少或消除重組病毒進入寄主細胞的物理或化學障礙的，作用于靶細胞或者靶細胞外表面附近的活性。可提高重組病毒的轉導效率或基因轉化效率的細胞外活性可為一種活性如(但不限于)催化活性或者抑制活性。例如，催化活性可為一種降解病原體上、靶細胞上或臨近靶細胞處一個或多個實體(如配體、受體或酶)的酶活性，此實體對感染過程有貢獻。催化活性也可修飾病原體、靶細胞或者在靶細胞附近的一個或者更多的實體，導致此實體的促進感染能力被削弱。抑制活性可為這樣一種活性，其可結合到受體或者連接子，防止此受體或者連接子結合到某部位，在此部位結合對于促進感染過程是必需的。抑制活性也可是一種防止酶或者受體行使對于促進感染過程必需的功能的酶或者受體的抑制因子。靶細胞的外部包括靶細胞膜本身，也包括包圍靶細胞的細胞外環(huán)境，包括細胞外基質、細胞間隙和魯米諾空間。對上皮細胞而言，靶細胞外部也包括形成魯米諾內襯的細胞膜頂端或魯米諾表面，以及魯米諾表面的細胞外環(huán)境?！翱深A防病原體對靶細胞的感染的細胞外活性”可為任何化學實體，包括蛋白質、多肽、肽、核酸和肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合體、脂質、類固醇、脂肪酸、碳水化合物等和包括這成分的任意組合。特別是，此活性由肽或者蛋白質組成，或與肽或蛋白質偶聯(lián)?！翱勺柚拱l(fā)炎細胞粘連或者發(fā)揮功能的細胞外活性”可為任何能預防發(fā)炎細胞接觸靶細胞和影響靶細胞的正常物理狀態(tài)的活性?！澳苠^定所述至少一種治療域到靶細胞的細胞膜上的結構域”，也稱為“細胞外錨定域”，簡單地說，“錨定域”指可穩(wěn)定結合在細胞表面或者位于細胞表面外部的或者非常接近細胞表面的一部分的化學實體。細胞外錨定域可逆或不可逆地的連接到一個或多個部位，例如，優(yōu)選地是可結合于一個或多個治療域，因此導致一個或多個被粘附的治療用部分居留在或非常接近真核細胞的外表面。優(yōu)選地，細胞外錨定域結合至少一個靶細胞表面的分子或者至少一個與靶細胞表面非常緊密聯(lián)系的分子。例如，細胞外錨定域可結合一個與靶細胞細胞膜共價或非共價聯(lián)系的分子，或者結合圍繞靶細胞的細胞外基質中的分子。細胞外錨定域優(yōu)選是肽、多肽或者蛋白質，也可包含任何化學實體的附加類型，包括一個或多個附加蛋白、多肽或肽，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合物、脂質、類固醇、脂肪酸、碳水化合物和任意這些成分的結合物。此處用到的蛋白質或者肽序列與引用序列“充分同源”是指其與參照序列一致或缺失一個或更多的氨基酸、多一個或更多氨基酸以及保守性替換一個或更多氨基酸，但保留了與參照序列相同的或者基本上相同的活性。保守性替換可定義為發(fā)生于下列五組情況下的置換I小的、脂肪族的、無極性或者極性很小的殘基Ala、Ser、Thr、Pro、GlyII極性的，帶負電的殘基和其酰胺化合物Asp、Asn、Glu、GlnIII極性的，帶正電的殘基His、Arg、LysIV大的、脂肪族的非極性殘基Met、Leu、Ile、Val、CysV大的芳香族的殘基Phe、Try、Trp在下列組中，下列替換被認為是“高度保守”的Asp/Glu、His/Arg/Lys、Phe/Tyr/Trp和Met/Leu/Ile/Val。半保守替換定義為(I)-(IV)組內其中兩組間的置換，其限于包括上述的(I)、(II)和(III)組的超組(A)的或者限于包括上述的(IV)和(V)組的超組(B)。此外，本專利申請中指定的疏水的氨基酸為Ala、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys、Phe和Trp，而親水的氨基酸為Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Arg、Lys和Tyr。“唾液酸酶”是能將唾液酸殘基從底物分子移出的酶。此唾液酸酶(N-?；窠洶备视退饷?，EC3.2.1.18)是一組酶，其能將唾液酸殘基從唾液酸結合糖中移出。唾液酸是具有9-碳骨架的α酮酸，經常被發(fā)現粘附于糖蛋白和糖脂的寡糖鏈的突出端。唾液酸的一種主要類型是N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)，它是其他大多數類型唾液酸的生物合成前體。底物分子可為以下例子但不限于此寡糖、多聚糖、糖蛋白、神經節(jié)苷脂或者合成的分子。例如，唾液酸酶可剪切唾液酸殘基和底物分子的殘余物之間的，具有α(2，3)-半乳糖、α(2，6)-半乳糖或α(2，8)-半乳糖連接的鍵。唾液酸酶也可剪切唾液酸殘基和底物分子殘余物的任何連接。Neu5Ac和碳水化合物側鏈的倒數第二個半乳糖殘基的兩個主要連接，Neu5Acα(2，3)-半乳糖和Neu5Acα(2，6)-半乳糖，已在自然界中發(fā)現。Neu5Acα(2，3)-半乳糖和Neu5Acα(2，6)-半乳糖兩種分子均可被流感病毒作為受體而識別，雖然人類病毒似乎更易識別Neu5Acα(2，6)-半乳糖，但是鳥和馬病毒主要是識別Neu5Acα(2，3)-半乳糖。唾液酸酶可為自然發(fā)生的酶、人工酶(如氨基酸序列基于自然發(fā)生的唾液酸酶的序列的酶，其包括與自然發(fā)生的唾液酸的序列基本同源的序列，但不限于此)。在此用到的“唾液酸酶”也可指自然發(fā)生的唾液酸酶的活性部分，或者包含基于自然發(fā)生的唾液酸酶的活性部分的肽或蛋白質?！叭诤系鞍住笔前▉碜灾辽賰煞N不同來源的氨基酸序列的蛋白質。融合蛋白可包括來自自然產生的蛋白的或者與自然產生蛋白的全部或一部分基本同源的氨基酸序列，除此外可包括從一到非常多數目的來源不同的自然產生的蛋白的或者與其全部或者部分基本同源的氨基酸。另一選擇為，融合蛋白可包括來自自然產生的氨基酸序列或者是與自然產生的蛋白的全部或者部分基本同源的，或者此外可包含人工合成的一個到很多的氨基酸?！巴僖核崦复呋虻鞍住睘楹僖核崦复呋虻牡鞍祝蛘呤前c唾液酸酶催化域充分同源的氨基酸序列，但不包括此催化域來源的唾液酸酶的全部氨基酸序列，其中此唾液酸酶催化域蛋白具有與其來源唾液酸酶催化域相同的完整的活性。唾液酸酶催化域可包括全部來自于唾液酸酶的氨基酸序列，但不是必要的。唾液酸酶催化域蛋白可包括來自或者與一個或多個其它的已知蛋白的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，或者可包括一個或多個不來自或者與一個或多個其它的已知蛋白的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。I預防或者治療病原體感染的組合物本發(fā)明包括基于肽或者蛋白的化合物，包括可錨定至少一個治療域到真核細胞的細胞膜的至少一個結構域和至少一個具有可預防病原體感染細胞的細胞外活性的治療域?！盎陔幕蛘叩鞍住被衔镏复嘶衔锏膬蓚€主要的結構域有通過肽鍵結合氨基酸的氨基酸框架。基于肽或者蛋白的化合物也可具有其他化學混合物或者組群粘附到此氨基酸框架或者骨架，其包括對于此錨定域的錨定活性有貢獻的成分，或者對于此治療域的防感染活性有貢獻的成分。例如，本發(fā)明的基于蛋白的治療劑可包括如下化合物和分子，但不限于此碳水化合物、脂肪酸、脂質、類固醇、核苷酸、核苷酸類似物、核酸分子、核酸類似物、肽核酸分子、小的有機分子或甚至是聚合體。本發(fā)明的基于蛋白的治療劑也可包括修飾了的或者非自然產生的氨基酸?？赡苡糜谌魏文康牡拇嘶衔锏姆前被岵糠职?但不限于此)保持此化合物純度，增強此化合物溶解度、分布(例如在治療制劑中)，連接此化合物的結構域或化學成分于化合物，維持此化合物的二維或三維結構，增加此化合物的總體積，增加化合物的穩(wěn)定性和對此化合物的錨定活性或治療活性有貢獻。本發(fā)明的此基于肽或蛋白的化合物也可包括含錨定域和結構域的那些以外的蛋白質或者肽序列。此附加的蛋白質序列可用作任何目的，包括但不受限于上述的任何目的(提純此化合物，增強此化合物的溶解或分布，連接此化合物的結構域或者連接此化合物的化學成分，維持此化合物的二維或者三維的結構，增加此化合物的總大小，增加此化合物的穩(wěn)定性，和提高此化合物的錨定活性和治療活性)。優(yōu)選地，任何附加的蛋白或者氨基酸序列是一個多肽或者蛋白質鏈的一部分，其包括一個或多個此錨定域或者此治療域，但是任何可行的蛋白質序列的排列是在本發(fā)明范圍之內。此錨定域和治療域可以任何合適的方法排序，其允許此化合物結合到或者臨近靶細胞膜，這樣此治療域可顯示預防或者阻止病原體對靶細胞的感染的細胞外活性。此化合物優(yōu)選地具有至少一個基于蛋白質或肽的錨定域和至少一個基于肽或者蛋白的治療域。在這種情況下，此結構域可以任何順序線性排序。此錨定域可為此治療域的N末端，或者可是此治療域的C末端。一個或者多個治療域在每一末端接有至少一個錨定域是可能的。另一選擇是，一個或者多個錨定域可在每一末端接有至少一個治療域?；瘜W的或優(yōu)選地肽的連接子可任選地用于連接一些或者所有的此化合物的結構域。結構域非線性的枝狀的排列也是可能的。例如，此治療域可粘附于氨基酸的衍生側鏈，其也包括或者連接到此錨定域的多肽鏈的一部分。本發(fā)明的化合物可具有多于一個的錨定域。在化合物具有多于一個的錨定域的情況下，此錨定域可是相同的或者不同的。本發(fā)明的化合物可具有多于一個的治療域。在化合物具有多于一個的治療域的情況下，此治療域可是相同的或者不同的。當化合物包括多個錨定域時，此錨定域可被一前一后地排列(有或者沒有連接子)或者在其它結構域，例如治療域的交替?zhèn)取．斠换衔锇ǘ鄠€治療域，此治療與可被一前一后地排列(有或者沒有連接子)或者在其它結構域，例如但不限于錨定域的交替?zhèn)?。本發(fā)明的基于肽或蛋白的化合物可通過任何合適的方法制造，包括純化自然發(fā)生的蛋白，任選的水解剪切此蛋白以獲得想要的功能域，并將此功能域與其他功能域接合。肽也可化學合成，并且任選的化學接合到其他肽或者化學成分。然而，本發(fā)明的基于肽或者蛋白的化合物的制造優(yōu)選地是通過加工核酸構建體以在一個連續(xù)的多肽中同時編碼至少一個錨定域和至少一個治療域(有或沒有核酸連接子)。此核酸構建體，優(yōu)選地具有合適的表達序列，可被轉染到原核和真核細胞，并且此治療用的基于蛋白的化合物可在這些細胞中表達并純化。任何想要的化學成分在提純后可被任選地接合到基于肽或蛋白的化合物。在某些情況下，可選擇細胞株系以表達具備進行想要的翻譯后修飾(例如，但不受限于糖基化)的能力的基于蛋白的治療劑?？稍O計多種構建體并且可測試它們的基于蛋白的產物的想要的活性(例如，舉例來說，錨定域的結合活性，或者治療域的結合、催化或者抑制活性)?？蓽y試核酸構建體的蛋白產物的防止或者阻止病原體對靶細胞的感染的效率。病原體在體外或體內感染能力的測試已為所屬領域所熟知，例如在實施例中描述的流感病毒的感染能力那樣。錨定域在此用到的“細胞外錨定域”或者“錨定域”是可穩(wěn)定結合在處于靶細胞外表面或者與靶細胞外表面非常接近的實體的任何分子。錨定域的作用是將本發(fā)明的化合物保留在靶細胞的外表面或者接近靶細胞。細胞外錨定域優(yōu)選地結合1)在靶細胞表面表達的分子，或者成分、結構域、或者在靶細胞表面表達的分子的表位，2)粘附于在靶細胞表面表達的分子的化學實體，或者3)圍繞靶細胞的細胞外基質的分子。優(yōu)選的錨定域是肽或者蛋白質結構域(包括修飾了的或者衍生的肽或者蛋白域)，或者包括偶連肽或蛋白質的成分。偶連肽或蛋白質的成分可為任何分子類型，其可幫助錨定域結合到位于或接近靶細胞表面的任何實體，并且有機分子是優(yōu)選的，例如核酸，肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小有機分子、聚合物、脂質、類固醇、脂肪酸、碳水化合物，或者任何這些物質的任何組成物。通過錨定域結合的分子、復合物、結構域、或表位對于靶細胞可能或者可能不會具有專一性。舉例來說，錨定域可結合位于分子上或者與靶細胞非常接近的表位，并且此結合也發(fā)生在不是在靶細胞的周圍的位點上。然而在許多情況下，本發(fā)明中的治療化合物的局部釋放會限制它主要在靶細胞表面出現。在其它情況下，被錨定域結合的分子、復合物、部分、結構域、或表位可能對于靶組織或者靶細胞類型是專一的。靶組織或者靶細胞類型包括病原體入侵或者擴增的動物或者人體的位點。舉例來說，靶細胞可為能被病原體感染的內皮細胞。本發(fā)明的組合物可包括能結合到細胞表面表位的錨定域，舉例說來，對內皮細胞類型專一的化合物。再舉一例，靶細胞可為內皮細胞，本發(fā)明的組合物可結合位于許多內皮細胞類型的細胞表面的，或者位于內皮細胞不同類型的細胞外基質的表位。在這種情況下組合物的局部釋放位點限制于作為病原體攻擊目標的內皮細胞上。預防或者治療病原體導致的感染的化合物可包括可結合在或者接近上皮細胞表面的錨定域。舉例來說，與肝素緊密相關的硫酸乙酰肝素是一種在細胞膜上(包括呼吸上皮細胞的表面)普遍存在的糖胺聚糖(GAG)。許多蛋白特異地結合到肝素/硫酸乙酰肝素，并且在這些蛋白質中此GAG結合序列已被鑒定(Meyer，Fa，King，M和gelman，RA.(1975)BiochimicaetBiophysicaActa392223-232；Achauer，S.ed.，223頁.SialicAcidsChemistry，MetabolismandFunction.Springer-Verlag，1982)。舉例來說，此人血小板因子4PF4的GAG結合序列(SEQIDNO2)，人白細胞介素8(IL8)(SEQIDNO3)，人抗凝血酶III(ATIII)(SEQIDNO4)；人載脂蛋白E(ApoE)(SEQIDNO5)；人脈管關聯(lián)遷移蛋白(AAMP)(SEQIDNO6)；人雙調蛋白(SEQIDNO7)(圖2)已顯示對肝素具有非常高親和力(納摩爾級)(Lee，MK和Lander，AD(1991)ProNatlAcadSciUSA882768-2772；Goger，B，Halden，Y，Rek，A，Mosl，R，Pye，D.Gallagher，J和Kungl，AJ.(2002)Biochem.411640-1646；Witt，DP和LanderAD(1994)CurrBio4394-400；Weisgraber，KH，Rall，SC，Mahley，RW，Milne，Rw和Marcel，Y.(1986)JBioChem2612068-2076)。這些蛋白質的GAG結合序列與它們的受體結合序列明顯不同，因此它們不能誘導與全長蛋白或者此受體結合結構域相關的生物活性。這些序列或者其它序列已被鑒定或者將來要被鑒定為肝素/硫酸乙酰肝素結合序列，或具有肝素/硫酸乙酰肝素結合活性的與已被鑒定為肝素/硫酸乙酰肝素結合序列同源的序列，在本發(fā)明的化合物中可用作上皮細胞錨定域，用于預防或者治療如呼吸道上皮細胞感染病毒，此類病毒包括但不局限于流感病毒。錨定域可結合靶細胞中的實體，該實體可特異存在于一種物種的靶細胞中，也可在多個物種的靶細胞中均能發(fā)現。在錨定域可結合存在于多于一種靶細胞類型的表面的成分，并且病毒和病原體可感染多于一種的細胞類型的情況下，治療化合物可用于多于一種細胞類型(假定此治療域也對相關物種有效)。舉例來說，在治療用化合物可用于抗流感病毒的情況下，本發(fā)明的治療用化合物具有結合肝素/硫酸乙酰肝素的錨定域，此化合物就如用于鳥類一樣也可用于哺乳動物(包括人類)。治療域本發(fā)明的化合物包括至少一個治療域，其具有可防止或者阻止病原體感染的細胞外活性，可調節(jié)受體的免疫反應，或者可以提高重組病毒的轉導效率。此治療活性可以是，作為非限制性例子，結合活性、催化活性或者抑制活性。在本發(fā)明的一些實施方案中，此治療活性修飾或者抑制病原體的幫助病原體感染細胞的功能。在另外一些實施方案中，治療域可修飾或者抑制靶細胞或者靶生物體的功能。舉例來說，此治療域可結合靶細胞上的受體，其對于病原體結合到靶細胞來說是必需的。在這個意義上，治療成分可阻礙病原體結合到靶細胞并預防感染?？晒┻x擇的是，治療域可結合病原體上的分子或者表位以阻止分子或者表位與靶細胞的相互作用，其對感染是必需的。治療域也可具有降解病原體或者寄主的分子或表位的催化活性，其允許或者提高寄主對靶細胞的感染。在其它的實施方案中，治療域可為對病原體感染靶細胞必需的活性的抑制物。受抑制的活性可為寄主生物體或者病原體的活性。此治療域優(yōu)選地在細胞外作用，意為其感染的預防、發(fā)炎反應的調節(jié)或者增強轉導的活性發(fā)生在靶細胞表面或者在此靶細胞周圍的介質中，包括細胞外基質內位點、細胞外空間或者組織的魯米諾空間。肽或者蛋白域(包括修飾了的或者衍生的肽或者蛋白域)是優(yōu)選的治療域，或包括偶連肽或蛋白質的分子。偶連肽或者蛋白質的分子可為任何可預防或者阻止病原體對靶細胞的感染的分子，并且優(yōu)選地是有機分子，如，舉例來說，核酸、肽核酸、核酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、小的有機分子、聚合物、脂質、類固醇、脂肪酸、碳水化合物或任何這些物質的組合物。治療域可為合成肽或者多肽，或者可包括可被接合到肽或者多肽上的合成分子，可為自然發(fā)生的肽或者蛋白質或者自然發(fā)生蛋白的結構域。治療域也可為肽或蛋白質，其基本上與自然發(fā)生的肽或者蛋白質同源。治療域可用于一個特定物種，或者可預防或者阻止病原體對多于一種物種的感染。舉例來說，阻止病原體的功能的治療域可普遍用于一定范圍的物種，其可被宿主感染，然而通過宿主的特性干擾而打斷宿主病原體相互作用的治療域可或者不可為一種特定物種。在許多情況下，錨定域和治療域可在多于一個物種上有效，因而本發(fā)明的化合物在減少病毒在動物宿主中的繁殖和傳播時可用于提高人類和動物的健康。舉例說來，當治療域為唾液酸酶時，唾液酸酶可剪切多于一種類型的唾液酸殘基和基質殘留物的連接，特別是，唾液酸酶可同時剪切α(2，6)-半乳糖、α(2，3)-半乳糖聯(lián)接，可包括人類不受廣譜流感病毒感染，包括在不同物種如鳥、豬或者馬自然寄生的病毒。連接子本發(fā)明的化合物可任選的包括一個或者多個連接子，其可連接此化合物的結構域。連接子可用于提供最佳的化合物結構域間距或者折疊。連接子連接的化合物的結構域可為治療域、錨定域或者此化合物的任何其他的結構域或者成分，其提供附加的功能例如增強化合物穩(wěn)定性、有助于純化等。用于連接本發(fā)明化合物結構域的連接子可為化學連接子或者氨基酸或肽連接子。在化合物包括多于一個連接子時，連接子可為相同的或者不同的。在化合物包括多于一個連接子時，連接子可為相同的或者不同的長度。有機化學領域已熟知許多連接子的各種組成、極性、反應性、長度、柔性和可裂解性。本發(fā)明優(yōu)選的連接子包括氨基酸或者肽連接子。肽連接子為所屬領域所熟知。優(yōu)選的連接子長為1到100個氨基酸，且更優(yōu)選的是長為1到30個氨基酸，盡管長度不是本發(fā)明的化合物的連接子的限制因素。優(yōu)選的連接子包括不干擾本發(fā)明的單體編碼的肽或蛋白質的形成和活性的氨基酸系列。本發(fā)明的一些優(yōu)選的連接子為包括氨基乙酸的類型。舉例來說，連接子含有下列序列(GGGGS(SEQIDNO10))n，n為1到20間的整數，或者優(yōu)選地為1到12，可用于連接本發(fā)明的治療化合物的結構域。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的基于蛋白的化合物的核酸分子，其包括至少一個治療域和至少一個錨定域。此核酸分子可有在特定細胞類型中如大腸桿菌或者人類細胞表達的優(yōu)化的密碼子。編碼本發(fā)明的基于蛋白的化合物的本發(fā)明的核酸分子包括至少一個治療域和至少一個錨定域，也可包括其它核苷酸序列，包括但不限于增強基因表達的序列。此核酸分子可為載體，例如但不限于表達載體。包括至少一個錨定域和至少一個蛋白酶抑制劑的組合物本發(fā)明的一些方面，具有細胞外活性的可阻止病原體對細胞的感染的治療域為蛋白酶抑制劑。此蛋白酶抑制劑可為任何類型的化學實體，如，舉例來說，碳水化合物或者聚合體，但是抑制酶活性的蛋白或肽優(yōu)選。優(yōu)選地，此蛋白酶抑制劑抑制至少部分地加工至少一個病原體或宿主細胞蛋白的酶的活性，病原體或者宿主細胞蛋白在其上的加工對于病原體感染是必需的。此加工對病原體的感染是必需的病毒蛋白的酶可為一種病原體酶或者來自宿主有機體的一種酶。優(yōu)選地，此加工酶在靶細胞表面或附近起作用，因此本發(fā)明的一種粘附在或者位于靶細胞表面的化合物可有效地阻止此酶的活性。