專利名稱：分子結(jié)構(gòu)和功能的測(cè)定方法
分子結(jié)構(gòu)和功能的測(cè)定方法本發(fā)明涉及測(cè)量跨過細(xì)胞膜或脂雙層(lipid bilayer)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的方法，其至少包含具有頂面和背面和多個(gè)納米孔或微孔的基底和從細(xì)胞膜的兩面均可進(jìn)入的覆蓋所述多個(gè)孔的細(xì)胞膜。多種重要的生物反應(yīng)，如能量轉(zhuǎn)換、儲(chǔ)存、免疫反應(yīng)和信號(hào)傳遞在細(xì)胞膜處發(fā)生并通過膜蛋白進(jìn)行。另一方面，藥物透過膜本身的滲透性是制藥工業(yè)中的重要問題，因?yàn)樵S多藥物必須滲透該膜才能到達(dá)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的靶。但是，研究這些膜蛋白(全細(xì)胞膜片鉗法 (whole cell patch-clamp methods))和膜滲透性(Caco-2 或 PAMPA 滲透性檢測(cè)法)的傳統(tǒng)方法具有許多缺點(diǎn)，這使它們作為藥物篩選法的標(biāo)準(zhǔn)工具的應(yīng)用復(fù)雜化。芯片可用于監(jiān)測(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，尤其是跨過生物膜的藥物滲透或跨過含離子通道的膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)。這種芯片從WO 2005/064342中獲知，其詳細(xì)描述了這種芯片的使用背景和益處。其還描述了作為生物有效層的膜，其是細(xì)胞膜或脂雙層，以及該芯片的功能和結(jié)構(gòu)。一類重要的膜蛋白是G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其構(gòu)成細(xì)胞膜受體的最大亞類。這些受體的大約一半被視為藥物的靶。GPCR充當(dāng)從細(xì)胞外部向內(nèi)部傳送信號(hào)(如光子、氣味劑、激素和神經(jīng)遞質(zhì))的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其中通過相應(yīng)的G-蛋白引發(fā)各種類型的反應(yīng)級(jí)聯(lián)。 G-蛋白共價(jià)錨定到脂雙層且目前根據(jù)α-亞基的性質(zhì)分成四族，它們與不同的靶膜蛋白 (target membrane proteins),如酶或離子通道相互作用。在G-蛋白離解后，α -亞基在脂雙層內(nèi)側(cè)向擴(kuò)散，鍵合到靶蛋白上并激活該靶蛋白。在下面略述的體外檢測(cè)系統(tǒng)的幾乎所有情況下，組成未知的生物膜固定在固體載體上，這通常造成脂雙層的有限流動(dòng)性和膜蛋白的結(jié)構(gòu)擾動(dòng)(structural disturbance)。因此,在大量藥物篩選活動(dòng)中非常不希望遇到這些情況，因?yàn)樵跈z測(cè)過程中，可能極大干擾蛋白質(zhì)的天然功能。第二類重要的膜蛋白是離子通道。這些電壓-或配體-門控的通道以下述事實(shí)為特征它們將沿它們的電化學(xué)梯度向下(down to their electrochemical gradient)跨膜傳送大量離子(達(dá)到IO8個(gè)離子/秒)。這通過這些蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)，其可以在數(shù)毫秒內(nèi)打開和關(guān)閉它們的通道結(jié)構(gòu)。許多已知疾病，如心力衰竭，與特定離子通道的功能障礙相關(guān)聯(lián)，這因此也被踴躍研究。對(duì)離子通道的功能和結(jié)構(gòu)研究的選擇方法是膜片鉗技術(shù)。這種技術(shù)由通過在膜各側(cè)上放置電極來(lái)利用這些蛋白質(zhì)的高離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率的電化學(xué)測(cè)量構(gòu)成。 通過使用該提出的高度復(fù)雜的檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)膜蛋白的功能的更深入洞悉。學(xué)術(shù)研究和藥物發(fā)現(xiàn)都獲益于這種認(rèn)識(shí)。第三類重要的膜蛋白是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。與離子通道相反，它們能在能量消耗下逆著電化學(xué)梯度跨過生物膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)離子或其它分子。但是，與離子通道相比，這些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度(速率)遠(yuǎn)低于離子通道(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)最多IO4 /秒vs.