本發(fā)明的包括蛋白酶抑制劑結構域的化合物可用于抑制任何病原體的感染，在其生命周期需要蛋白酶的，在其中蛋白酶在或者位于宿主細胞表面附近是有活力的。此基于蛋白的組合物可包括，例如，一種下列的結構(錨定域)n-連接子-(蛋白酶抑制劑)n(n＝1，2，3或者更多)或(蛋白酶抑制劑)n-連接子-(錨定域)n(n＝1，2，3或者更多)此蛋白酶抑制劑可為肽或多肽的單體形式或可為相同多肽的多個拷貝，其直接地連接或者在其間有間隔序列。另一選擇是，當蛋白酶抑制功能域時，不同的基于多肽的蛋白酶抑制劑可相互連接，比如，舉例來說，與大豆蛋白酶抑制劑連接的抑蛋白酶肽。此多肽或者肽可直接地連接或者通過一個由肽連接序列組成的間隔子。此錨定域可為任何可結合到處于靶細胞表面附近的肽或者多肽。此蛋白酶抑制劑可為自然發(fā)生的蛋白酶抑制劑(或者其活性部分)或者可為加工的蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的化合物中用到的肽蛋白酶抑制劑可含有與自然發(fā)生的蛋白酶抑制劑基本上同源的序列，具有一個或多個刪除、附加或者替換，保持與自然發(fā)生的蛋白酶抑制劑的相同的或者基本相同的活性。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療化合物用于預防或者治療人類流感，且此治療域是可抑制絲氨酸蛋白酶的可剪切流感病毒血凝素前體蛋白HA0為HA1和HA2的蛋白或肽的蛋白酶抑制劑。很多絲氨酸蛋白酶抑制劑已顯示可減少培養(yǎng)細胞、雞胚和受感染的小鼠肺中的HA的剪切或者流感病毒的活化。這些抑制劑包括許多經常應用的胰島素抑制劑，例如抑肽酶(ZhironOP，IkizlerMR和WrightPF.(2002)JVirol768682-8689)，亮抑肽酶(ZhironOP，IkizlerMR和WrightPF.(2002)JVirol768682-8689；TashiroM，KlenkHD和RottR.(1987)JGenVirol682039-2043)，大豆蛋白酶抑制劑(Barbey-MorelCL，OeltmannTN，EdwardsKM和WrightPF.(1987)JInfectDis155667-672)，6-氨基己酸(ZhironOP，OvchartenkoAV和BukrinskayaAG.1982.ArchVirol73263-272)和正對甲苯磺?；?L-賴氨酸(TLCK)(Barbey-MorelCL，OeltmannTN，EdwardsKM和WrightPF.(1987)JInfectDis155667-672)。在這些當中，抑肽酶的霧化吸入和其在人類的表現一樣(ZhironOP.(1983)ProblemsVirol.49-12(以俄語出版))，已在小鼠上顯示確定的對流感和支氣管肺炎的治療效果(ZhironOP，OvchartenkoAV和BukrinskayaAG.(1984)JGenVirol65191-196；ZhironOP，OvchartenkoAV和BukrinskayaAG.(1985)JGenVirol661633-1638；ZhironOP.(1987)JMedVirol65161-167；OvchartenkoAV和ZhironOP.(1994)AntiviarlRes23107-118)。抑肽酶(SEQIDNO1；圖1)是一個58氨基酸多肽抑制劑(也稱為特斯樂或牛胰抑肽酶(BBTI))。本發(fā)明的化合物可具有一個或多個抑肽酶結構域；例如，本發(fā)明的治療域可具有1到6個抑肽酶多肽，更優(yōu)選地1到3個抑肽酶多肽。本發(fā)明的化合物可有包括與抑肽酶氨基酸序列基本同源的多肽或者肽的治療域。預防或者治療流感的化合物包括抑肽酶，優(yōu)選地包括可結合在或者到上皮細胞表面附近的錨定域。在一些優(yōu)選地實施方案中，此上皮錨定域是來自人類蛋白的GAG-結合序列，例如，人血小板因子4(PF4)的(SEQIDNO2)、人白細胞介素8(IL8)(SEQIDNO3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQIDNO4)、人載脂蛋白E(ApoE)(SEQIDNO3)，人脈管關聯(lián)遷移蛋白(AAMP)(SEQIDNO6)或者人雙調蛋白(SEQIDNO7)(圖2)的GAG-結合序列。本發(fā)明的化合物也可具有包括多肽或者肽的錨定域，其基本與列在SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQID和NO7中的GAG-結合域的氨基酸序列同源。臨床上，包括抑肽酶和上皮的錨定域的藥物通過霧化吸入給藥而覆蓋整個呼吸道以預防或者阻止由在其生命周期中需要絲氨酸蛋白酶的流感病毒或者其他病毒如副流感病毒導致的支氣管肺炎。另一選擇是，抑肽酶/上皮的錨定域融合蛋白可被用作鼻噴霧劑以治療未并發(fā)的早期流感病或者其他呼吸病毒的感染。此外，抑肽酶/上皮的錨定域融合蛋白可在感染發(fā)生前用作流感或者其他病毒感染的預防藥物。包括至少一個錨定域和至少一個催化活性的組合物在本發(fā)明的一些方面，具細胞外活性的治療域可阻止病原體對細胞的感染是催化活性。此酶活性可為移除、降低或者修飾對病原體感染有用的宿主分子或聯(lián)合體或者病原體分子或聯(lián)合體的催化活性。優(yōu)選地，被本發(fā)明的化合物的酶活性移出、降低或者修飾的此宿主分子或聯(lián)合體或者病原體分子或聯(lián)合體附于、向著或者靠近靶細胞的表面，以便錨定于靶細胞表面的本發(fā)明的化合物可有效地抑制宿主或者病原分子或聯(lián)合體。舉例說來，治療域可有可消化病原體或靶細胞的分子或表位的催化活性，其是宿主-病原體結合，進而病原體進入到靶細胞所需要的。靶細胞上允許病毒進入細胞的受體可為本發(fā)明化合物酶活性的靶。本發(fā)明包括催化域的化合物可用于阻止任何用受體來幫助其進入靶細胞的病原體的感染，只要此受體的移除不削弱此有機體。這些基于蛋白的組合物可含有，例如，一種下列的結構(錨定域)n-[連接子]-(酶活性)n(n＝1，2，3或者更多)或(酶活性)n(n＝1，2，3或者更多)-[連接子]-(錨定域)n，在此連接子是任選的。此酶活性可為肽或者多肽的單體形式或者可為相同多肽的多個拷貝，其或者直接地或者在其間以間隔序列連接。此多肽或肽可直接或者通過由肽連接子序列組成的間隔子連接。此錨定域可為任何可結合到或者接近靶細胞表面的肽或者多肽。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，治療域包括可除去或者大大的減少上皮細胞表面地唾液酸水平的唾液酸酶。唾液酸為流感病毒的受體。這樣，用唾液酸酶處理呼吸上皮細胞表面可阻止流感感染或者干擾早期感染。此治療域可包括完整的唾液酸酶蛋白但表或者其活性部分。唾液酸為流感病毒的受體，并且至少為至少一個下列病毒的受體副流感病毒、一些冠狀病毒和輪狀病毒、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌和幽門螺桿菌。這樣，用唾液酸酶處理呼吸上皮細胞可預防流感或者其他病毒感染或者干擾早期感染，也預防或者減少如下細菌的繁殖肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和銅綠假單胞菌。用唾液酸酶處理胃腸上皮細胞可預防或減少胃部幽門螺桿菌的定居。唾液酸也介導細胞粘附和發(fā)炎細胞和靶細胞間的相互作用。因此，用唾液酸酶處理呼吸上皮細胞的表面可預防發(fā)炎細胞在氣管表面的增長，并且因此可治療包括哮喘和過敏性鼻炎的過敏反應。唾液酸作為屏障可通過基因治療載體阻止細胞進入，用唾液酸酶處理靶細胞可增加轉導效率，且因此提高基因治療的效果。優(yōu)選的唾液酸酶為大的細菌唾液酸酶，其可降解受體唾液酸Neu5ACα(2，6)-半乳糖和Neu5ACα(2，3)-半乳糖。舉例來說，來自產氣莢膜梭菌(GenBank注冊號X87369)、粘性放線菌(GenBank注冊號X62276)、產尿素節(jié)桿菌或生綠小單孢菌(GenBank注冊號D01045)的細菌唾液酸酶可被應用。本發(fā)明化合物的治療域可包括大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列全部或部分，或者可包括與大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本同源的氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，治療域包括由粘性放線菌編碼的唾液酸酶，例如SEQIDNO12中的或者例如與SEQIDNO12基本同源的唾液酸酶序列。在另一優(yōu)選實施方案中，治療域包括此粘性放線菌唾液酸酶的包括SEQIDNO12的274到666的氨基酸的催化域，或者基本同源的序列。其他的優(yōu)選的唾液酸酶為人唾液酸酶，例如由基因NEU2(SEQIDNO8；Genebank登記號Y16535；Monti，E，Preti.Rossi，E.，Ballabio，A和BoraniG.(1999)Genomics　57137-143)編碼的那些和NEU4(SEQIDNO9；Genebank登記號NM080741；Monti，E，Preti，A，Venerando，B和Borsani，G.(2002)NeurochemRes27646-663)(圖3)。本發(fā)明化合物的治療域可包括人唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分或者可包括與人唾液酸酶的氨基酸序列的全部或部分基本同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，當治療域包括自然發(fā)生的唾液酸酶的氨基酸序列的一部分，或者與自然發(fā)生的氨基酸序列的一部分基本同源的序列，此部分具與人唾液酸酶基本相同的活性。包括一個酶域的預防或治療流感的化合物優(yōu)選地包括可結合到或者接近上皮細胞表面的錨定域。在一些優(yōu)選地實施方案中，此上皮-錨定域是來自人蛋白的GAG-結合序列，如，舉例來說，人血小板因子4(PF4)的(SEQIDNO2)、人白細胞介素8(IL8)(SEQIDNO3)、人抗凝血酶III(ATIII)(SEQIDNO4)、人載脂蛋白E(ApoE)(SEQIDNO3)，人脈管關聯(lián)遷移蛋白(AAMP)(SEQIDNO6)或者人雙調蛋白(SEQIDNO7)(圖2)的GAG-結合序列。上皮錨定域也可基本同源于自然發(fā)生的GAG-結合序列，例如在圖2中列出的那些。在例如但不受限于流感病毒、副粘病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和銅綠假單胞菌和細菌感染等病原體的感染的治療或預防和在治療和預防過敏和發(fā)炎反應時，用包括人唾液酸酶或者包括與唾液酸酶基本同源的沒有錨定域的化合物以便提高重組病毒的轉導效率也在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明認識到可通過例如但不受限于粘性放線菌唾液酸酶或者如NEU2和NEU4的人唾液酸酶等唾液酸酶的運用來預防或者消除這些感染。此唾液酸酶可任選地應用，通過基因或化學加工，或者通過制備藥劑，以便提高它們的半衰期或者其在呼吸上皮細胞的保留時間。因為流感病毒主要是感染上呼吸道，局部地去除鼻孔和鼻咽部的受體唾液酸可預防感染或者干擾早期感染。此唾液酸酶可以鼻噴霧劑的形式到達上呼吸道，且其可在流感(或其它感染)早期以治療方式或者在感染發(fā)生前以預防方式應用。另一選擇是，其可以吸入劑形式到達下呼吸道以預防流感的并發(fā)癥，如支氣管肺炎。II包括至少一個唾液酸酶活性的治療組合物本發(fā)明包括含至少一個唾液酸酶活性的治療組合物。此唾液酸酶活性可為從任何來源分離的唾液酸酶，如，舉例來說，細菌或哺乳動物來源，或者可為與自然發(fā)生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重組蛋白。優(yōu)選的唾液酸酶為大的細菌唾液酸酶，其可降解受體唾液酸Neu5Acα(2，6)-半乳糖和Neu5Acα(2，3)-半乳糖。例如，可應用來自產氣莢膜梭菌(GenBank注冊號X87369)、粘性放線菌(GenBank注冊號L06898)、產尿素節(jié)桿菌或生綠小單孢菌(GenBank注冊號D01045)的細菌唾液酸酶或者基本同源的蛋白。舉例來說，本發(fā)明的治療化合物可包括大的細菌唾液酸酶或者可包括具大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列的蛋白質或者可包括與大的細菌唾液酸酶的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列。本發(fā)明一優(yōu)選的治療組合物包括粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNO12)，或者包括與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的蛋白質。其他的優(yōu)選的唾液酸酶為人唾液酸酶，例如為NEU2基因(SEQIDNO8；Genebank登記號Y16535；Monti，E，Preti.Rossi，E.，Ballabio，A和BoraniG.(1999)Genomics57137-143)編碼的那些和NEU4(SEQIDNO9；Genebank登記號NM080741；Monti，E，Preti，A，Venerando，B和Borsani，G.(2002)NeurochemRes27646-663)(圖3)編碼的唾液酸酶。本發(fā)明的化合物的治療域可包括與人唾液酸酶的氨基酸序列基本同源的人唾液酸酶蛋白或者可包括與人唾液酸酶的氨基酸序列的全部和部分基本同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，當治療域包括與自然發(fā)生唾液酸酶的氨基酸序列的一部分，或與自然發(fā)生唾液酸酶的氨基酸序列的一部分大致同源的序列，此部分具與人唾液酸酶基本相同的活性。含唾液酸酶的藥用組合物可包括其它化合物，包括但不受限于也具治療活性的其它蛋白。由唾液酸酶組成的藥用組合物可包括可提高此組合物的穩(wěn)定性、溶解性、包裝、傳輸、堅固性、口感或者氣味的其它化合物。含唾液酸酶的藥用組合物可配成鼻、氣管、支氣管、口腔或者局部用藥，或者可配成注射液或滴眼液。包括唾液酸酶的藥用組合物可用于治療或者預防病原體感染，用于治療或預防過敏和發(fā)炎反應，或用于增強基因治療中重組病毒的轉導效率。III唾液酸酶催化域蛋白本發(fā)明也包括唾液酸酶催化域蛋白。在此用到的“唾液酸酶催化蛋白”包括唾液酸酶的催化域，但是不包括為此催化域來源的此唾液酸酶的整個氨基酸序列。唾液酸酶催化域蛋白具有唾液酸酶活性。優(yōu)選地，唾液酸酶催化域蛋白包括為催化域序列來源的此唾液酸酶的至少10％、至少20％、至少50％、至少70％的活性。更優(yōu)選地，唾液酸酶催化域蛋白包括催化域序列來源的此唾液酸酶的至少90％的活性。唾液酸酶催化域蛋白可包括其它氨基酸序列，例如但不受限于另外的唾液酸酶序列、源自其它蛋白質的序列或者不來自自然發(fā)生的蛋白質的序列的序列。附加的氨基酸序列可執(zhí)行許多功能，包括對催化域蛋白的其它活性作貢獻，增強唾液酸酶催化域蛋白的表達、加工、折疊或者穩(wěn)定性，或者甚至提供蛋白質需要的大小或者間隔。一優(yōu)選的唾液酸酶催化域蛋白是包括粘性放線菌唾液酸酶的催化域的蛋白質。優(yōu)選地，粘性放線菌唾液酸酶的催化域蛋白包括粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的第270-666個氨基酸。優(yōu)選地，粘性放線菌唾液酸酶的催化域蛋白包括粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的從第270到290個氨基酸的任何氨基酸開始的，到所述粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的從第665到901個氨基酸的任何氨基酸結束的氨基酸序列，并且缺少任何粘性放線菌唾液酸酶蛋白質序列的第1到269個氨基酸。(在此用到的“缺少任何粘性放線菌唾液酸酶蛋白質序列的第1到269個氨基酸”指當它們出現在指定的蛋白質或者氨基酸序列時缺少4到更多的連續(xù)氨基酸。)在一些優(yōu)選實施方案中，粘性放線菌唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的第274-681個氨基酸并且缺少其它粘性放線菌唾液酸酶序列。在一些優(yōu)選實施方案中，唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的第274-666個氨基酸并缺其它任何粘性放線菌唾液酸酶序列。在一些優(yōu)選實施方案中，唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的第290-666個氨基酸并缺其它任何粘性放線菌唾液酸酶序列。在另一優(yōu)選實施方案中，唾液酸酶催化域蛋白包括此粘性放線菌唾液酸酶序列(SEQIDNO12)的第290-681個氨基酸并缺其它任何粘性放線菌唾液酸酶序列。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明基于蛋白的化合物的核苷酸序列，其包括唾液酸酶的催化域。此核酸分子可具有在特殊細胞類型表達的優(yōu)化的密碼子，如，舉例來說，大腸桿菌或者人類細胞。本發(fā)明的編碼基于蛋白的化合物的，包括唾液酸酶的至少一個催化域的此核酸分子或本發(fā)明也可包括其它的核酸分子，包括但不受限于增強基因表達的序列。此核酸分子可在載體中，例如但不受限于表達載體。融合蛋白唾液酸酶催化域蛋白可為融合蛋白，其中此融合蛋白包括至少一個唾液酸催化域和至少一個其它蛋白質結構域，包括但不限于純化結構域、蛋白質標簽、蛋白質穩(wěn)定性結構域、溶解度結構域、增加蛋白質大小的結構域、蛋白質折疊域、蛋白質定位域、錨定域、N-末端結構域、C-末端結構域、催化活性結構域、結合域或者增強催化活性結構域。優(yōu)選地，此至少一個的其它蛋白質結構域來自其他來源，例如，但不受限于，來自其他蛋白質的序列。此至少一個的其它蛋白質結構域不需要基于任何已知的蛋白質序列，但是可被加工和根據經驗測試以便在融合蛋白中執(zhí)行任何功能。純化域可包括，作為非限制性例子，一個或多個組氨酸標簽、鈣調蛋白結合域、麥芽糖結合蛋白質結構域、鏈霉親和素結構域、鏈霉親和素結合域、內蛋白結構域或者幾丁質結合域。蛋白質標簽可包括可用于蛋白質抗體的探測的序列，如，舉例說來，myc標簽、血球凝集素標簽或者FLAG標簽。增強蛋白質表達、修飾、折疊、穩(wěn)定性、大小或者定位的蛋白域可基于已知或者加工的蛋白質的序列。其他蛋白域可具有結合或催化活性，或可增強此唾液酸酶催化域的催化活性。本發(fā)明的優(yōu)選的融合蛋白包括至少一個唾液酸酶催化域和至少一個錨定域。優(yōu)選的錨定域包括GAG-結合域如GAG-結合域或人雙調蛋白(SEQIDNO7)。本發(fā)明的融合蛋白的唾液酸酶催化域和其他結構域可任選地被連接子連接，如但不受限于肽連接子。多種肽連接子為所屬領域熟知。優(yōu)選的連接子是由氨基乙酸組成的肽連接子，如G-G-G-G-S(SEQIDNO10)。本發(fā)明也包括核酸分子和由唾液酸酶的催化域組成的本發(fā)明的融合蛋白。此核酸分子可具有在特別的細胞類中表達的優(yōu)化的密碼子，如，舉例來說，大腸桿菌和人類細胞。編碼本發(fā)明的融合蛋白的此核酸分子或者本發(fā)明也可包括其它核苷酸序列，包括但不受限于增強基因表達的序列。此核酸分子可為載體，如但不受限于表達載體。IV藥用組合物本發(fā)明包括配成藥用組合物的本發(fā)明的化合物。此藥用組合物包括用作藥用的可接受的載體而儲藏并且優(yōu)選地進而用藥，其在治療用的可接受的載體或者稀釋液中具有藥用的有效性。治療用的可接受的載體或者稀釋液為所屬藥用領域熟知、描述，例如在Remington’sPharmaceuticalart(第18版Mack出版公司，Easton，PA，(1990))。防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調味料可用于此藥用組合物。舉例來說，安息香酸鈉、山梨酸和對羥基丁酸酯可作為防腐劑加入。此外，也可以使用抗氧化劑和懸浮劑。依賴靶細胞，本發(fā)明的此化合物可被做成口服的藥片、膠囊或者酏劑，局部應用的藥膏或軟膏，直腸用的栓劑，消毒液、懸浮液或者用作吸入劑或者鼻噴霧劑的類似物來使用。注射劑也可以常規(guī)的形式制備或者是液體溶液或懸浮液，或者是適合在注射之前可制成液相溶液或懸浮液的固體形式，或者是乳劑。合適的賦形劑是，舉例來說，水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸鈉、半胱氨酸氫氯化物或其類似物。此外，如果想要，此注射用藥用組合物可包括少量的無毒的輔助物質，例如潤濕劑、pH緩沖劑和其類似物。受試化合物的藥用有效劑量依賴于用藥的途徑、接受治療的動物或病人的類型和此特定的動物目前的身體狀況。此劑量可被制定以達到想要的效果，但是會依賴這些因素如體重、飲食、正在服用的藥物和其他因素，這些在所屬醫(yī)學領域的技術人員會加以考慮。在使用本發(fā)明的方法時，本藥用組合物也可單獨使用或者與其它的物質組合，或者與其它治療或者診斷劑組合。這些產品可用在活的有機體內，優(yōu)選地，用在哺乳動物病人，優(yōu)選地用在人類，或者用在體外。在體內使用時，此藥用組合物可以以各種方式，包括于局部、注射用藥、靜脈、皮下、肌肉、結腸、直腸、鼻或腹膜內等的各種藥劑形式用給病人。這些方法可用于測試受試化合物在有機體內的活性。在優(yōu)選地實施方案中，這些藥用組合物可以為口腔用藥的懸浮液、溶液、藥片或者錠劑，鼻噴霧劑，吸入劑，注射劑，局部噴霧劑，藥膏，粉末或者凝膠的形式。當以懸浮液口腔用藥時，本發(fā)明的組合物根據所述藥劑制備領域所熟知的技術調制并且可能包括所述領域已知的微晶纖維素以適用于散裝，褐藻酸或者藻酸鈉作為懸浮劑，甲基纖維素作為增粘劑，且調味用甜料/芳香劑。用作快速釋放的藥片時，這些組合物可能包括所屬領域已知的微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和乳糖/或其他賦形劑、結合劑、混合劑、分解質、稀釋液和潤滑劑。漱口劑或沖洗劑制劑的成分包括抗菌劑、表面活性劑、助表面活性劑、油、水和其他添加劑如本領域已知的甜味劑/香料。當用作飲用溶液時，此組合物包括一個或多個本發(fā)明的化合物，溶解在水中，調節(jié)到合適的pH值，并且具備載體。此化合物可溶于蒸餾水、自來水、泉水和其類似物。此pH優(yōu)選地被調節(jié)到約3.5到約8.5之間?？商砑诱{節(jié)用甜料，例如，1％(w/v)的蔗糖。錠劑可根據美國專利號3,439,089制備，在此因這些目的而被包含在參考文獻中。當用作鼻噴霧劑或者吸入劑時，此藥用組合物根據所述藥劑制備領域所熟知的技術制備，并且可制備在所屬領域已知的鹽溶液、碳氟化合物和/或其他溶解或分散劑，用苯甲醇或其他合適的防腐劑、吸收促進劑以增加藥物利用率。見，舉例來說，Ansel，H.C.等PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems第6版(1995)。優(yōu)選的這些組合物和藥劑用合適的無毒的藥物可接受的成分制備。這些成分的和一些可在Remingtong’sPharmaceuticalSciences(第18版，Mack出版公司，Easton，PA(1990)，此領域的權威參考書)中發(fā)現的鼻腔給藥劑型的這些物質的制備為這些技術人員所知。選擇適合的載體高度依賴于想要的鼻腔給藥劑型的確切特性，例如溶液、懸浮液、藥膏或者凝膠。鼻腔給藥劑型一般包括除此活性成分外的大量的水。少量的其他成分如pH調節(jié)劑、乳化劑或分散劑、防腐劑、表面活性劑、膠凝劑或緩沖和其它穩(wěn)定和溶解劑也可能存在。優(yōu)選地，鼻腔給藥劑應與鼻分泌物是等濃度的。鼻腔制劑可用滴劑、噴霧劑、吸入劑給藥或者用任何其他的鼻腔內給藥形式用藥。任選地，傳遞系統(tǒng)可為單位劑量傳遞系統(tǒng)。每劑藥傳遞的溶液或懸浮液的體積可優(yōu)選地為任何從約5到約2000毫升，更優(yōu)選地從約10到1000毫升，并且再更加優(yōu)選地從約50到約500毫升。這些各種劑型的傳遞系統(tǒng)可為或者是以單位劑量或者是多單位劑量包裝的滴劑瓶、塑料擠壓瓶、噴霧瓶、霧化器或者藥物吸入劑。本發(fā)明的藥物的配備可改變?yōu)榘ǎ?1)其它的酸或堿以調整pH(2)其它的張度賦予劑包括山梨醇、甘油和葡萄糖；(3)其它的抗微生物的防腐劑如其它的對羥基苯甲酸酯、山梨酸酯、安息香酸酯、丙酸酯、三氯丁醇、苯甲醇、殺藻胺和汞；(4)其它的粘度劑如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其它的樹脂；(5)合適的吸收增強劑；(6)穩(wěn)定劑如抗氧化劑，象重亞硫酸鹽和抗壞血酸鹽；金屬螯合劑如依地鈉；和藥物溶解增強劑如聚乙二醇。V預防或者治療病原體感染的方法本發(fā)明也包括預防或治療病原體感染的方法。在一方面，此方法包括用本發(fā)明的藥用組合物處理被一病原體感染的或者有被一病原體感染的危險的受體，其包括含至少一個可錨定此化合物到或者接近靶細胞表面的錨定域和由具有至少一個可阻止病原體對靶細胞感染的胞外活性的肽或者蛋白的至少一個治療域的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的有效治療劑量到受體的上皮細胞。需處理的此受體可為動物或者人類。在另一方面，此方法包括用本發(fā)明的藥用組合物處理病原體感染了的或者有被病原體感染的危險的生物體，其包括具唾液酸酶活性的基于蛋白質的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的治療有效劑量到一個生物體的上皮細胞。此唾液酸酶活性可為一個分離的自然發(fā)生的唾液酸酶蛋白，或者至少與自然發(fā)生的唾液酸酶的一部分基本同源的重組蛋白。一優(yōu)選藥用組合物包括與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的唾液酸酶(SEQIDNO12)。要處理的此生物體可為動物或者人類。在另一方面，此方法包括用本發(fā)明藥用組合物處理病原體感染了的或者有被病原體感染的危險的生物體，其包括含唾液酸酶催化域的基于蛋白質的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的治療有效劑量到一個生物體的上皮細胞。此唾液酸酶催化域優(yōu)選地可與自然發(fā)生的唾液酸酶的催化域基本同源。一個優(yōu)選的藥用組合物包括一個與粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNO12)的第274-666個氨基酸基本同源的唾液酸酶催化域。病原體可為病毒、細菌或者原生細菌。在一些實施方案中，此病原體為下列的一種流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、冠狀病毒、輪狀病毒、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、綠膿桿菌和幽門螺桿菌。在一優(yōu)選實施方案中，此病原體為流感毒。本發(fā)明的化合物可被設計以用于人類或者動物。在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的化合物可用于預防病原體對一類動物的感染，例如哺乳動物。在本發(fā)明的一些方面，組合物可用于人類或者動物(雖然藥劑可能不同)。在一些方面，化合物的此活性域對多于一個種類、類型、亞型或者菌株的病原體有效并且對多于一種的寄主種類有活性。舉例來說，包括，舉例來說，例如防止流感病毒的HA蛋白加工的抑肽酶的活性域的，或包括將唾液酸受體從靶細胞移出的唾液酸酶的，或包括例如結合肝素或乙酰肝素的錨定域的，本發(fā)明的一些優(yōu)選的化合物，可用于鳥類、哺乳動物或者人類?？蓪σ欢ǚ秶挠心芰Ω腥静煌募闹鞣N類的病原體有效的這樣的化合物也可用于人類以對抗自然寄生在其他種類的病原體的感染。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，藥用組合物預防流感的感染，并且此藥用組合物的藥用有效劑量用到一生物體的呼吸上皮細胞。這可通過應用吸入劑或者通過鼻噴霧劑而實現。優(yōu)選地，此吸入劑或鼻噴霧劑一天用一到四次。因為流感病毒主要感染上呼吸道，定位地移出鼻孔、咽、氣管或支氣管的此受體唾液酸可預防或者干擾早期感染。此唾液酸酶可以鼻噴霧劑或者吸入劑的形式傳遞到上呼吸道，并且其可在流感(或其他感染)的早期以治療方式或者在流感發(fā)生前以預防的方式應用。另一選擇是，其可以吸入劑的形式傳遞到下呼吸道以治療流感并且預防流感并發(fā)癥，例如支氣管肺炎。相似地，此唾液酸酶可以鼻噴霧劑或吸入劑的形式傳遞以預防或減少副流感病毒和冠狀病毒的感染。其也可以吸入劑或鼻噴霧劑的形式傳遞以預防或減少病原細菌在呼吸道的定植，包括肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和綠膿桿菌。此治療與可通過基因或者化學加工任選地用于提高它們的半衰期或者在呼吸上皮細胞的居留。此外，其可以滴劑、噴霧劑或藥膏的形式局部地傳遞到眼睛或到外傷以預防和治療包括綠膿桿菌的細菌感染。其也可局部地用藥到口腔以治療幽門螺桿菌的感染。劑量所屬領域的技術人員顯而易見，體內有用的用藥劑量和用藥的特殊方式會根據年齡、體重、接受治療的病人的類型、施用的特殊的藥用組合物和施用此藥用組合物的特殊用途來決定。有效劑量水平的確定，其為達到想要的結果的需要的藥劑水平，可為所屬領域的技術人員用上述的程序方法完成。在不用人的動物研究中，藥用組合物的施用以一個高的劑量水平開始，隨著劑量降低，直到不再達到想要效果或者相反的副作用減少或者消失。根據想要的藥效、治療指征、用藥程序、純度和此化合物的活性，本發(fā)明的化合物的劑量可在大范圍內變動。典型說來，產品在人類臨床上的應用以低劑量水平開始，并逐漸增加劑量水平直到想要的效果達到了。另一選擇是，可接受的體外研究可用于建立受試化合物的有用劑量和用藥程序。典型說來，劑量可在約1ng/kg到約10mg/kg之內，優(yōu)選地在在約10ng/kg到約1mg/kg之內，且更優(yōu)選地在約100ng/kg到約100mg/kg之內。專人醫(yī)師可根據病人的情況選擇確切的藥劑、程序和劑量(見，Fingle等ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(1975))。需要注意的是，由于不恰當的用藥也有導致毒性、器官功能紊亂或者其他相反的效果的可能性，此參與醫(yī)師應該知道如何和什么時候來終止、打斷或者調節(jié)用藥。相反地，此參與醫(yī)師也應知道當臨床反應不足夠時應調整到高劑量水平。處理需關注的系統(tǒng)紊亂的最高用藥量隨被治療者的情況的嚴重性和用藥程序變化。情況的嚴重性可能部分地，舉例來說，用標準的預后評估方法評估。再者，此劑量和多半劑量的頻率，也會隨年齡、體重和此個別的病人的反應而變化，也包括獸醫(yī)用藥。這樣，根據本發(fā)明，進一步提供了一種治療的方法和治療和預防流感病毒感染的藥用組合物。此治療包括給需要此處理的病人施用藥物載體和本發(fā)明的任何組合物的治療有效量，或者其藥用的可接受的鹽。在一優(yōu)選的治療方案中，合適的劑量以吸入劑、鼻噴霧劑或者口服錠劑用于每一個病人。但是可以理解的是，此特殊的劑量水平和用藥水平對于每一個特定的病人來說可能會變化，且依賴于包括此特殊的鹽或其他施用形式的物質的活性、代謝穩(wěn)定性和此化合物的活動長度、年齡、體重、健康程度、性別、飲食、用藥的方式和時間、排泄速率、藥物組成、此特別疾患的嚴重性和寄主正在實施的治療。VI減少、預防或者治療過敏和發(fā)炎反應的方法本發(fā)明也包括減少、預防或者治療生物體過敏和發(fā)炎反應的方法。在一方面，此方法包括用本發(fā)明的藥用的組合物預防或者治療生物體的過敏或者發(fā)炎反應，其包括一個具一個唾液酸酶活性的基于蛋白的化合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的藥用有效劑量到一生物體的上皮細胞。此唾液酸酶活性可從自然發(fā)生的唾液酸酶蛋白上分離的蛋白或者與自然發(fā)生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重組蛋白。一優(yōu)選的藥用組合物包括與粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNO12)基本同源的唾液酸酶。此被治療的生物體可為動物或者人類。在另一方面，此方法包括用本發(fā)明的藥用組合物預防或者治療生物體的過敏或者發(fā)炎反應，其包括具唾液酸催化域的基于蛋白的化合物。在一些優(yōu)選實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的藥用組合物的治療有效劑量到生物體的上皮細胞。此唾液酸酶催化域優(yōu)選地包括與粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNO12)的第274-666個氨基酸基本同源的唾液酸酶催化域。此被治療的生物體可為動物或者人類。此過敏或者發(fā)炎反應可為急性或者慢性疾患，且可包括，作為非限制性例子，哮喘，其它的導致呼吸困難、過敏性鼻炎、濕疹、牛皮蘚、對植物或者動物毒素的過敏反應或者自體免疫疾患。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物可以吸入劑或者鼻噴霧劑的形式傳遞已組織或者治療呼吸道的發(fā)炎，包括但不受限于，哮喘和過敏性鼻炎。含唾液酸酶活性(包括唾液酸酶催化域蛋白和唾液酸酶融合蛋白)的本發(fā)明的化合物也可用作滴眼液、滴耳液、噴霧劑、藥膏、洗劑或用于皮膚的凝膠。在另一方面，此方法包括靜脈內或者局部注射的包括唾液酸酶活性的本發(fā)明治療具有炎性疾病的患者。劑量所屬領域的技術人員顯而易見，體內有用的用藥劑量和用藥的特殊方式會根據年齡、體重、接受治療的病人的類型、施用的特殊的藥用組合物和施用此藥用組合物的特殊用途來決定。有效劑量水平的確定，其為達到想要的結果的需要的藥劑水平，可為所屬領域的技術人員用上述的程序方法完成。在不用人的動物研究中，藥用組合物的施用以一個高的劑量水平開始，隨著劑量降低，直到不再達到想要效果或者相反的副作用減少或者消失。根據想要的藥效、治療指征、用藥程序、純度和此化合物的活性，本發(fā)明的化合物的劑量可在大范圍內變動。典型說來，產品在人類臨床上的應用以低劑量水平開始，并逐漸增加劑量水平直到想要的效果達到了。另一選擇是，可接受的體外研究可用于建立受試化合物的有用劑量和用藥程序。典型說來，劑量可在約1ng/kg到約10mg/kg之內，優(yōu)選地在在約10ng/kg到約1mg/kg之內，且更優(yōu)選地在約100ng/kg到約100mg/kg之內。專人醫(yī)師可根據病人的情況選擇確切的藥劑、程序和劑量(見，Fingle等ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(1975))。需要注意的是，由于不恰當的用藥也有導致毒性、器官功能紊亂或者其他相反的效果的可能性，此參與醫(yī)師應該知道如何和什么時候來終止、打斷或者調節(jié)用藥。相反地，此參與醫(yī)師也應知道當臨床反應不足夠時應調整到高劑量水平。處理需關注的系統(tǒng)紊亂的最高用藥量隨被治療者的情況的嚴重性和用藥程序變化。情況的嚴重性可能部分地，舉例來說，用標準的預后評估方法評估。再者，此劑量和多半劑量的頻率，也會隨年齡、體重和此個別的病人的反應而變化，也包括獸醫(yī)用藥。在一些優(yōu)選的治療方案中，合適的劑量以吸入劑、鼻噴霧劑或者局部應用用于每一個病人。但是可以理解的是，此特殊的劑量水平和用藥水平對于每一個特定的病人來說可能會變化，且依賴于包括此特殊的鹽或其他施用形式的物質的活性、代謝穩(wěn)定性和此化合物的活動長度、年齡、體重、健康程度、性別、飲食、用藥的方式和時間、排泄速率、藥物組成、此特別疾患的嚴重性和寄主正在實施的治療。VI通過重組病毒載體增強基因傳遞的方法本發(fā)明也包括通過重組病毒載體增強基因傳遞的方法。該方法一方面包括給藥包括有唾液酸酶活性的蛋白的本發(fā)明的化合物的有效劑量至至少一個細胞，其在給藥至少一個重組病毒載體之前或者伴隨其。本發(fā)明的組合物可與至少一個重組病毒載體的方式制備在相同的藥劑中或者別的藥劑中。在一些優(yōu)選的實施方案中，此方法包括應用本發(fā)明的化合物的有效的治療劑量和重組病毒載體至一生物體的細胞。此需治療的生物體可為動物或者人類。在一特殊的優(yōu)選實施方案中，重組病毒載體用于為基因治療轉導生物體的上皮靶細胞。例如，重組病毒載體可用于轉導生物體的具囊性纖維性變的氣管上皮細胞。在此情況下，本發(fā)明的化合物可通過使用吸入劑而用藥。包括治療基因的重組病毒可同時地或者單獨地給藥。在一些實施方案中，細胞可用本發(fā)明的化合物和體內或者“體外”(指在轉導后從一生物體的移出的細胞將被移植到一生物體)重組病毒載體處理。此唾液酸酶活性可為一種分離的自然發(fā)生的唾液酸酶蛋白，或者一種與自然發(fā)生的唾液酸酶的至少一部分基本同源的重組蛋白，其包括唾液酸催化域。一優(yōu)選的藥用組合物包括與粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNO12)基本同源的唾液酸酶。本發(fā)明的化合物可在使用此重組病毒的一天前或者兩小時后用到靶細胞上。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物在使用此重組病毒前的四小時到十分鐘前用到靶細胞。給藥可為重組病毒優(yōu)選地為一可用于轉移基因到哺乳動物細胞的重組病毒，例如，優(yōu)選的，人類細胞。舉例來說，重組蛋白可為逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)或者單純皰疹病毒類型1。此重組病毒包括至少一個將轉移到靶細胞的外源基因。此基因優(yōu)選地為治療基因，但是不需要為此情形。舉例來說，此基因可為用于標記細胞或者賦予抗藥性的基因。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括提高基因治療載體的功效的方法。此方法包括用本發(fā)明的具唾液酸酶活性的化合物并且在相同的或者另一藥劑中用重組病毒處理病人。本發(fā)明的具有唾液酸酶活性的此化合物可在使用重組病毒之前、同時或者之后用于病人。在一實施方案中，此唾液酸酶與粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNO12)或其部分基本是同源的。在一優(yōu)選的實施方案中，此唾液酸酶包括此粘性放線菌唾液酸酶的催化域。在另一實施方案中，此重組病毒為AAV。在另一實施方案中，此疾病為囊腫性纖維化。在另一實施方案中，此重組病毒包括此囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子(CFTR)基因。劑量所屬領域的技術人員顯而易見，體內有用的用藥劑量和用藥的特殊方式會根據年齡、體重、接受治療的病人的類型、施用的特殊的藥用組合物和施用此藥用組合物的特殊用途來決定。有效劑量水平的確定，其為達到想要的結果的需要的藥劑水平，可為所屬領域的技術人員用上述的程序方法完成。在不用人的動物研究中，藥用組合物的施用以一個高的劑量水平開始，隨著劑量降低，直到不再達到想要效果或者相反的副作用減少或者消失。根據想要的藥效、治療指征、用藥程序、純度和此化合物的活性，本發(fā)明的化合物的劑量可在大范圍內變動。典型說來，產品在人類臨床上的應用以低劑量水平開始，并逐漸增加劑量水平直到想要的效果達到了。另一選擇是，可接受的體外研究可用于建立受試化合物的有用劑量和用藥程序。典型說來，劑量可在約1ng/kg到約10mg/kg之內，優(yōu)選地在在約10ng/kg到約1mg/kg之內，且更優(yōu)選地在約100ng/kg到約100mg/kg之內。