通道IO8 /秒)， 使得主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不適合電化學(xué)測(cè)量。除蛋白質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程外，另一可能是分子有可能穿過脂雙層簡(jiǎn)單(被動(dòng))擴(kuò)散。這一方面對(duì)必須以高速率穿過膜但由于小且溶劑化差而可以獨(dú)力完成這一點(diǎn)的分子如O2和CO2而言是重要的，另一方面對(duì)不存在特異性載體以促進(jìn)細(xì)胞滲透的許多藥物是重要的。藥物通過穿透腸內(nèi)側(cè)(lining)的細(xì)胞而吸收到血流中的能力因此代表制藥公司的藥物剖析法(drug profiling process)中的重要參數(shù)。由于大部分藥物(>80%)通過被動(dòng)擴(kuò)散穿過腸上皮來(lái)進(jìn)入血流，預(yù)測(cè)口服藥物的被動(dòng)滲透的檢測(cè)法變得越來(lái)越重要。通常通過經(jīng)UV-分光光度檢測(cè)或在這些化合物不吸收紫外線的情況下經(jīng)LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜法)分析測(cè)量各化合物的濃度來(lái)進(jìn)行藥物候選物的被動(dòng)擴(kuò)散的測(cè)定。對(duì) UV-分光光度分析而言，上文提到的人工膜檢測(cè)和Caco-2細(xì)胞基檢測(cè)都沒有提供在線測(cè)定濃度的可能性，因?yàn)榻⒌倪^濾器在光學(xué)上不適合透射測(cè)量。任選地，也可以使用任何其它不常見的已知測(cè)定方法。上文提到的現(xiàn)有技術(shù)芯片用于穿過膜孔的電化學(xué)測(cè)量。被動(dòng)擴(kuò)散法尤其需要在多個(gè)小時(shí)的總測(cè)量期間穩(wěn)定的膜。已知的膜在孔區(qū)域中缺乏充足的穩(wěn)定性，這以不合意的方式影響測(cè)量結(jié)果。基底至少包含氮化硅表面。因此，本發(fā)明的目的是提供在用于生物傳感器和藥物篩選應(yīng)用的芯片基膜系統(tǒng)中的改進(jìn)的光學(xué)測(cè)量方法，其適用于工業(yè)生產(chǎn)和通用用途。通過如權(quán)利要求I中所述的方法解決該問題。在從屬權(quán)利要求中要求保護(hù)進(jìn)一步有利的實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明，該方法包括
提供至少具有具有頂面和背面和至少一個(gè)納米孔或微孔的基底和覆蓋所述至少一個(gè)孔的膜的芯片；
至少在所述至少一個(gè)孔的區(qū)域中提供材料層以在所述至少一個(gè)孔處支承該膜以允許穿過該膜和該孔轉(zhuǎn)運(yùn)；
將含有至少一種分子或離子的流體施加至該膜的頂面以使該分子或離子穿過該膜、所述至少一個(gè)孔和該材料層移動(dòng)；和
使用光學(xué)檢測(cè)監(jiān)測(cè)已穿過該膜、所述至少一個(gè)孔和該材料層的分子或離子。該納米孔基底可能由含娃和碳的材料制成，但也可以由聚合物、金屬、電介質(zhì)、玻璃或陶瓷制成。至少在所述至少一個(gè)孔的區(qū)域中提供該材料層以在所述至少一個(gè)孔處支承和穩(wěn)定該膜，但不阻礙穿過該膜和該孔轉(zhuǎn)運(yùn)。該材料層通常置于基底的背面或頂面上。在基底背面上提供材料層在制造過程中具有一些優(yōu)點(diǎn)，但是，也可以提供具有在基底頂面上的該材料層的工作芯片。通過監(jiān)測(cè)分子，檢測(cè)施加至膜頂面并到達(dá)背面的流體中的分子濃度。通常，光學(xué)檢測(cè)提供候選物是否能穿過該膜的信息和相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。尤其可通過光譜學(xué)方法，尤其通過 UV/VIS吸收或熒光光譜學(xué)進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。對(duì)后者而言，受分析的分子可以是自體熒光或帶有特異性熒光標(biāo)記。測(cè)得的熒光信號(hào)也可能受跨膜分子的轉(zhuǎn)運(yùn)影響(放大或淬滅)。特別有意義的是候選物穿過該膜所需的時(shí)間。根據(jù)機(jī)制(被動(dòng)擴(kuò)散、離子通道或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，穿過時(shí)間在寬范圍內(nèi)變動(dòng)。由于該穩(wěn)定的材料層，本發(fā)明的方法能夠?qū)崟r(shí)測(cè)量可能花費(fèi)例如 48小時(shí)或更久的長(zhǎng)效擴(kuò)散過程。該方法提供所述材料層，其由充分支承細(xì)胞膜但足夠多孔以便允許穿過該細(xì)胞膜的物質(zhì)也能穿過該材料層的任何種類的多孔材料制成。