專人醫(yī)師可根據病人的情況選擇確切的藥劑、程序和劑量(見，Fingle等ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(1975))。需要注意的是，由于不恰當的用藥也有導致毒性、器官功能紊亂或者其他相反的效果的可能性，此參與醫(yī)師應該知道如何和什么時候來終止、打斷或者調節(jié)用藥。相反地，此參與醫(yī)師也應知道當臨床反應不足夠時應調整到高劑量水平。處理需關注的系統(tǒng)紊亂的最高用藥量隨被治療者的情況的嚴重性和用藥程序變化。情況的嚴重性可能部分地，舉例來說，用標準的預后評估方法評估。再者，此劑量和多半劑量的頻率，也會隨年齡、體重和此個別的病人的反應而變化，也包括獸醫(yī)用藥。在一些優(yōu)選的治療方案中，合適的劑量以吸入劑、鼻噴霧劑或者局部應用用于每一個病人。但是可以理解的是，此特殊的劑量水平和用藥水平對于每一個特定的病人來說可能會變化，且依賴于包括此特殊的鹽或其他施用形式的物質的活性、代謝穩(wěn)定性和此化合物的活動長度、年齡、體重、健康程度、性別、飲食、用藥的方式和時間、排泄速率、藥物組成、此特別疾患的嚴重性和寄主正在實施的治療。實施例實施例1抑肽酶基因的合成、純化和抑肽酶融合蛋白的檢測介紹流感病毒蛋白血凝素(HA)是主要的流感包膜蛋白，它在病毒感染過程中起重要作用。HA的重要性為它是寄主免疫反應產生的保護性中和抗體的主要作用目標所證實(Hayden，FG(1996)Antiviraldrugresistance(D.D.Richman編)，59-77頁.Chichester，UKJohnWiley&SonsLtd.)?，F已清楚HA在病毒感染過程中具有兩種作用首先，HA負責病毒向唾液酸細胞受體的吸附；第二，HA通過促使病毒包膜和細胞膜的融合而介導病毒進入靶細胞。HA合成過程中其前體蛋白首先被合成，即HA0，它以三聚分子復合物的形式通過高爾基體被轉運到細胞表面，其后被切割，C末端形成HA1(HA0的328殘基)，N末端形成HA2。一般認為切割過程發(fā)生于細胞表面或被釋放的病毒上。HAO被切割為HA1/HA2不是HA結合到唾液酸受體所必需，但卻為病毒感染性所必需(Klenk，HD和Rott，R.(1988)AdvVirRes.34247-281；Kido，H，Niwa，Y，Beppu，Y和Towatari，T，(1996)AdvanEnzymeRegul36325-347；Skehel，JJ和Wiley，DC.(2000)AnnuRevBiochem69531-569)。HA0對寄主蛋白酶的敏感性由HA0分子的外環(huán)上的蛋白裂解位點決定。蛋白裂解位點可能包含一個Arg或Lys殘基(一元切割位點)，或包含數個Lys和/或Arg殘基(多元切割位點)，這些殘基位于R-X-K/R-R基序內。只有流感A病毒亞型H5和H7含帶有多元切割位點的HA蛋白。流感A的其他亞型以及流感B和C病毒含有一元切割位點。含多元切割位點的流感A病毒具有較強的感染力，能引起寄主全身感染，而含有一元HA位點的病毒只能引起哺乳動物的呼吸道感染或鳥類的呼吸道和腸道感染(Klenk，HD和GartenW.1994TrendMicro239-43綜述)。幸運的是迄今為止人類中只出現了少數被攜帶有多元切割位點的高感染力鳥流感病毒A亞型H5和H7感染的病例，這些病例大多發(fā)現于香港。絕大多數流感是由含只能在一元切割位點進行切割的HA蛋白的病毒引起的。含有多元切割位點的流感病毒HA亞型5和7是由費林蛋白酶激活的，費林蛋白酶是類枯草桿菌蛋白內切酶或前蛋白轉換酶家族成員。費林蛋白酶是在細胞內切割病毒的，這一過程普遍存在于許多類型的細胞中，使得這種病毒引起的致命性全身感染能被觀察到(Klenk，HD和GartenW.1994.TrendMicro239-43；Nakayama，K.1997.Biochem327625-635)。其它所有含一元切割位點HA的流感病毒由分泌型胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶激活。流感病毒的激活涉及到的酶包括血纖維蛋白溶酶(LazarowitzSG，GoldbergAR和ChoppinPW.1973.Virology56172-180)，小血纖維蛋白溶酶(MurakamiM，TowatariT，OhuchiM，ShiotaM，AkaoM，OkumuraY，ParryMA和KidoH.(2001)EurJBiochem2682847-2855)，類胰蛋白酶Clara(Kido，ChenY和MurakamiM.(1999)InB.Dunn(編)，Proteasesofinfectiousagents.205-217頁，AcademicPress，NewYork，H.Y)，激肽釋放酶，尿激酶，凝血酶(ScheiblauerH，ReinacherM，TashiroM和RottR.(1992)JInfecDis166783-791)，凝血因子Xa(GotohB，Ogasawara，ToyodaT，InocencioN，HamaguchiM和NagaiY.(1990)EMBOJ94189-4195)，精子頭粒蛋白(GartenW，BoschFX，LinderD，Rott和KlenkHD.(1981)Virology115361-374.)，來自人呼吸灌洗的蛋白酶(Barbey-MprelCL，OeltmannTN，EdwardsKN和WrightPF.(1987)JInfectDis155667-672)，來自金黃色葡萄球菌(TashiroM，CiborowskiP，ReinacherM，PulvererG，KlenkHD和RottR.(1987)Virology157421-430)和銅綠假單胞菌(CallanRJ，HartmannFA，WestSE和HinshawVS.(1997)JVirol717579-7585)的細菌蛋白酶。一般認為流感病毒被寄主絲氨酸蛋白酶的激活發(fā)生于細胞外，在質膜上或病毒從細胞中釋放出以后。抑肽酶又稱特斯樂(Trasylol)或牛胰抑肽酶(BPTI)，是一種含58個氨基酸的多肽。它屬于Kunitz型抑制劑，能夠競爭性地、廣譜性地抑制絲氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶。長期以來抑肽酶被人們用作藥物，如用于治療胰腺炎、各種時期的休克綜合征、纖溶出血和心肌梗死。它也用于心內直視手術，包括體外循環(huán)手術，以減少失血(FritzH和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33479-494)。人體內抑肽酶對人體的安全性已為多年的治療實踐所證實。此外，抑肽酶顯然是它的特異抗體的弱免疫原，此類免疫原迄今還未在人血清中觀察到(FritzH和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33479-494)。抑肽酶作為候選藥物的另一特征是它的超穩(wěn)定性，它可在室溫中保存至少18個月而活性絲毫不下降(FritzH和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33479-494)。為使抑肽酶達到顯著的抑制病毒的效果，在動物試驗中使用了高劑量。例如對小鼠進行6天的腹膜內注射，每天使用280到840毫克劑量(ZhirnovOP，OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1984)JGenVirol65191-196)；進行霧化吸入須使用較低劑量，但每只小鼠每天仍需63-126毫克服用6天(OvcharenkoAV和ZhirnovOP.(1994)AntiviralRes23107-118)。根據從小鼠中得到的數據推斷，人體需要使用非常高劑量的抑肽酶。因此，為在人體中獲得更好的藥效，需顯著提高抑肽酶分子的效價。抑肽酶是通過競爭性抑制位于寄主呼吸上皮細胞表面的絲氨酸蛋白酶發(fā)揮作用的。因此，抑肽酶在接近寄主蛋白酶處具有局部高濃度是決定其競爭優(yōu)勢的關鍵因素。我們利用兩種方法協(xié)同作用以提高抑肽酶在呼吸上皮表面的競爭優(yōu)勢。首先，使抑肽酶形成多價融合蛋白使之親合力(功能型親和力)得到提高，多價融合蛋白由兩個、三個或更多抑肽酶蛋白通過連接子的連接而形成。這種分子能夠以多價形式與膜蛋白酶結合，與抑肽酶單體相比具明顯的反應動力學優(yōu)勢。單體抑肽酶與牛胰蛋白酶結合較緊密，其解離常數(Ki)為6.0×10-14mol/l。然而它的結合力與其它蛋白酶相比是非常低的，如被認為與流感病毒的激活有關的胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶和激肽釋放酶的Ki值為10-8到10-9mol/l(FritzH和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33479-494)。多聚化可使抑肽酶與這些蛋白酶的結合力呈指數性提高。第二，我們將抑肽酶與錨定于呼吸表皮的結構域融合。錨定域使抑肽酶停留于接近寄主膜結合蛋白酶的區(qū)域，使之在在表皮表面保持較高的局部濃度。錨定域也增加了藥物在呼吸表皮的停滯時間。克隆抑肽酶是一單鏈多肽，具有58個氨基酸殘基和3個鏈內二硫鍵(SEQIDNO1)。圖1所示為抑肽酶的氨基酸序列。在利用PCR合成編碼抑肽酶和其融合蛋白的基因時，利用了對密碼子進行優(yōu)化過的重疊寡核苷酸為模板，以利于在大腸桿菌中的表達。將PCR產物克隆到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)。測序后將基因亞克隆到表達載體pQE(Qiagen)中。該載體含有純化標簽Hisx6，便于純化重組蛋白。將該構建體轉化到大腸桿菌中。轉化細胞在加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長中期，利用標準實驗方法使用IPTG誘導。將細胞離心沉淀后在磷酸鹽緩沖液(PBS)中利用超聲波將之裂解。利用鎳柱(Qiagen)純化帶His6純化標簽的酶。制作了以下幾種抑肽酶融合蛋白1.二價和三價抑肽酶。兩個或三個抑肽酶通過柔性連接子連接為以下結構抑肽酶—(GGGGS(SEQIDNO10))n(n＝3，4或5)—抑肽酶；和抑肽酶—(GGGGS(SEQIDNO10))n(n＝3，4或5)—抑肽酶—(GGGGS(SEQIDNO10))n(n＝3，4或5)—抑肽酶連接肽序列的長度可能會決定多價抑肽酶分子的三維柔性，從而影響它的功能性親和力。因此構建了具有多種長度的連接肽的構建體。具有全功能的重組單價抑肽酶已在大腸桿菌中產生(AuerswaldEA，HorleinD，ReinhardtG，SchroderW和SchnabelE.(1988).BiolChemHopper-SeylerVol369，Suppl.，第27-35頁)。因此我們期望大腸桿菌細胞中的多價抑肽酶蛋白能夠正確折疊。除在各種常見的大腸桿菌菌株如BL21、JM83等之中表達外，也在OrigamiTM細胞(Novagen，BadSoden，Germany)中表達了多價抑肽酶蛋白。OrigamiTM細胞系不含硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原酶，因此具有氧化性細胞質。該細胞系已被成功用于表達許多含二硫鍵的蛋白(BessettePH，AslundF，BeckwithJ和GeorgiouG.(1999)ProNatlAcadSciUSA9613703-13708；VenturiM，SeifertC和HunteC.(2001)JMolBiol3151-8.)。2.表皮細胞錨定抑肽酶。將表皮細胞錨定序列與抑肽酶融合。任何與表皮細胞表面具有親和力的肽或多肽序列都可能作為表皮錨定序列。我們已選出三個人類GAG結合序列PF4(aa47-70；SEQIDNO2)，IL-8(aa46-72；SEQIDNO3)，和ATIII(aa118-151；SEQIDNO4)(圖2)。這些序列與硫酸肝素和硫酸乙酰肝素具有納摩爾(nanomolar)級的高親和力(表1)。硫酸肝素/硫酸乙酰肝素普遍存在于呼吸表皮中。在不同構建體中，GAG結合序列通過通用連接肽序列GGGGS與抑肽酶基因的N末端和C末端融合為以下結構(GAG結構域—GGGGS(SEQIDNO10)—抑肽酶)；和(抑肽酶—GGGGS(SEQIDNO10))—GAG結構域)表1對肝素的親和力胰蛋白酶抑制光度測定利用光度測定法檢測抑肽酶和其融合蛋白的胰蛋白酶抑制活性，具體方法如前人所述(FritzH和WundererG.(1983)Arzneim-Forsch33479-494)。簡言之，在該檢測中抑肽酶抑制胰蛋白酶催化的Na-苯甲酰-L-精氨酸-對硝?；桨?BzArgpNA或L-BAPA)(Sigma)的水解，這種物質可在405nm波長下進行光度測定。一個胰蛋白酶單位(UBAPA)相當于每分鐘水解一毫克底物。一個抑制單位(IUBAPA)將兩單位胰蛋白酶活性減少50％在數量上相當于抑制1UBAPA胰蛋白酶。抑肽酶的精確活性用IUBAPA/mg多肽表示。表面等離子共振檢測以人血纖維蛋白溶酶為作用目標，利用表面等離子共振或BIAcore分析(BIAcore，Piscatawa，NJ)技術對含有多種連接肽的雙價和三價抑肽酶與單價抑肽酶進行親和力比較。與此類似，以肝素為作用目標，利用BIAcore技術檢測GAG結合的抑肽酶融合蛋白與肝素的親和力。當使用血纖維蛋白溶酶為作用目標時，按照產品介紹(BIAcore，Piscataway，NJ)將純化的人血纖維蛋白溶酶(Sigma)固定于CM5型芯片上。當使用肝素為作用目標時，按照文獻所述方法(Xiang和MossB.(2003)JVirol772623-2630)將生物素化的白蛋白和白蛋白-肝素(Sigma)捕獲到鏈霉親和素包被的BIAcoreSA芯片上。實施例2建立改進的用于研究流感病毒感染的組織培養(yǎng)模型流感病毒株流感病毒株從ATCC和St.Jude兒童醫(yī)院的庫獲得。所有涉及流感病毒的試驗均遵守生物研究安全等級II的規(guī)定。按照文獻所述方法將病毒注射進九日齡的雞胚尿囊腔以進行擴繁(ZhirnovOP，OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1985)JGenVirol661633-1638)?；驅adin-Darby犬腎細胞系(MDCK)中的病毒株置于加有0.3％牛血清白蛋白和0.5毫克每毫升胰蛋白酶的低限基本培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)。孵育48到72小時后，低速離心對培養(yǎng)基進行澄清，利用超速離心和25％蔗糖緩沖沉淀并純化病毒顆粒。將純化的病毒重懸于50％甘油-0.1MTris緩沖液(pH7.3)，保存于-20℃。空斑分析病毒株的傳染力和滴度測定使用了兩種空斑分析方法，一種為傳統(tǒng)方法，另一種為改進型的(Tobita，K，Sugiura，A，Enomoto，C和Furuyama，M.(1975)MedMicrobiolImmunuol1629-14；ZhirnovOP，OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1982)ArchVirol71177-183)。傳統(tǒng)的空斑分析法通常用作病毒滴度的檢測。它需要在病毒感染單層MDCK細胞后立即加入瓊脂中的外源胰蛋白酶形成重疊層(Tobita，K，Sugiura，A，Enomoto，C和Furuyama，M.(1975)MedMicrobiolImmuol1629-14)。這個方法通過激活所有含未切割HA的病毒顆粒而人為地提高了毒株的傳染力。Zhirnov等設計了一個改進的空斑分析方法，瓊脂重疊層由雙層組成，胰蛋白酶包含于第二層，且該層在感染24小時后加入(ZhirnovOP，OvcharenkoAV和BukrinskayaAG.(1982)ArchVirol71177-183)。感染3天后用10％甲醛溶液固定細胞，移去瓊脂糖層，用蘇木素-伊紅對固定的細胞染色，對空斑計數。改進的空斑分析法能夠對含切割和未切割HA的毒株的感染力進行精確測定。結合傳統(tǒng)的和改進的空斑分析方法的結果，就可區(qū)分含切割和未切割HA的病毒，從而將毒株的感染力與HA切割狀態(tài)聯(lián)系起來。人細胞培養(yǎng)模型1.原代人表皮細胞的短期培養(yǎng)。傳統(tǒng)的流感病毒體外感染大多是在MDCK細胞培養(yǎng)基中加入外源胰蛋白酶。這與實際生理狀況相差甚遠且不適用于本研究，因為胰蛋白酶在體內不是激活流感病毒的蛋白酶。迄今為止，能夠在不加外源蛋白酶的條件下使流感病毒生長的體外組織培養(yǎng)模型只有下列組織細胞的很有限的報道，即腎組織的原代細胞、胚化雞蛋的尿囊腔和羊膜腔的內襯細胞、胎兒氣管環(huán)組織細胞和原代人淋巴組織上皮細胞(EndoY，CarrillKN，IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol702055-2058)。上述報道中，最近所做的利用原代人淋巴組織上皮細胞進行的工作是最接近人體環(huán)境條件的。在該研究中，Endo等(EndoY，CarrillKN，IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol702055-2058)從人淋巴組織的外科手術樣品中分離得到上皮細胞，培養(yǎng)于Transwell小室(Costar，Canbrige，Mass)膠原基質中(Vitrgen100，CeltrixLaboratories，PaloAlto，California)。細胞在加有生長因子和微量元素的50％Ham’SF12和50％Eagles低限基本培養(yǎng)基中繼代。培養(yǎng)的細胞在10到14天內到達融合，主要為單層的，但有不連續(xù)的纖毛化的細胞斑，這些細胞在達到融合后保持有規(guī)律的纖毛活性1-3周。在該體系中，流感病毒A可生長至滴度為106pFU/ml，感染增殖率為0.001(EndoY，CarrillKN，IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol702055-2058)。感染過程中也出現了進行性的致細胞病變效應。這個體系最大的缺點是它需要新鮮人淋巴組織。為解決這個問題，將原代人淋巴組織上皮細胞替換為可商用的(Cambrex)原代人氣道上皮組織細胞，相同條件下后者可以生長。利用原代人氣道上皮組織細胞進行短期培養(yǎng)的體系能夠相對較快地建立，可用作大多數體外感染和抗病毒試驗的一線試驗模型。2.高分化的人氣道上皮組織(WD-HAE)。為最好地模擬體內人體氣道條件，利用了高分化的人氣道上皮組織(WD-HAE)模型。WD-HAE是成層的上皮組織，具有正常人氣道上皮組織分化的所有細胞，包括功能性纖毛化細胞和黏液分泌細胞。因此，在這個模型系統(tǒng)中流感病毒更可能被和生理機能相關的寄主蛋白酶激活。雖然WD-HAE已被廣泛用于研究呼吸道病毒感染，如呼吸道合胞病毒(RSV)(ZhangL，PeeplesME，BoucherRC，CollinsPL和PicklesRJ.(2002)JVirol765654-5666)、麻疹病毒(SinnPL，WilliamsG，VongpunsawadS，CattaneoR和McCrayPB.(2002)JVirol752403-2409)和人鼻病毒，它還未被用于研究流感病毒。已有關于WD-HAE實驗方法的詳細描述(KrunkoskyTM，FischerBM，MartinLD，JonesN，AkleyNJ和AdlerKB.(2000)AmJRespirCellMolBiol22685-692)。簡言之，將商用的原代人支氣管上皮組織細胞(Cambrex)培養(yǎng)于I型鼠尾膠原蛋白薄膜包被的Transwell澄清培養(yǎng)小室(Costar)中。開始的5到7天，用支氣管上皮組織細胞生長培養(yǎng)基(BEGM)(Cambrex)和加有高濃度葡萄糖的DMEM按11比例混合，再加生長因子的混合培養(yǎng)基進行浸沒培養(yǎng)(KrunkoskyTM，FischerBM，MartinLD，JonesN，AkleyNJ和AdlerKB.(2000)AmJRespirCellMolBiol22685-692)。當培養(yǎng)至70％融合時(第5至7天)，移去頂層培養(yǎng)基，使細胞基部表面只暴露于培養(yǎng)基，以此產生氣-液交界層。細胞在氣-液交界層繼續(xù)培養(yǎng)14天，前后共經過21天培養(yǎng)后可供試驗用。分化的上皮細胞可在體外保存數周。上皮組織的形態(tài)和分化程度的研究方法已有常規(guī)組織學的文獻記載(EndoY，CarrollKN，IkizlerMR和WrightPF.(1996)JVirol702055-2058)。簡而言之，用10％緩沖甲醛溶液固定后，用石蠟包被上皮組織細胞，切片，用蘇木素-伊紅染色，對黏液分泌細胞用過碘酸雪夫氏反應(PAS)染色。在上述兩個模型體系中，將0.001至1MOI病毒加入到分化的細胞中以進行流感感染。在接下來的3至7天內檢測上層病毒的滴度和傳染力。使用傳統(tǒng)和改進的斑點分析方法估計流感病毒的繁殖速度和傳染力水平。實施例3體外比較抑肽酶融合蛋白的功能抑肽酶融合蛋白的抗病毒效果1.感染前處理。將各種濃度的抑肽酶融合蛋白加入原代人細胞培養(yǎng)物中，孵育一小時。用新鮮培養(yǎng)基洗滌細胞，立即加0.01至1MOI的流感病毒共孵育。一小時后再次洗滌細胞，培養(yǎng)3至5天。在各個時間點利用兩種斑點分析方法檢測上清病毒的滴度和傳染力。用結晶紫對活細胞染色以估計病毒感染的致細胞病變效應，試驗結束時于570nm波長測量細胞的光吸收以對病變效應進行定量。抑肽酶融合蛋白保護的細胞的百分比以100×{(抑肽酶處理樣品-未處理受感染樣品)/(未感染對照-未處理受感染樣品)}計算。藥物對細胞保護的效價表示為該藥品能夠保護50％細胞(EC50)時的有效濃度。因為HA激活只出現于新釋放的病毒顆粒，第一輪病毒感染將正常出現，病毒的滴度將在感染后頭24小時內升高。然而，從第二輪開始，由于抑肽酶的處理，病毒傳染力將下降，病毒滴度逐漸減少。本實驗得到的結果能夠通過一次預防性治療以效價為指標區(qū)分各種類型的不同的抑肽酶融合蛋白。另一可選方法是，將起始病毒孵育的計時從抑肽酶處理后立即開始改為處理后2-24小時。感染后3-5天，用上文所述方法檢測病毒滴度、傳染力和細胞病變效應。從這類實驗取得的結果能夠通過一次預防性治療以有效時間窗的長度為指標區(qū)分各種抑肽酶融合蛋白。2.感染后處理。對于多次治療處理，首先將0.001-0.1MOI病毒接種到細胞進行感染，之后立即加入各種濃度的抑肽酶融合蛋白，感染開始后48小時內每8小時處理一次。將細胞培養(yǎng)至感染后第7天。對培養(yǎng)基內的病毒滴度和傳染力進行全過程檢測。實驗結束時進行細胞病變效應的評估。對于單次治療處理，首先將0.001-0.1MOI病毒接種到細胞進行感染，感染開始后48小時內于不同時間點加入各種濃度的抑肽酶，但每個細胞樣品在全實驗中只能處理一次。將細胞培養(yǎng)至感染后第7天。對培養(yǎng)基內的病毒滴度和傳染力進行全過程檢測。實驗結束時進行細胞病變效應的評估。從這類實驗取得的結果能夠以效價為指標區(qū)分各種不同類型的抑肽酶融合蛋白。抑肽酶融合蛋白對HA切割的抑制為證明抑肽酶融合蛋白通過抑制流感HA蛋白的切割抑制流感病毒感染，用1MOI的流感病毒感染人原代上皮組織細胞培養(yǎng)物。抑肽酶融合蛋白在病毒接種之前或病毒感染之后立即加入培養(yǎng)物。感染后6.5小時時，將培養(yǎng)物在不含冷蛋氨酸、含100microCi/ml(脈沖)濃度的35S標記的蛋氨酸(Amersham)MEM培養(yǎng)基中孵育1小時。之后用含10倍濃度冷蛋氨酸的MEM培養(yǎng)基洗滌兩次，用MEM繼續(xù)孵育3小時(進行脈沖追蹤)。標記后，將細胞溶解于放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液中，利用抗(用于感染實驗的)病毒株的抗血清沉淀HA(抗病毒血清可從ATCC和疾病控制和預防中心(CenterofDiseaseControlandPrevention)獲得)，用G蛋白瓊脂糖凝膠(Amersham)純化免疫復合物。用SDS-PAGE膠分離樣品后進行放射自顯影。對于未用抑肽酶融合蛋白處理的樣品，預期HA1和HA2數量占優(yōu)勢；對于抑肽酶處理的樣品，預期HA0是主要存在的HA類型。實施例4五個唾液酸酶基因的合成，唾液酸酶蛋白的表達和純化介紹流感病毒屬于RNA病毒正粘病毒科家族。A型和B型病毒均含8段負鏈RNA基因組，它們包被在源于寄主細胞的脂質包膜中。病毒包膜由刺突覆蓋，刺突由三種蛋白組成紅血球凝聚素(HA)，它負責病毒向寄主細胞受體的附著，介導病毒與細胞膜的融合；唾液酸苷酶(NA)，負責新產生的病毒從宿主細胞的釋放；少數作為離子通道的M2蛋白。對流感病毒A而言，其HA和NA均經過了抗原性漂流和抗原性轉移，病毒亞型以HA和NA蛋白的血清學差異區(qū)分。共存在15種HA(H1-H15)和9種NA(N1-N9)，但迄今為止在人流感病毒A中僅發(fā)現三種HA(H1-H3)和兩種NA(N1-N2)蛋白(Granoff，A.&Webster，R.G.，編EncyclopediaofVirology，2ndEdition，Vol2)。與流感病毒A相反，流感病毒B中未發(fā)現不同的抗原亞型。流感病毒B僅在人類中傳播，而流感病毒A可從全部種類的動物寄主中分離到，例如豬、馬、雞、鴨和其它鳥類，這造成了流感病毒A的基因重組，導致了抗原性轉移。野生水禽被認為是一切鳥類和哺乳動物的流感病毒的原始貯存庫。有廣泛證據證明流感病毒在水禽和包括豬和馬在內的其它物種間傳播，以及通過豬向人的間接傳播。從豬或雞向人的直接傳播也有證據(Ito，T.(2000)MicrobiolImmunol44(6)423-430)。細胞表面的唾液酸是流感病毒的寄主細胞受體。唾液酸是含九碳骨架的α酮酸，通常發(fā)現于與糖蛋白和糖脂附著的寡糖鏈的最外位置。唾液酸的主要類型之一是N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)，它是大多數其它類型唾液酸的生物合成前體。在自然界中發(fā)現兩種Neu5Ac與醣側鏈上第二末位半乳糖殘基的連接方式，即Neu5Acα(2，3)-Gal與Neu5Acα(2，6)-Gal。Neu5Acα(2，3)-Gal與Neu5Acα(2，6)-Gal分子均能被流感病毒A識別作為受體(Schauer，R.(1982)Adv.CarbohydrateChem&Biochem40131-235)，但人攜帶的病毒傾向于Neu5Acα(2，6)-Gal分子，鳥類與馬類攜帶的病毒優(yōu)先識別Neu5Acα(2，3)-Gal分子(Ito，T.(2000)MicrobiolImmunol44(6)423-430)。流感病毒A型和B型的感染一般起始于上呼吸道粘膜的表面。病毒復制起初限于上呼吸道，但可擴展到較低位置的呼吸道，導致可致命的支氣管肺炎。死亡幾率為萬分之一，但對高危人群而言則危險性顯著提高，如在大范圍流行時的患心肺疾病者和免疫功能低下者。含唾液酸酶的治療化合物可有效地降解兩種唾液酸，即Neu5Acα(2，6)-Gal和Neu5Acα(2，3)-Gal，從而對機體提供針對動物病毒在內的多種流感病毒的保護。即使在毒株每年都發(fā)生變化的條件下它仍然保持有效。因為唾液酸酶作用于寄主細胞而非病毒，形成病毒生命周期的“堵塞點”，從而使抗性病毒不能繼代。結合蛋白的唾液酸在細胞表面均勻增殖的半衰期為33小時(Kreisel，W，Volk，BA，Buchsel，R和Reutter，W.(1980)ProNatlAcadSciUSA771828-1831)。因此，我們估計一日一次或兩次服用唾液酸酶就可針對流感提供有效保護。唾液酸酶被發(fā)現存在于高等真核生物中，也存在于一些高致病性微生物中，包括病毒、細菌和原生生物。病毒和細菌唾液酸酶的特性已研究得很清楚，一些此類唾液酸酶的三維結構也已確定(Crennell，SJ，Garman，E，Laver，G，Vimr，E和Taylor，G.(1994)Structure2535-544；Janakiraman，MN，White，CL，Laver，WG，Air，GM和Luo，M.(1994)Biochemistry338172-8179；Pshezhetsky，A，Richard，C，Michaud，L，Igdoura，S，Wang，S，Elsliger，M，Qu，J，Leclerc，D，Gravel，R，Dallaire，L和Potier，M.(1997)NatureGenet15316-320)。近些年已克隆了數個人唾液酸酶基因(Milner，CM，Smith，SV，CarrilloMB，Taylor，GL，Hollinshead，M和Campbell，RD.(1997)JBiolChem2724549-4558；Monti，E，Preti，A，Nesti，C，Ballabio，A和BoraniG.1999.Glycobiol91313-1321；Wada，T，Yoshikawa，Y，Tokuyama，S，Kuwabara，M，Akita，H和Miyagi，T.(1999)BiochemBiophyResCommuni26121-27；Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni，M，Manzoni，M，Veneranobo，B，Croci，G，Preti，A，Ballabio，A，Tettamanti，G和Borsani，G.(2000)BichemJ349343-351)。所有已了解的唾液酸酶在其氨基末端位置都有含四個氨基酸的基序，其后為隨蛋白不同重復3-5次的Aspbox基序(Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni，M，manzoni，M，Veneranodo，B，Croci，G，Preti，A，Ballabio，A，Tettamanti，G和Borsani，G.(2000)BichemJ349343-351；Copley，RR，Russell，RB和Ponting，CP，(2001)ProteinSci10285-292)。雖然唾液酸酶超家族全部氨基酸一致性相對較低，只有大約20-30％，但其分子折疊結構非常相似，尤其是負責催化的氨基酸(Wada，T，Yoshikawa，Y，Tokuyama，S，Kuwabara，M，Akita，H和Miyagi，T.(1999)BiochemBiophyResCommuni26121-27；Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni，M，Manzoni，M，Veneranobo，B，Croci，G，Preti，A，Ballabio，A，Tettamanti，G和Borsani，G.(2000)BichemJ349343-351；Copley，RR，Russell，RB和Ponting，CP，(2001)ProteinSci10285-292)。一般將唾液酸酶分為兩個家族“小”唾液酸酶，分子量大約為42kDa，達到最高活性時不需要二價金屬離子；“大”唾液酸酶，分子量大約為65kDa以上，需要有二價金屬離子才具有活性(Wada，T，Yoshikawa，Y，Tokuyama，S，Kuwabara，M，Akita，H和Miyagi，T.(1999)BiochemBiophyResCommuni26121-27；Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni，M，Manzoni，M，Veneranobo，B，Croci，G，Preti，A，Ballabio，A，Tettamanti，G和Borsani，G.(2000)BichemJ349343-351；Copley，RR，Russell，RB和Ponting，CP，(2001)ProteinSci10285-292)。已有超過15種唾液酸酶被純化，它們在底物特異性和酶動力學方面彼此差異很大。為獲得廣譜抗流感病毒特性，唾液酸酶應能夠對α(2，6)-Gal和α(2，3)-Gal交連位置的唾液酸都有效地降解，而且這種作用應能夠在糖蛋白和一些糖脂環(huán)境下進行。來源于流感A病毒(influenzaAvirus)、雞瘟病毒(fowlplaguevirus)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)等的病毒唾液酸酶一般特異降解Neu5Acα(2，3)-Gal，而對Neu5Acα(2，6)-Gal的降解效率很低。小細菌唾液酸酶在糖蛋白和糖脂環(huán)境下與唾液酸的反應強度一般較低。與此相反，大病毒唾液酸酶在大多數天然底物環(huán)境下都能夠高效率地切割唾液酸α(2，6)和α(2，3)連接位置(圖4；Vimr，DR.(1994)TrendsMicrobiol2271-277；Drzeniek，R.(1973)HistochemJ271-290；Roggentin，P，Kleineidam，RG和SchauerR.(1995)BiolChemHoppe-Seyler376569-575；Roggentin，P，Schauer，R，Hoyer，LL和Vimr，ER.(1993)MolMicrob9915-921)。因為大細菌唾液酸酶具有底物廣泛的特性，它們是較好的藥物候選對象。在圖4所示的已知特異底物的大細菌唾液酸酶中，霍亂弧菌(vibriocholerae)唾液酸酶須有Ca2+才具有活性，因此不受推薦。較優(yōu)選的唾液酸酶包括來自產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的71kDa唾液酸酶、粘性放線菌(Actinomycesviscosus)的113kDa唾液酸酶和arthrobacterureafaciens的唾液酸酶?？勺鳛楹蜻x對象的第三種唾液酸酶是來自生綠小單孢菌(Micromonosporaviridifaciens)的68kDa酶，已知它可破壞流感病毒受體(Air，GM和WG.(1995)Virology211278-284)。這些酶具有高特異活性(產氣莢膜梭菌為600U/mg蛋白(Corfield，AP，Veh，RW，Wember，M，Michalski，JC和Schauer，R.(1981)BichemJ197293-299)，粘性放線菌為680U/mg蛋白(Teufel，M，Roggentin，P，andSchauer，R.(1989)BiolChemHopperSeyler370435-443))，不存在二價金屬離子時具完全活性，已被克隆，可從大腸桿菌中以重組蛋白形式純化出來(Roggentin，P，Kleineidam，RG和Schauer，R.(1995)BiolChemHopper-Seyler376569-575，Teufel，M，Roggentin，P，andSchauer，R.(1989)BiolChemHopperSeyler370435-443，Sakurada，K，Ohta，T和Hasegawa，M，(1992)JBacteriol1746896-6903)。另外，產氣莢膜梭菌在溶液狀態(tài)下可于2-8℃穩(wěn)定存在數周，而在白蛋白存在時4℃下可穩(wěn)定存在超過兩年(Wang，FZ，Akula，SM，Pramod，NP，Zeng，L和Chandran，B.(2000)JVirol757517-27)。粘性放線菌在反復凍融條件下不穩(wěn)定，但4℃下于0.1M醋酸鹽緩沖液(pH＝5)中可保持穩(wěn)定(Teufel，M，Roggentin，P，andSchauer，R.(1989)BiolChemHopperSeyler370435-443)。由于細菌唾液酸酶只在上呼吸道局部使用且不被全身吸收，使用這類唾液酸酶引起免疫反應的幾率很低，但為了人體長期使用，更期望找到來自人的唾液酸酶。迄今為止已從人體中克隆了四個唾液酸酶基因NEU1/G9/溶酶體唾液酸酶(Pshezhetsky，A，Richara，C，Michaud，L，Igdoura，S，Wang，S，Elsliger，M，Qu，J，Leclerc，D，Gravel，R，Dallaire，L和Potier，M.(1997)NatureGenet15316-320.，Milner，CM，Smith，SV，CarrilloMB，Taylor，GL，Hollinshead，M和Campbell，RD.(1997).JBioChem2724549-4558)、從人腦分離的膜結合唾液酸酶NEU3(Wada，T，Yoshikawa，Y，Tokuyama，S，Kuwabara，M，Akita，H和Miyagi，T.(1999)BiochemBiophyResCommuni26121-27，Monti，E，Bassi，MT，Papini，N，Riboni，M，Manzoni，M，Veneranobo，B，Croci，G，Preti，A，Ballabio，A，Tettamanti，G和Borsani，G.(2000)BichemJ349343-351)、在人骨骼肌以極低水平表達的42kDa唾液酸酶NEU2(Monti，E，Preti，A，Nesti，C，Ballabio，A和BorsaniG.(1999)Glycobiol91313-1321)和在所有供試人體組織中表達的含497個氨基酸的NEU4蛋白(GenebankMN080741)(Monti，E，Preti，A，Venerando，B和Borsani，G.(2002)NeurochemRes27646-663)。氨基酸序列比對分析顯示NEU2(SEQIDNO8)和NEU4(SEQIDNO9)都是胞漿唾液酸酶。NEU2和NEU4中，形成鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)唾液酸酶催化位點的12個氨基酸殘基中有9個保守(Monti，E，Preti，A，Nesti，C，Ballabio，A和BoraniG.1999.Glycobiol91313-1321，圖3)。另外，NEU4中一大約80個氨基酸殘基的區(qū)段(氨基酸294-373)是所有已知哺乳動物唾液酸酶共有的(Monti，E，Preti，A，Venerando，B和Borsani，G.(2002)NeurochemRes27646-663)。與已選的大細菌唾液酸酶不同，NEU2和NEU4的底物特異性仍是未知的，需要測試NEU2和NEU4能否有效降解流感病毒受體。唾液酸酶檢測NEU2、NEU4和生綠小單孢菌唾液酸酶貯存于PBS、50％甘油和-20℃。產氣莢膜梭菌和粘性放線菌唾液酸酶于4℃下貯存于10mM醋酸鹽緩沖液(pH5)。用HPLC和SDS-PAGE電泳檢測制備的蛋白。酶的特異活性和穩(wěn)定性由唾液酸酶檢測得到。唾液酸酶的活性檢測利用以2’-(4-甲基傘形酮)-α-D-N-乙酰神經氨酸(4Mu-NANA)(Sigma)為底物的熒光測定法。重復兩次反應。在加有400毫克牛血清白蛋白和0.2mM4MU-NANA，終體積為100毫升的0.1M檸檬酸鈉/磷酸鈉緩沖液(pH＝5.6)中進行反應。37℃孵育5-10分鐘后，加1ml0.2M氨基乙酸/NaOH(pH＝10.2)停止反應。利用熒光計在365nm激發(fā)波長和445nm發(fā)射波長下檢測熒光發(fā)射強度，利用4-甲基傘形酮(4-MU)獲得標準曲線。實施例5體外比較唾液酸酶的功能，選擇一種做進一步研究1.流感病毒毒株流感病毒毒株從ATCC和St.Jude兒童醫(yī)院儲藏庫獲得?；驅adin-Darby犬腎細胞系(MDCK)中的病毒株置于加有0.3％牛血清白蛋白和0.5毫克每毫升胰蛋白酶的低限基本培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)。孵育48到72小時后，低速離心對培養(yǎng)基進行澄清，利用超速離心和25％蔗糖墊沉淀并純化病毒顆粒。將純化的病毒重懸于50％甘油-0.1MTris緩沖液(pH7.3)，保存于-20℃。病毒滴度由空斑分析(Tobita，K，Sugiura，A，Enomoto，C和Furuyama，M.(1975)MedMicrobiolImmunuol1629-14)或TCID50(即感染50％MDCK細胞所需的病毒劑量)確定。選擇對Neu5Acα(2，6)-Gal或Neu5Acα(2，3)-Gal具有特異性的人和動物流感A毒株，在其中進一步選擇對受體具有高親和力(具有高血凝活性)的毒株做體外試驗1.識別受體Neu5Acα(2，6)-Gal的毒株包括人分離株A/aichi/2/68，A/Udorn/307/72，A/ProtChaimers/1/73和A/Victoria/3/75等(Connor，RJ，Kawaoka，Y，Webster，RG和PaulsonJC.(1994)Virology20517-23)。2.對Neu5Acα(2，3)-Gal具有特異性的毒株包括動物分離株(A/duckUkraine/1/63，A/duckMemphis/928/74，A/duckhokk/5/77，A/Eq/Miani/1/63，A/Eq/Ur/1/63，A/Eq/Tokyo/71、A/Eq/Prague/71)等(Connor，RJ，Kawaoka，Y，Webster，RG和PaulsonJC.(1994)Virology20517-23)。2.血凝檢測該方法用來快速檢測每種酶破壞受體Neu5Acα(2，6)-Gal和Neu5Acα(2，3)-Gal的效率。具體步驟為，將6ml雞紅細胞(SPAFASInc.，Norwich，CT)用兩倍體積PBS稀釋，于500xg離心5分鐘，用PBS重懸到原體積。將唾液酸酶以各種濃度加到雞紅血球細胞中，室溫下孵育30分鐘。洗滌細胞三次移去唾液酸酶蛋白，用PBS重懸至6ml。對照細胞與BSA孵育并洗滌。將以上所列的可識別Neu5Acα(2，6)-Gal或Neu5Acα(2，3)-Gal作為受體的各種流感病毒株于微板上用PBS(100微升)將原始貯存株連續(xù)稀釋。將唾液酸酶處理的或對照雞紅細胞懸液(100微升的以上制備的0.5％溶液)于4℃加到每孔內。2h后對板進行讀數。使血細胞凝結的最低病毒濃度定為一血凝單位。我們將尋找能夠有效阻止所有病毒株造成的血凝的酶。3.病毒抑制分析用各種濃度的唾液酸酶處理融合的單層MDCK細胞1h，緩沖液洗滌兩次后用各種流感病毒株感染。孵育1小時后再次洗滌以移去游離病毒。為估算細胞表面病毒結合點的減少情況，將細胞覆蓋一層瓊脂后于37℃孵育。將唾液酸酶處理的細胞的空斑數與對照細胞相比。另一可選方法是于37℃常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)的各時間點以TCID50為指標檢測病毒的滴度。為證明唾液酸酶處理可抑制已存在的感染，將MDCK單層細胞先用低滴度病毒感染，洗去游離病毒后，加唾液酸酶后對細胞進行培養(yǎng)。每24h加一次新鮮唾液酸酶。72小時內檢測培養(yǎng)基中的病毒滴度。4.細胞毒性檢測購買原代人支氣管上皮細胞(Clonetics)，按照廠家說明書培養(yǎng)于低限補充培養(yǎng)基。將各種濃度的唾液酸酶加入培養(yǎng)基。7-10天內檢測細胞生長情況，也對細胞顯微病變效應進行定期觀察。實施例6唾液酸酶蛋白的構建和檢測1.選擇一GAG結合序列作為錨定域選取一種在抗病毒活性、毒性、穩(wěn)定性和易于生產等方面都具最好表現的唾液酸酶。利用分子遺傳學方法，我們將之與GAG結合序列相連，將融合基因亞克隆至pQE載體，在大腸桿菌中表達并從中純化融合蛋白。我們選了六個可能的人GAG結合序列PF4(氨基酸47-70)(SEQIDNO2)，IL-8(氨基酸46-72)(SEQIDNO3)，ATIII(氨基酸118-151)(SEQIDNO4)，ApoE(氨基酸132-165)(SEQIDNO5)，雙調蛋白(氨基酸25-45)(SEQIDNO6)和人脈管關聯(lián)遷移細胞蛋白(AAMP)(氨基酸14-25)(SEQIDNO7)(圖2)。這些序列一般與肝素之間存在納摩爾級的親和力，然而，這些親和力彼此之間可能存在數量級的差異(表1)。因為不清楚哪個錨定域能使唾液酸酶獲得最佳功能，所以將所有四種GAG結合序列與唾液酸酶的N末端或C末端通過一通用連接肽序列GGGGS融合為以下結構(GAG結合域—GGGGS(SEQIDNO10)—唾液酸酶)；或(唾液酸酶—GGGGS(SEQIDNO10))—GAG結合域)通過一個改進的病毒抑制分析方法比較不同的融合蛋白。具體步驟為，用等量的每種融合蛋白處理融合單層MDCK細胞，限定一處理時間，如30分鐘。用緩沖液洗滌細胞兩次以移去游離唾液酸酶融合蛋白，培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育一小時后，將流感病毒毒株加入細胞，一小時后再次洗滌細胞移去游離病毒。在72小時的培養(yǎng)過程中，以TCID50為指標對培養(yǎng)基中的病毒滴度進行監(jiān)測。本試驗以未融合唾液酸酶蛋白與融合蛋白進行比較。如果結果太接近以致不能對所有融合蛋白進行分級，則通過縮短融合蛋白處理窗、降低蛋白濃度和提高病毒感染強度等措施提高分析的嚴格性。2.優(yōu)化融合蛋白構建體通過之前的實驗選出最好的融合蛋白后，通過比較不同長度連接肽的優(yōu)劣進一步優(yōu)化構建體。為達到此目的，做了以下構建體(唾液酸酶-(GGGGS(SEQIDNO10))n(n＝0，1，2，3或4)-GAG結合域)將蛋白表達和純化后，用上述的改進的病毒保護分析進行比較。另外，如果前面的數據暗示融合蛋白與硫酸乙酰肝素之間具有較高親和力能夠導致較高效價的話，我們則也計劃檢測提高GAG結合域的親和力是否能進一步提高效價。如下所示，在融合蛋白構建體上產生一個多價GAG結合結構就可達到這個目的(唾液酸酶-(GGGGS(SEQIDNO10))n-HS結合域-GAG結合域)或(GAG結合域-(GGGGS(SEQIDNO10))n-唾液酸酶-(GGGGS(SEQIDNO10))n-GAG結合域)將純化的融合蛋白以上述改進的病毒保護分析結果為基礎而對活性分級。3.細胞毒性檢測為觀察融合蛋白對正常細胞的生長和形態(tài)的影響，將原代人支氣管上皮細胞與各種濃度的融合蛋白共培養(yǎng)，其后實時檢測細胞生長曲線并觀察任何可能的細胞顯微病變效應。實施例7融合蛋白對其它傳染性微生物的抗性融合蛋白含一個功能域和一個錨定域，這也被設計用于其它許多方面的用途。例如，在此介紹的唾液酸酶融合蛋白也可做流感病毒之外的別的病毒和細菌的防治劑，因為許多別的傳染性微生物，如副粘病毒(Wassilewa，L.(1977)ArchVirol54299-305)、冠病毒(Vlasak，R.，Luytjes，W.，Spaan，W和Palese，P.(1988)ProcNatlAcadSciUSA854526-4529)、輪狀病毒(Fukudome，K.，Yoshie，O.和Konno，T.(1989)Viroloy172196-205)和銅綠假單胞菌(Ramphal，R.和Pyle，M.(1983)InfectImmun41339-44)等，也已知是利用唾液酸作為細胞受體的。例如，抑肽酶與肝素結合域融合的蛋白除用于防治流感外，也可用于防治其它需要寄主蛋白酶激活的病毒，如副流感病毒。實施例8唾液酸酶催化域融合蛋白的克隆根據已發(fā)表的關于大細菌唾液酸酶的文獻，來自產尿素節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)的51kDa唾液酸酶、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的71kDa唾液酸酶和粘性放線菌(Actinomycesviscosus)的113kDa唾液酸似乎具有相似的特異活性和對各種唾液酸偶聯(lián)物的廣泛的底物特異性(BiologyoftheSialicAcids(1995)，270-273；Corfield等，Biochem.J.，(1981)197(2)，293-299；Roggentin等，Biol.Chem.HoppeSeyler，(1995)376(9)，569-575；Teufel等，Biol.Chem.HopperSeyler，(1989)370(5)，435-443)。已知的第三種可破壞流感病毒受體的唾液酸酶是來自生綠小單孢菌(Micromonosporaviridifaciens)的68kDa酶(Air和Laver.Virology(1995)211278-284)。粘性放線菌(A.viscosus)是人口腔和胃腸道正常菌群的一部分(Sutter，Rev.Infect.Dis.，(1984)6Suppl1，S62-S66)。因為粘性放線菌的唾液酸酶一般由寄生于人粘膜表面的細菌分泌，人粘膜免疫系統(tǒng)應對它有耐受性。所以，如向人氣道表面局部施加粘性放線菌唾液酸酶，可能將不會產生免疫原性。我們認為粘性放線菌唾液酸酶的這一特征使之成為很好的候選治療藥物。我們確信粘性放線菌唾液酸酶的一個片斷，即從第274到第667氨基酸，應包含其催化域(稱之為AvCD)且本身具有完全活性。之后我們克隆了AvCD片斷，證明該片斷和其它至少包含第290-666氨基酸的粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO12)，如從第274到第681氨基酸、從第274到第666氨基酸、從第290到第666氨基酸和從第290到第681氨基酸，都具有唾液酸酶活性。粘性放線菌唾液酸酶蛋白和基因的全序列從GenBank(A49227和L06898)獲得。在和已知3D結構的唾液酸酶(M.viridifaciens和鼠傷寒沙門氏菌)的做同源性比較的基礎上，我們確定其催化域(CD)序列位于第274和第667氨基酸(SEQIDNO16)之間。為克隆粘性放線菌唾液酸酶催化域(AvCD)，對該區(qū)域粘性放線菌唾液酸酶基因密碼子進行了優(yōu)化改造，以在大腸桿菌中表達(SEQIDNO15)。密碼子已優(yōu)化的編碼粘性放線菌唾液酸酶(SEQIDNo15)的第274至667氨基酸的AvCD核苷酸序列，由重疊寡核苷酸化學合成產生，將其退火、PCR擴增后克隆到表達載體pTrc99a(Amersham，NewJersy，USA)中。使用標準分子克隆方法構建唾液酸酶融合構建體。通過融合六個組氨酸(His6)和AvCD序列N末端殘基構建His6-AR構建體。His6-AvCD構建體核苷酸序列為SEQIDNO17，翻譯的氨基酸序列為SEQIDNO18。這些序列示于圖7。為構建AR-AvCD構建體，將錨定結合域直接融合于AvCD序列的N末端殘基。稱為AR的錨定域源于人雙調蛋白前體的GAG結合序列(GenBank#AAH09799)。人雙調蛋白前體編碼第125至145氨基酸的核苷酸序列(圖2，SEQIDNO7)以兩個重疊寡核苷酸的形式化學合成。AR-AvCD構建體核酸序列為SEQIDNO19，翻譯的氨基酸序列為SEQIDNO20。為構建另一構建體AR-G4S-AvCD，將在AR-AvCD構建體中所用的AR編碼序列與一個已與AvCD序列融合的編碼五個氨基酸的連接肽(GGGGS；SEQIDNO10)融合，這樣將連接肽融合于粘性放線菌唾液酸酶催化域N末端。這個構建體的核苷酸序列(SEQIDNO34)和翻譯的氨基酸序列(SEQIDNO35)示于圖9。將所有構建體克隆到pTrc99a表達載體。另外構建了四個構建體，在其中將粘性放線菌唾液酸酶融合于AR序列(人雙調蛋白GAG結合結構域；SEQIDNO7)N末端。在4號構建體(SEQIDNO27)中，由SEQIDNO12第274至第666氨基酸組成的粘性放線菌唾液酸酶催化域與雙調蛋白GAG結合域(SEQIDNO7)融合。在5號構建體(SEQIDNO29)中，由SEQIDNO12第274至第681氨基酸組成的粘性放線菌唾液酸酶催化域與雙調蛋白GAG結合域(SEQIDNO7)融合。在6號構建體(SEQIDNO31)中，由SEQIDNO12第290至第666氨基酸組成的粘性放線菌唾液酸酶催化域與雙調蛋白GAG結合域(SEQIDNO7)融合。在7號構建體(SEQIDNO33)中，由SEQIDNO12第290至第681氨基酸組成的粘性放線菌唾液酸酶催化域與雙調蛋白GAG結合域(SEQIDNO7)融合。所有這些構建體的唾液酸酶活性在分析中都具有可比性。實施例9生產唾液酸酶催化域融合蛋白為了生產出此唾液酸酶融合蛋白，此表達構建體轉化到大腸桿菌BL21中。接種一個菌落到2.5ml的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。早上將2ml的過夜培養(yǎng)物接種到在一個2升的振蕩瓶中的500ml的TB培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)物于37℃振蕩生長至OD600＝400(需2-4小時)。瓶內加入IPTG直到最終濃度為1mM以誘導蛋白質表達，并持續(xù)振蕩培養(yǎng)3個小時。在5,000×g下離心10分鐘后收集細胞。洗滌細胞一次(重新懸浮在PBS中并再度離心)并且再次懸浮在15ml的Lysis緩沖液中。在蛋白質表達和提純時用到的培養(yǎng)基和緩沖液的組成蛋白質表達的TB培養(yǎng)基溶液1胰化蛋白胨-12g酵母提取物-24g加H2O至800ml溶液2KH2PO4(無水的)-2.3gK2HPO4(無水的)-12.5g加H2O至100ml溶液1和2分別經高壓滅菌，冷卻、混合并加下列物質60ml的20％的甘油(過無菌濾膜)20ml的20％的葡萄糖(過無菌濾膜)Lysis緩沖液50mM的磷酸鹽，pH8.010％的甘油300mMNaCl在Lysis緩沖液中懸浮的細菌細胞用超聲波降解法降解，且通過離心去除細胞碎片。澄清的溶菌液透過SP-瓊脂糖凝膠柱(床體積15ml，流速120cm/小時)。用1體積的PBS調整此柱到較低的pH和鹽量以保證在清除內毒素時保留流感酶。通過用5體積的含1％的TritonX-100、0.5％的脫氧膽酸鈉和0.1％SDS的PBS清洗柱子清除內毒素。此清潔劑用3體積的PBS和3體積的Lysis緩沖液洗凈。用含0.8MNaCl的Lysis緩沖液從柱子中洗提蛋白質。從SP-瓊脂糖凝膠上洗提的部分用1.9M(NH4)2SO4校準(大部分蛋白質污染物在這一步被鹽析出來)并且離心使其變澄清。上清液加到Butyl-瓊脂糖凝膠柱上(流速120cm/小時)。此柱用2體積的1.3M(NH4)2SO4清洗并且用0.65M(NH4)2SO4洗提融合物。最后的一步是，用PBS緩沖液平衡以25cm/小時的流速在SephacrylS-200上進行體積排阻色譜分析。用后面的段落中描述方法對4-MU-NANA的唾液酸酶活性進行測定。蛋白質的濃度用Bio-Rad’sBradford試劑盒測定。蛋白質的純度用SDS-PAGE法測定，估計應為>98％。此酶的特異活性為大約937U/mg。在最后的制品中內毒素用LAL測試法(Cambrex)測定，估計應<0.5EU/ml。為了純化含His6的融合蛋白，用在Ni-NTA上的金屬螯合親和膜色譜取代SP-瓊脂糖膠進行陽離子交換。所有的緩沖液為相同的，除了從Ni-NTA上的洗提是在Lysis緩沖液中用0.25M的咪唑進行。實施例10檢測唾液酸酶以測定唾液酸酶催化域融合蛋白的活性檢測了由構建體#2編碼的AR-AvCD蛋白的唾液酸酶活性，并將其與從產氣莢膜梭菌(SigmaSt.Louis，Mo)和產尿素節(jié)桿菌(Prozyme，SanLeandro，CA)中提純的天然唾液酸酶相比。此外，在一個構建體中雙調蛋白GAG序列(SEQIDNO7)融合到Neu2人唾液酸酶(SEQIDNO8)，我們也檢測了此構建體產生的融合蛋白的唾液酸酶活性。以單位數每毫克唾液酸酶表示的唾液酸酶活性是用人工合成的熒光底物4-MU-NANA(Sigma)檢測唾液酸酶來測量的。一個單位的唾液酸酶被定義為在0.2ml體積中含20nmol的4-MU-NANA在37℃于10分鐘內從4-MU-NANA中釋放的10nmol的MU的酶量(50mMCH3COOH-NaOH緩沖液，pH5.5)。通過加入1ml的0.2M的氨基乙酸/NaOHpH10.2終止反應。用365nm的激發(fā)光和445nm的發(fā)射光在熒光計上測量熒光發(fā)射量，并用4-甲基傘形酮(4-MU)獲得校正曲線(Potier等，Anal.Biochem.，(1979)94(2)，287-296)。表2.唾液酸酶的活性比較(單位/毫克)唾液酸酶特異活性AR-NEU28AR-AvCD937產氣莢膜梭菌333產尿素節(jié)桿菌82我們的結果顯示，AvCD融合蛋白(AR-AvCD)在所有供試的唾液酸酶中具有最高活性(表2)。AR-AvCD的特異活性是人唾液酸酶融合蛋白(AR-NEU2)的100多倍，是產氣莢膜梭菌唾液酸酶兩倍多。比較唾液酸酶穩(wěn)定性的實驗結果顯示AR-AvCD穩(wěn)定性非常高溶液置25℃或4℃20周后未測出活性下降。與此相比，AR-NEU2溶液如儲存于25℃和37℃，半衰期分別為五周和兩周。實施例11唾液酸酶催化域融合蛋白N末端的優(yōu)化特定條件下AR-AvCD融合蛋白N末端會被部分切割，導致純化的AR-AvCD制備物中存在低程度的蛋白異質性。為解決此問題，我們設計了一個方法來優(yōu)化唾液酸酶融合構建體的N末端。構建了含有隨機N末端氨基酸的AR-AvCD庫。利用一對引物PCR擴增AR-AvCD，其中與該基因5’端退火的引物在對應于第2個和第3個氨基酸的位置含隨機序列。引物的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列如下所示。ttttcgtctcccatgvnnvnnaagcgcaaaaaaaaaggcggca(SEDIDNO21)MetXxxXxxLysArgLysLysLysGlyGly(SEDIDNO22)在SEQIDNO21中，“n”代表任意核苷酸(a，c，g或t)，“v”代表核苷酸a，g或c。這樣設計序列(不允許核苷酸t(yī)存在于第一位密碼子)可避免引入中止密碼子、芳香氨基酸(Phe，Tyr，Trp)和Cys。引入了Esp3I限制性核酸內切酶位點(用粗體示)以產生兼容NcoI的末端。與基因的3’端退火的引物在中止密碼子之后帶有HindIII位點。PCR產物用Esp3I-HindIII酶切后連入用NcoI-HindIII酶切后的表達載體pTrc99a。將連接混合物轉化到大腸桿菌后在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中對轉化細胞進行過夜培養(yǎng)。次日用新鮮培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，培養(yǎng)至OD600＝0.8，用IPTG誘導2h。對細胞進行收獲、均質化后用液相色譜兩步法純化融合蛋白。將澄清的裂解物上樣到用裂解緩沖液(50mMHEPES，pH8.0，0.3MNaCl，10％甘油)平衡的SP-Sepharose柱中。用0.45MNaCl洗滌柱子，0.9MNaCl洗脫融合蛋白。用10％甘油稀釋洗出液，使NaCl濃度降為0.2M后，上樣至Heparin-Sepharose柱中。該柱含有線性梯度的NaCl。含唾液酸酶活性的部分在SDS-PAGE上解析，電印記法雜交到PVDF膜上，對43kDa的條帶進行氨基末端測序。分離的唾液酸酶融合蛋白N-末端殘基主要為Val或Gly，其后為AR標簽的N-末端殘基。我們之后合成了新的唾液酸酶融合構建體，構建體#2和#3，通過在此AR序列前引入一個Val使得構建體#2和#3編碼的前6個氨基酸為(Met-Val-Lys-Arg-Lys-Lys(SEQIDNO23))。由這些新的融合構建體產生的蛋白質的N-末端測序表明具有100％的同源性，其初始Met被完全去除(這是作為治療用蛋白質所期望的)并且Val為此AR標簽序列后的第一個N-末端殘基。這些數據與早期的結果一致，其報道了N-末端加工和蛋白質N-末端的氨基酸殘基的功能為穩(wěn)定蛋白質是普遍的規(guī)律的(Hirel等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，(1989)86(21)，8247-8251；VarshavskyProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，(1996)93(22)，12142-12149)。新的融合構建體#2(具優(yōu)化的N-末端的AR-AvCD)(SEQIDNO24)的核苷酸序列和其氨基酸序列的翻譯(SEQIDNO25)在圖10中描述。新的融合構建體#3(具優(yōu)化的N-末端的AR-G4S-AvCD)(SEQIDNO36)的核苷酸序列和其氨基酸序列的翻譯(SEQIDNO37)示于圖11中。用構建體#2感染的大腸桿菌中分離出的被處理蛋白質的氨基酸序列為SEQIDNO38，用構建體#3感染的大腸桿菌中分離出的被處理蛋白質的氨基酸序列為SEQIDNO39。實施例12對比具或者不具錨定域的唾液酸酶構建體的活性為了估計AR序列是否可提高唾液酸酶融合蛋白的細胞表面活性，我們將經構建體#2(SEQIDNO24，示于圖7)或者構建體#1(His6-AvCD；SEQIDNO17，示于圖5)轉化的大腸桿菌中提純的蛋白質與原代人支氣管上皮細胞溫育，并在徹底清洗后測定細胞結合的唾液酸酶活性。與構建體#2蛋白(SEQIDNO25)溫育的細胞具有多達10％的細胞結合唾液酸酶活性，此細胞結合唾液酸酶活性隨著構建體#2蛋白質的處理濃度以一個依賴于劑量的方式增加。然而，構建體#1蛋白質(SEQIDNO18)溫育的細胞僅顯示唾液酸酶活性的背景水平。此外，我們用或者構建體#2或者構建體#1蛋白質處理MDCK細胞并且測定在細胞表面殘余的α(2，6)-連接的唾液酸的水平(圖8)。在每孔低于100mU的酶活性的同等水平下，構建體#2蛋白質比構建體#1蛋白質明顯具更高的潛力。這些結果表示AR域確實提高唾液酸酶的功能。實施例13唾液酸酶融合蛋白的體外活性流感病毒株從ATCC和St.Jude兒童研究醫(yī)院儲藏室獲得流感病毒株。所有的包括流感病毒的試驗在生物安全等級II標準下進行。在培養(yǎng)于加有0.3％的牛血清蛋白和0.5mg/ml的胰島素的低限基本培養(yǎng)基(MEM)中的Madin-Darby犬腎細胞系(MDCK)上繁殖病毒。溫育48到72小時后，培養(yǎng)基經低速離心澄清。病毒微粒經20％的蔗糖墊超速離心沉淀。純化的病毒懸浮在50％的甘油-0.1MTris緩沖液(pH7.3)并在-20℃儲存。細胞保護檢驗為了測定構建體#2AR-AvCD蛋白質的保護細胞不受流感病毒感染的能力，我們首先用從構建體#2生產出的AR-AvCD或從產尿素節(jié)桿菌分離出的廣譜細菌唾液酸酶處理MDCK細胞，并且用多種人流感病毒(IFV)處理細胞，所選流感病毒包括H1、H2及H3亞型的人類IFVA和人類IFVB，也包括鳥IFV毒株。如圖9所示，由構建體#2產生的融合蛋白表現出保護80到100％的細胞的能力，其與產尿素節(jié)桿菌唾液酸酶的效果相似。為了進行檢驗，用10mU的AR-AvCD蛋白質(用構建體#2制成)或者粘性放線菌的分離的唾液酸酶于37℃處理MDCK細胞2小時。之后將這些細胞用流感病毒于MOI0.1處理1小時。洗滌這些細胞并將它們溫育在加有0.2％ITS(GIBCO)和0.6μg/ml乙酰胰島素(Sigma)的新鮮的DMDMF12中。這些細胞用0.5％的結晶紫和20％的甲醇浸染5分鐘并用自來水沖洗。在每個孔的活細胞用70％的乙醇提取結晶紫并在570nm下比色定量。細胞保護用100×{(唾液酸酶處理的樣品-僅病毒)/(未感染的樣品-僅病毒)}測定。IFV抑制檢驗我們用基于細胞的ELISA方法測定AR-AvCD蛋白質(用構建體#2制成)和AR-G4S-AvCD蛋白質(用構建體#3制成)對IFV擴增的抑制(Belshe等，JVirol.，(1988)62(5)，1508-1512)。為了進行試驗，用16mU的用構建體#2制成的AR-AvCD或構建體#3制成的AR-G4S-AvCD唾液酸酶在EDB/BSA緩沖液中(10mM醋酸鈉、150mMNaCl、10mMCaCl2、0.5mMMgCl2和0.5％BSA)于37℃處理96孔板上的MDCK單層細胞2個小時。用0.1MOI的病毒感染所有的用唾液酸酶處理或未處理的對照細胞(僅用EDB/BSA緩沖液處理)。1小時后，用PBS洗滌這些細胞兩次，并將其溫育在加有0.2％ITS(Gibco)和0.6μg/ml乙酰胰島素(Sigma)的DMEM:F12中。感染后40-48小時，用基于細胞的ELISA檢驗法測定細胞結合病毒的水平。具體步驟為，細胞在PBS中用0.05％戊二醛固定，并用50μl稀釋1000倍的抗流感ANP抗血清或者是抗流感B(FitzgeraldInc.)在0.5％BSA和PBS于37℃溫育1小時。洗滌以后，每一個孔用HRP-蛋白G在0.5％的BSA和PBS中溫育1小時。在最后的清洗后，細胞在室溫下與含0.02％的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(Sigma)和0.01％的過氧化氫的50μl的25mM檸檬酸鈉(pH4.5)反應5分鐘。此反應通過加入50μl的1mM的H2SO4終止，并且通過在450nM下測定其光密度定量。病毒復制的抑制百分比以100％×{(僅含病毒樣品-唾液酸酶處理樣品)/(僅含病毒樣品-未感染樣品)}計算。對各種人類流感A和流感B病毒的復制抑制效果數據、細胞保護的EC50值以及有關來自構建體#2的AR-AvCD唾液酸酶融合蛋白、來自構建體#3的AR-G4S-AvCD唾液酸酶融合蛋白的選擇指數示于圖12。如圖10所示，唾液酸酶融合蛋白強烈抑制多種所選的流感病毒的繁殖。值得注意的是，雖然唾液酸酶處理最多移去細胞表面70-80％的唾液酸(圖8)，卻達到了80-100％的病毒抑制(圖10)和細胞保護(圖9)效果。這一發(fā)現證明，利用本發(fā)明推出的唾液酸酶融合蛋白為實現期望的療效并不需要徹底消除細胞表面唾液酸。殘留的20-30％表面唾液酸雖然是唾液酸酶融合蛋白難于結合的，很可能也是流感病毒難于結合的。唾液酸酶融合蛋白的細胞毒性為估測AR-AvCD或AR-G4S-AvCD蛋白(來自構建體#2和#3)的細胞毒性，將低密度的MDCK細胞接種到96孔板上，在含10％FBS和每孔不超過20U的AR-AvCD蛋白或AR-G4S-AvCD蛋白的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天(每種唾液酸酶在實驗全過程內都保持全部活性)。通過每天對細胞進行結晶紫染色和在570nM測光吸收確定AR-AvCD或AR-G4S-AvCD處理孔和對照孔中的細胞密度。培養(yǎng)過程中未觀察到細胞抑制現象的存在，甚至在AR-AvCD或AR-G4S-AvCD(100U/ml)濃度最高的情況下也未發(fā)現。所以，AR-AvCD或AR-G4S-AvCD的IC50，即抑制細胞50％生長的藥物濃度，應高于100U/ml。實施例14唾液酸酶催化域融合蛋白的體內活性雪貂可感染未被人適應的流感病毒并產生和人類相似的病癥，并可用抗病毒化合物治療，例如扎那米偉(樂感清)。(Mendel等，AntimicrobAgentsChemother，(1998)42(3)，640-646；Smith和Sweet，Rev.Infect.Dis.，(1988)10(1)，56-75；Reuman等，J.Virol.Methods，(1989)24(1-2)，27-34)。為了估計我們的化合物的體內效果，我們以雪貂為模式動物測試了AR-AvCD蛋白(由構建體#2構成)。具體步驟如下研究中共使用經測試血清中不含抗紅血球凝聚素抗體的24只幼年雌雪貂(0.5-0.8kg)(MarshallFarms，NorhtRose，NY)。實驗前將兩只動物放在一只籠子中適應3天。這些動物隨機地分為三組8只用藥物稀釋緩沖液和病毒處理，12只用病毒和AR-AvCD處理，而4只僅用用AR-AvCD處理。研究中應用的是含5000U/ml唾液酸酶活性和0.7mg/ml的蛋白質濃度的溶在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的AR-AvCD。在藥物治療組中的動物每一劑藥用量為1mlAR-AvCD，相當于約1mg/kg的劑量水平。麻醉雪貂，并用AR-AvCD或者PBS進行兩次(上午8點和下午6點)鼻內接種(每個鼻孔0.5ml)，并且每天進行共計7天(在病毒處理前2天和病毒接種后5天)。觀察這些雪貂在用藥后的不耐受表現。在第三天的上午10-11點接種病毒。用人類A/Bayern/7/95(H1N1)-相似病毒以105TCID50(≥104雪貂ID50)的劑量完成病毒處理。在用AR-AvCD處理后的第2天開始收集所有的動物的鼻部洗出物并持續(xù)到第7天。為了收集鼻部洗出物，鼻內加入1ml的消過毒的PBS，收集打出的噴嚏并且記錄其體積。此鼻洗出物被離心。重新懸浮成團的細胞并在顯微鏡下用血球計計數。收集懸浮液，整分成部分并儲藏在-80℃。根據制造商的說明書(Bio-Rad，Hercules，CA)用Bio-Rad蛋白質試劑測定在無細胞的鼻部洗出液中的蛋白質的濃度。為了獲得鼻部洗出液的病毒滴度，接種的MDCK細胞在CO2培養(yǎng)箱中于36℃溫育三天。檢查單層的細胞病理效應(CPE)并且用具豚鼠紅細胞的標準血球計測試每個孔的細胞培養(yǎng)懸浮液中的被分成小份的病毒。用SpearmanKarber方法(1996)測定病毒滴度量。在鼻內施加AR-AvCD的未受感染的動物中(n＝4)，未觀察到鼻部洗出液的發(fā)炎細胞數目和蛋白質濃度明顯變化(圖15A和B)。收集7天這些動物的鼻部洗出液并且其全部無病毒散發(fā)。在此研究中的用該藥物劑量的這些動物中，沒有發(fā)現藥物相關毒性的表現。在空白處理的組中，病毒在所有的8只雪貂的鼻上皮細胞上繁殖。在感染后的第一或者第二天病毒達到4.4到5.9log10TCID50(指滴定峰值為4.9)，隨著時間減少并在第五天前變?yōu)殛幮缘?圖13)。與此形成對比的是，在感染后第一天(圖13)12只AR-AvCD處理的雪貂中只有3只病毒排放為陽性，并且它們的鼻病毒滴度比那些對照處理的動物的低約100倍(平均值2.4±0.3對比4.4±0.4log10TCID50)(圖13)。在第一天后，對AR-AyCD處理的反應充分地變化。三只動物完全受保護不受感染，無疾病癥狀和發(fā)炎反應(圖13，雪貂標簽#803、805、806)。此保護效應也因在攻擊感染后第14天無血清轉化而被確認。一只雪貂(標簽號780)在感染后的前三天不排毒，但它在感染后的第四天因一不相關的傷害死了。剩余的8只雪貂排毒隨著感染的過程而變化，從雪貂#812排毒僅一天到#791排毒五天。排毒至少一天的雪貂的感染被確認，因在感染后的抗HA抗體滴定量(血清轉化)有16倍的升高。AR-AvCD處理對攻毒后的血清中的抗HA滴度沒有明顯影響(320-1280對160-1280，分別為對照和藥物處理組)。雖然用AR-AvCD處理(n＝8)的雪貂有排毒現象，但其發(fā)炎發(fā)應減少，并且與未處理雪貂表現為總是嗜睡和發(fā)燒相比，它們表現為更為機警和活躍。對受感染的、用AR-AvCD處理了的8只雪貂組而言，計算出的鼻內蛋白質濃度平均的AUC(曲線下方的面積)值與那些用媒介物處理相比減少了大約40％(2.68對比4.48，任意單位)(圖11B)。在空白對照處理的感染動物中，攻毒感染后第二天鼻部洗出液中的發(fā)炎細胞的數量比那些未感染的動物的藥高約100倍。在另外的4天一直維持在此水平。AR-AvCD處理的動物的鼻部洗出液中的發(fā)炎細胞的數量表現出明顯的下降。特別地，與對照處理的受感染的動物相比，在AR-AvCD處理的動物中細胞計數的AUC值減少了大約3倍(1965對比674，任意單位，圖11A)。觀察到的發(fā)炎反應的減少意味著在感染的早期阻止病毒很重要。實施例15.唾液酸酶融合蛋白抑制細菌細胞的吸附細菌肺炎鏈球菌不同血清型的10個包裝好的菌株選自保存在ATCC的臨床分離株。細菌保存在冷庫并且轉移到含3％綿羊血的胰蛋白酶的大豆瓊脂板上(Difco&MicropureMedicalInc.)在5％CO2中于37℃中溫育18小時。為用放射性同位素標記肺炎雙球菌，從1到2天的培養(yǎng)板上取一個菌株，加到賴氨酸缺乏的每毫升含70μCi[3H]的胰蛋白酶大豆肉湯中，并于37℃溫育在5％的CO2中?？刂泼恳慌囵B(yǎng)物于595nm的吸收光下生長。在對數階段，收集細菌，離心洗滌兩次(3分鐘13,000rpm)，并且重新懸浮于加有0.1％BSA的L-15培養(yǎng)基(無酚紅)中(Cundell和Tuomanen，Microb.Pathog.，(1994)17(6)，361-374)(Barthelson等，Infect.Immun.，(1998)66(4)，1439-1444)。流感嗜血桿菌從儲存在ATCC的臨床分離株中獲得了5個b型(Hib)菌株和10個不標準的菌株(NTHi)。所有的菌株都在包含血晶素(ICN)和NAD(Sigma)的腦心湯(BHI，Difco)中庫存，并保持在冰凍狀態(tài)直到其運用。接著它們在具血晶素和NAD的BHI瓊脂中培養(yǎng)，并于37℃在5％的CO2中溫育14小時。(Kavakami等，Microbiol.Immunol.，(1998)42(10)，697-702)。為用[3H]標記細菌，流感嗜血菌細胞在含血晶素、NAD和每毫升250μCi[3H]的亮氨酸的BHI肉湯中溫育，并且一直生長直到晚對數期，然后收獲、洗滌并重新懸浮在L-15-BSA中(Barthelson等，Infect.Immun.，(1998)66(4)，1439-1444)。細胞吸附分析在洗滌后，所有的[3H]標記細菌懸浮在L-15-BSA中，通過用Petroff-Hausser計數板肉眼計數測定細菌的濃度，用閃爍計數法測定放射活性，并且計算[3H]標記的細胞的特殊活性。用帶有7cpm/1000細胞或者更多的細菌制品。細菌稀釋到5×108個細胞/每毫升。BEAS-2B細胞單層在含5×107個細菌的[3H]-標記的細菌懸浮液中于37℃中在5％的CO2中溫育。30分鐘后，用L-15-BSA沖洗5遍洗去未結合的細菌。吸附到WD-HAE組織樣品的細菌用閃爍計數法計數。唾液酸酶融合蛋白對BEAS-2B細胞的脫唾液酸化作用(desialylation)和肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌對細胞吸附的影響。BEAS-2B細胞在1-50mU的AR-AvCD中溫育2小時。用上面所述的肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌毒株完成細胞吸附檢驗分析。用mock處理的細胞作為陽性對照。AR-AvCD的功效用EC50的量來表示，即達到50％抑制細菌粘附效果的酶量。實施例16用唾液酸酶融合蛋白提高AAV載體的轉導效率體外試驗以與出版的方法步驟相似的方法進行了證實AR-AvCD的效果的實驗(Bals等，JViroo.，(1999)73(7)，6085-6088)。完全分化的氣管上皮(WDAE)細胞單層在遷移孔上繼續(xù)生長(Karp等，MethodsMol.Biol.，(2002)188，115-137；Wang等，JVirol.，(1998)72(12)，9818-9826)。為了去除細胞表面的唾液酸，培養(yǎng)基換成無血清的溶有0.5-10單位的AR-AvCD的培養(yǎng)基。處理細胞30分鐘到6小時。清洗此細胞單層，用AAV轉導，并用標準的程序估計轉導效率。許多遷移孔僅用培養(yǎng)基(無AR-AcVD)處理以用作對照(基礎轉導效率)。其他的對照可能包括僅用AR-AvCD處理的轉移孔以估計脫唾液酸酶化作用的細胞毒素效果。使用報告子病毒以便容易檢測轉導細胞。報告子AAV及對其使用的例子包括AAV-CMV-eGFP、AAV2LacZ(Bals等，JVirol.，(1999)73(7)，6085-6088；Wang等，Hum.GeneTher.，(2004)15(4)，405-413)和堿性磷酸酯酶(Halbert等，Nat.Biotechnol.，(2002)20(7)，697-701)，在許多文獻中已有描述。用光學顯微鏡觀察固定的并用合適的底物處理的細胞(如果用了含病毒的lacZ或AP)或者熒光顯微鏡觀察活細胞(如果用了GFP)估計其效果。根據在NexBio用NHBE原代上皮細胞(Cambrex，Walkersville，MD)做的試驗，當每一轉移孔內用10個單位的AR-AvCD時，不到1小時就達到去除最大數量的唾液酸的效果。在用很少的AR-AvCD時(1小時0.1U)，其他的用到的細胞系(例如MDCK)就被去唾液酸酶化。因此我們估計用10U的AR-AvCD的處理WDAE兩個小時足以去除能夠去除的唾液酸并且用AAV可以顯著地提高WDAE細胞的轉導效率。在模式動物中測試AR-AvCD處理對AAV轉導的效果為了驗證AR-AvCD處理在模式動物上的效果，進行了與前面描述的實驗相似的一個實驗(Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，(1993)90(22)，10613-10617；Halbert等，Nat.Biotechnol.，(2002)20(7)，697-701)。在用AAV之前的幾個小時(1-6)，根據以前出版的方法，通過鼻內吸入霧狀的或者凍干的AR-AvCD粉末將AR-AvCD傳遞到小鼠肺部(Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，(1993)90(22)，10613-10617)。通過鼻內吸入將攜帶報告基因的AAV(堿性磷酸酯酶)傳遞，4周后將小鼠無痛處死并且如以前所描述的那樣在固定的肺中檢測受轉導的細胞(Halbert等，JVirol.，(1998)72(12)，9795-9805)。實施例17唾液酸酶處理抑制氣管肥大細胞的功能和平滑肌收縮用前面所述的實驗方法(Cocchiara等，JNeuroimmunol.，(1997)75(1-2)，9-18)，能證實用本發(fā)明的化合物處理防止肥大細胞的磷物質(SP)導致的組胺釋放。用另一組試驗(Stenton等，JPharmacol.Exp.Ther.，(2002)302(2)，466-474)，用本發(fā)明的化合物可以抑制由兩個PAR-激活肽促進的肥大細胞的β-氨基己糖苷酶的釋放(PAR代表蛋白酶激活的受體)。本發(fā)明的化合物可在豚鼠氣管內用藥并且此氣管的反應可在前面所述的動物中估計出來(Jarreau等，Am.Rev.Respir.Dis.，(1992)145(4Pt1)，906-910；Stenton等，JPharmacol.Exp.Ther.，(2002)302(2)，466-474)。根據對多種誘導物的反應判斷，唾液酸酶處理不會導致非特異的氣道過敏反應。此外，唾液酸酶處理不會導致磷物質(SP)誘導的支氣管收縮。類似地，本發(fā)明的化合物可用于處理分離的豚鼠和老鼠的氣管及肺(Kai等，Eur.J.Pharmacol.，(1992)220(2-3)，181-185；Stenton等，JPharmacol.Exp.Ther.，(2002)302(2)，466-474)。同樣重組的唾液酸酶處理也對由乙酰膽堿、組胺和5-羥色胺導致的平滑肌收縮沒有影響。此外，它還抑制由抗原(卵白蛋白)或者48/80復合物導致的氣管收縮。參考文獻Achyuthan，KeandAchyuthanAM.2001.Comparativeenzymology，biochemistryandpathophysiologyofhumanexo-a-sialidase(neuraminidases).ComparativeBiochem&PhysiolpartB12929-64.AirGMandLaver，WG.1995.RedcellsboundtoinfluenzavirusN9neuraminidasearenotreleasedbytheN9neuraminidaseactivity.Virology211278-284.AuerswaldEA，HorleinD，ReinhardtG，SchroderWandSchnabelE.1998.Expression，isolationandcharacterizationofrecombinant[arg15，Glu52]Aprotinin.BioChemHoppe-SeylerVol369，Suppl.，pp27-35.Barbey-MorelCL，OeltmannTN，EdwardsKMandWrightPF.1987.RoleofrespiratorytractproteaseininfectivityofinfluenzaAvirus.JInfectDis155667-672.BessettePH，AslundF，BechwithJandHinshawVS.1997.CleavageofinfluenzaAvirusH1hemagglutinibyswinerespiratorybacterialproteases.JVirol717579-7585.Connor，RJ，KawaokaY，Webster，RGandPaulsonJC.1994.Receptorspecificityinhuman，avian，andequinH2andH3influenzavirusisolates.Virology20517-23.Copley，RR，Russell，RBandPonting.2001.Sialidase-likeAsp-boxessequence-similarstructureswithindifferentproteinfolds.ProtSci10285-292.Corfield，AP，Veh，RW，Wember，M，Michalski，JCandSchauer，R.1981.ThereleaseofN-acetyl-andN-glycolloyl-neuaminicacidfromsolublecomplexcarbonhydratesanderthrocytesbybacterial，viralandmammaliansialidases.BichemJ197293-299.Crennell，SJ，Carman，E，Laver，G，Vimr，EandTaylor，G，.1994.CrystalstructureofVibrioCholeraeneuraminidasereveaslduallectin-likedomainsinadditiontothecatalyticdomain.Structure2535-544.Drzeniek，R.Substratespecificityofneuraminidases.1973.HistochemJ5271-290.EndoY，CarrollKN，IkizlerMRandWrightPF.1996.Growthofinfluenzavirusinprimary，differentiatedepithelialcellsderivedfromadenoids.JVirol702005-2058.FritzHandWundererG.1983.Biochemistryandapplicationsofaprotinin，thekallikreininhibitorfrombovineorgans.Arzeim-Forsch33479-494.Fukudome，K.，Yoshie，O.andKonno，T.1989.Comparisonofhuman，simian，andbovinrotavirusesforrequirementofsialicacidinhemagglutinationandcelladsorptionVirology172196-205.GartenW，BoschFX，LinderD，RottRandKlenkHD.1981.Proteolyticactivationoftheinfluenzavirushemagglutininthestructureofthecleavagesiteandemzymesinvolvedincleavage.Virology115361-374.Goger，B，Halden，Y，Rek，A，Mosl，R，Pye，D，Gallagher，JandKungl，AJ.2002.Differentaffinitiesofglyosaminoglycanoligosaccharidesformonomericanddimericinterleukin-8amodelforchemokineregulationatinflammatorysite.Bichem411640-1646.GothohB，OgasawaraT，ToyodaT，InocencioN，HamaguchiMandNagaiY.1990.AnendoproteasehomologoustothebloodclottingfactorXasadeterminantofviraltropisminchickembryo.EMBOJ94189-4195.Granoff，A.&Webster，R.G.，ed.EncyclopediaofVirology，2ndedition，Vol2.Gust，ID，Hampson，AW.Andlavanchy，D.2001.Planningforthenextpandemic.RevMedVirol1159-70.Hayden，FG.1996.Amantadineandrimantadine-mechanisms.InAntiviraldrugresistance(ed，D.D.Rhichman)，pp.59-77.Chichester，UKJohnWiley&SonsLtd.HosoyaM，MarsuyamaS，BabaM，SusukiHandShigetaS.1992.Effectsofproteaseinhibitorsonreplicationofvariousmyxovirues.AntimicrobialAgentsandChemotherapy361432-1436.Ito，T.2000.Interspeciestransmissionandreceptorrecognitionofinfluenzaavirus.MicrobiolImmunol44(6)423-430.Janakiraman，MN，White，CL，Laver，WG，Air，GMandLuo，M.1994.StructureofinfluenzavirusneuraminidaseB/lee/40complexedwithsialicacidandadehydroanalogat1.8-Aresolutionimplicationforthecatalyticmechanism.Biochemistry338172-8179.Kido，H，Niwa，Y，Beppu，YandTowatari，T.1996.Cellularproteaseinvolvedinthepatheogenicityofenvelopedanimalviruses，humanimmunodeficiencyvirus，influenzavirusAandsendaivirus.AdvanEnzymeRegul36325-347.KidoH，ChenYandMurakamiM.1999.Celularproteinaseandviralinfectioninfluenzavirus，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唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO12)的第681氨基酸殘基結束。14.一種核酸分子，其包括編碼權利要求13所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。15.如權利要求14所述的核酸分子，其在表達載體中。16.如權利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO12)的第290氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO12)的第666氨基酸殘基結束。17.一種核酸分子，其包括編碼權利要求16所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。18.如權利要求17所述的核酸分子，其在表達載體中。19.如權利要求7所述的唾液酸酶催化域蛋白，其中所述的唾液酸酶催化域蛋白包括一氨基酸序列，其從所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO12)的第290氨基酸開始到所述粘性放線菌唾液酸酶蛋白序列(SEQIDNO12)的第681氨基酸殘基結束。20.一種核酸分子，其包括編碼權利要求19所述的唾液酸酶催化域蛋白的核苷酸序列。21.如權利要求20所述的核酸分子，其在表達載體中。22.一種融合蛋白，其包括至少一個唾液酸酶的催化域；和純化域、蛋白質標簽、蛋白質穩(wěn)定域、溶解度域、蛋白質大小增加域、蛋白質折疊域、蛋白質定位域、錨定域、N-末端結構域、C-末端結構域、催化活性域、結合域或催化活性增強域。23.如權利要求22所述的融合蛋白，其還包括至少一個肽連接子。24.如權利要求22所述的融合蛋白，其中所述的催化域是與產氣莢膜梭菌唾液酸酶的催化域基本同源的，與粘性放線菌唾液酸酶基本同源的、與產尿素節(jié)桿菌唾液酸酶基本同源的、與生綠小單孢菌唾液酸酶基本同源的、與人Neu2唾液酸酶基本同源的或者與人Neu4唾液酸酶基本同源的。25.如權利要求24所述的融合蛋白，其中所述的催化域是與粘性放線菌唾液酸酶的催化域基本同源的。26.如權利要求25所述的融合蛋白，其中所述的催化域包括SEQIDNO16。27.如權利要求26所述的融合蛋白，其包括至少一個蛋白質純化域。28.如權利要求27所述的融合蛋白，其中所述的至少一個蛋白質純化域為組氨酸標簽、鈣調蛋白結合域、麥芽糖結合蛋白質結構域、鏈霉親和素結構域、鏈霉親和素結合域、內含肽結構域或者幾丁質結合域。29.如權利要求28所述的融合蛋白，其中所述的蛋白質純化域為組氨酸標簽。30.如權利要求29所述的融合蛋白，其中所述的融合蛋白包括SEQIDNO18。31.一種核酸分子，其編碼權利要求30所述的融合蛋白。32.如權利要求31所述的核酸分子，其在表達載體中。33.如權利要求31所述的核酸分子，其包括SEQIDNO17。34.如權利要求33所述的核酸分子，其在表達載體中。35.如權利要求25所述的融合蛋白，其包括至少一個錨定域。36.如權利要求35所述的融合蛋白，其中所述的錨定域為GAG結合域。37.如權利要求36所述的融合蛋白，其中所述的錨定域是與人血小板因子4(SEQIDNO2)的GAG結合域基本同源的，與人白細胞介素8(SEQIDNO3)的GAG結合域基本同源的，與人抗凝血酶III(SEQIDNO4)的GAG結合域基本同源的，與人載脂蛋白E(SEQIDNO5)的GAG結合域基本同源的，與人脈管關聯(lián)遷移蛋白(SEQIDNO6)的GAG結合域基本同源的，或與人雙調蛋白(SEQIDNO7)的GAG結合域基本同源的。38.如權利要求37所述的融合蛋白，其中所述的錨定域是與人雙調蛋白(SEQIDNO7)的GAG結合域基本同源的。39.如權利要求38所述的融合蛋白，其中所述的錨定域包括人雙調蛋白(SEQIDNO7)的GAG結合域。40.如權利要求39所述的融合蛋白，其中所述的唾液酸酶的催化域包括SEQIDNO16。41.如權利要求40所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO20。42.一種核酸分子，其編碼權利要求41所述的融合蛋白。43.如權利要求42所述的核酸分子，其在表達載體中。44.如權利要求42所述的核酸分子，其包括SEQIDNO19。45.如權利要求44所述的核酸分子，其在表達載體中。46.如權利要求40所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO25。47.一種核酸分子，其編碼權利要求46所述的融合蛋白。48.如權利要求47所述核酸分子，其在表達載體中。49.如權利要求47所述的核酸分子，其包括SEQIDNO24。50.如權利要求49所述的核酸分子，其在表達載體中。51.如權利要求40所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO38。52.如權利要求40所述的融合蛋白，其還包括連接所述人雙調蛋白GAG結合域到所述唾液酸酶的催化域的肽連接子。53.如權利要求52所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO35。54.一種核酸分子，其編碼權利要求53所述的融合蛋白。55.如權利要求54所述的核酸分子，其包括SEQIDNO34。56.一種表達載體，其包括權利要求55所述的核酸分子。57.如權利要求52所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO37。58.一種核酸分子，其編碼權利要求57所述的融合蛋白。59.如權利要求58所述的核酸分子，其包括SEQIDNO36。60.一種表達載體，其包括權利要求59所述的核酸分子。61.如權利要求52所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO39。62.如權利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO27。63.一種核酸分子，其編碼權利要求62所述的融合蛋白。64.一種表達載體，其包括權利要求63所述的核酸分子。65.如權利要求63所述的核酸分子，其包括SEQIDNO26。66.一種表達載體，其包括權利要求65所述的核酸分子。67.如權利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO29。68.一種核酸分子，其編碼權利要求67所述的融合蛋白。69.一種表達載體，其包括權利要求68所述的核酸分子。70.如權利要求68所述的核酸分子，其包括SEQIDNO28。71.一種表達載體，其包括權利要求70所述的核酸分子。72.如權利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO31。73.一種核酸分子，其編碼權利要求72所述的融合蛋白。74.一種表達載體，其包括權利要求73所述的核酸分子。75.如權利要求73所述的核酸分子，其包括SEQIDNO30。77.一種表達載體，其包括權利要求75所述的核酸分子。78.如權利要求39所述的融合蛋白，其包括SEQIDNO33。79.一種核酸分子，其編碼權利要求78所述的融合蛋白。80.一種表達載體，其包括權利要求79所述的核酸分子。81.如權利要求79所述的核酸分子，其包括SEQIDNO32。82.一種表達載體，其包括權利要求81所述的核酸分子。83.一種藥物制劑，其包括唾液酸酶。84.如權利要求83所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶是與產氣莢膜梭菌唾液酸酶至少一部分基本同源的，與粘性放線菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與產尿素節(jié)桿菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與生綠小單孢菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與人Neu2唾液酸酶的至少一部分基本同源的，與人Neu4唾液酸酶的至少一部分基本同源的。85.如權利要求84所述的藥物制劑，其中所述唾液酸酶是與粘性放線菌唾液酸酶的至少一部分基本同源的。86.如權利要求85所述的藥物制劑，其中所述的唾液酸酶包括SEQIDNO12.87.一種藥物制劑，其包括權利要求1所述的組分。88.一種藥物制劑，其包括權利要求7所述的組分。89.一種藥物制劑，其包括權利要求22所述的組分。90.一種藥物制劑，其包括權利要求26所述的組分。91.一種藥物制劑，其包括權利要求46所述的組分。92.一種藥物制劑，其包括權利要求62所述的組分。93.如權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的藥物制劑，其配制成噴霧劑。94.如權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的藥物制劑，其配制成吸入劑。95.如權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的藥物制劑，其配制成注射用溶液。96.如權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的藥物制劑，其配制成滴眼液。97.如權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的藥物制劑，其配制成霜、藥膏、凝膠或軟膏。98.如權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的藥物制劑，其配制成可口服給藥的藥丸、藥片、錠劑、懸浮液或溶液。99.一種治療或者預防由流感、副流感病毒或者呼吸道合胞病毒引起的病毒感染的方法，其包括將權利要求83、85、87、88、89、90、91或92中任一項所述的組合物的治療有效量應用于受治療者的上皮細胞。100.如權利要求99所述的方法，其中所述的應用是通過用鼻噴霧劑。如權利要求99所述的方法，其中所述的應用是通過用吸入劑。如權利要求99所述的方法，其中所述的應用是以一天一到四次。一種治療或者預防細菌病原體感染的方法，其包括將權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的組合物的治療有效量給藥于受治療者。如權利要求103所述的方法，其中所述的病原體為肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌或幽門螺桿菌。如權利要求103所述的方法，其中所述的給藥是通過用鼻噴霧劑。如權利要求103所述的方法，其中所述的給藥是通過用吸入劑。如權利要求103所述的方法，其中所述的給藥是通過用局部給藥。如權利要求103所述的方法，其中所述的給藥是通過用口服給藥。如權利要求103所述的方法，其中所述的給藥是以一天一到四次。110.一種治療和預防過敏或發(fā)炎的方法，其包括用權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述的組合物的治療有效量向受治療者給藥。111.如權利要求110所述的方法，其中所述的發(fā)炎與哮喘、過敏性鼻炎、濕疹、牛皮蘚、接觸植物或動物毒素或者自體免疫疾患有關。112.如權利要求110所述的方法，其中所述的給藥是通過用鼻噴霧劑。113.如權利要求110所述的方法，其中所述的給藥是通過用吸入劑。114.如權利要求110所述的方法，其中所述的給藥是通過用滴眼液。115.如權利要求110所述的方法，其中所述的給藥是通過用局部使用。116.如權利要求110所述的方法，其中所述的給藥是局部使用或者靜脈內注射。117.如權利要求110所述的方法，其中所述的給藥是以一天一到四次。118.一種由重組病毒載體增強基因遞送的方法，其包括在給藥所述的重組病毒載體之前或者同時將權利要求83、85、87、88、89、90、91或92所述組合物的治療有效量給藥到受治療者的上皮細胞。119.如權利要求118所述的方法，其中所述的重組病毒載體為逆轉錄病毒載體、皰疹病毒載體、腺病毒載體或者腺相關病毒載體。120.如權利要求119所述的方法，其中所述的重組病毒載體為重組的腺相關病毒載體。121.如權利要求120所述的方法，其中所述重組腺相關病毒載體包括編碼囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子(CFTR)的基因。122.如權利要求119所述的方法，其中所述的給藥是通過用吸入劑。123.如權利要求119所述的方法，其中所述的給藥是以一天一到四次。124.一種藥物制劑，其包括權利要求62所述的組合物。125.如權利要求124所述的藥物制劑，其配制成噴霧劑。126.如權利要求124所述的藥物制劑，其配制成吸入劑。127.一種治療或者預防流感感染的方法，其包括將權利要求124所述的組合物的治療有效量應用到受治療者的上皮細胞。128.如權利要求127所述的方法，其中所述的應用是通過用鼻噴霧劑。129.如權利要求127所述的方法，其中所述的應用是通過用吸入劑。130.如權利要求127所述的方法，其中所述的應用是以一天一到四次。全文摘要本發(fā)明提供了預防和治療病原感染的新的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供的化合物具有將此化合物錨定到靶細胞表面的錨定域和能在細胞外作用以防止病原體(例如病毒)對靶細胞的感染的治療域。本發(fā)明也包括具有唾液酸酶活性的治療組合物，此組合物含具有唾液酸酶催化域的基于蛋白的化合物。本發(fā)明化合物可用于治療或者預防病原體感染，并且可用于治療和減少過敏及發(fā)炎反應。本發(fā)明也提供了用于提高重組病毒向靶細胞轉導的組合物和方法。這些組合物和方法可在基因治療中得以運用。文檔編號C12N1/21GK101426906SQ200580037226公開日2009年5月6日申請日期2005年7月21日優(yōu)先權日2004年9月10日發(fā)明者芳房,邁克爾·馬拉科夫申請人:芳房,邁克爾·馬拉科夫