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的具有這種特征的所有材料，優(yōu)選例如聚合物、凝膠或多孔疏松材料(porous bulk material),都適合在孔區(qū)域中支承和穩(wěn)定該膜。該聚合物材料層可包括不帶電的聚合物，如藻酸鹽，或帶電聚合物，如聚合電解質(zhì)多層(PEM)。后者可通過逐層法(layer-by-layer method)用不同的聚合電解質(zhì)制造。例如，聚合電解質(zhì)可選自聚醚酰亞胺(PEI)、聚烯丙胺(PAH)、聚谷氨酸(polyglutamatacid, PGA)或聚苯乙烯橫酸鈉(polystyrolsulfonat, PSS)。重要的是，PEM 膜通過將該P(yáng)EM用于融合或通過利用芯片的SiN表面來(lái)促進(jìn)脂雙層形成。在后一情況下， PEM應(yīng)不干擾SiN囊泡相互作用。此外，PEM膜必須是離子可穿透的并且不干擾通道轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)量，也與尚子通道相容。該聚合物優(yōu)選是用公知的逐層法制造的聚合電解質(zhì)或親水聚合物；該凝膠是水凝膠，該疏松材料是微米_/納米-多孔硅或金屬或陶瓷。該材料層有利地通過公知的旋涂或噴涂技術(shù)沉積或是燒結(jié)層。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該方法提供被帶有所述材料層的所述納米孔芯片隔開的兩個(gè)隔室，優(yōu)選為微量滴定板格式的孔，其在水平(在一個(gè)孔內(nèi))或垂直(在兩個(gè)孔之間)方向，在后一情況下能通過UV/VIS吸收或熒光光譜法直接測(cè)量化合物濃度并因此也能在線測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。具有分子的流體經(jīng)過孔從一個(gè)隔室移動(dòng)到另一隔室。通過用轉(zhuǎn)運(yùn)分子進(jìn)行熒光光譜法，另一隔室中的熒光受到影響，通過引發(fā)熒光而提高或通過淬滅該隔室中現(xiàn)有的突光而降低。本發(fā)明能夠監(jiān)測(cè)長(zhǎng)效被動(dòng)擴(kuò)散過程或?qū)δ苣まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白的動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究。 因此，就響應(yīng)要篩選的潛在藥物化合物的膜蛋白的完整功能性而言，本發(fā)明的方法可用于藥物發(fā)現(xiàn)法(drug discovery process)。本發(fā)明適用于如上提到的所有種類的膜蛋白。下面聯(lián)系附圖
聯(lián)系優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明的單個(gè)特征可以單獨(dú)實(shí)現(xiàn)或與說明書或權(quán)利要求的其它特征聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。
附圖示意性描繪了在圖I中描繪了在基底背面上帶有材料層的通過本發(fā)明的方法提供的芯片的橫截面視圖，
在圖2中描繪了在基底頂面上帶有材料層的通過本發(fā)明的方法提供的芯片的橫截面視圖，且
在圖3中描繪了使用兩個(gè)隔室和UV分光光度法的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。這些圖顯示具有基底2的芯片1，該基底2具有孔3。芯片I包含多個(gè)這樣的孔3， 并在根據(jù)WO 2005/064342的一個(gè)實(shí)施方案中包含100平方毫米總面積的可由含硅和碳的材料也可由聚合物、金屬、電介質(zhì)、玻璃或陶瓷制成的陣列基底(array substrate)。合適的據(jù)此是指該載體材料的性質(zhì)允許膜4與基底的粘合。例如400 X 400 μ m的孔陣列段(pore array section)包含直徑為50至2000納米的孔。選擇孔3相互之間的距離(間距)以在它們直徑的范圍內(nèi)。這確保膜蛋白和要篩選的化合物的相當(dāng)高的分子密度，也徹底減少了膜蛋白和要篩選的化合物的量。在圖I中，膜4直接粘附到基底2的頂面上。膜4也是從WO 2005/064342中公知的，分子5示例性穿過膜4和孔3。在基底2背面上是通過公知沉積技術(shù)沉積的材料層6， 其覆蓋背面并在孔3 (和所有其它孔)中穿透以在孔3的區(qū)域中支承和穩(wěn)定膜4。材料層6 是充分支承細(xì)胞膜4但足夠多孔以便允許穿過細(xì)胞膜4的物質(zhì)也能穿過材料層6的任何種類的多孔材料。在該情況中，其是由PSS/PAH制成的PEM。這一對(duì)促進(jìn)囊泡融合。但是，其它配對(duì)也可行。 圖2顯示置于基底2與膜4之間的材料層6。在這些圖的這兩種實(shí)施方案中，在施加膜4之前在基底2上沉積材料層6。圖3以示意性方式描繪納米孔芯片I，其在壁7中分離兩個(gè)隔室A和B，優(yōu)選為微量滴定板格式的孔，以水平(在一個(gè)孔內(nèi))或垂直(在兩個(gè)孔之間)方向分離，在后一情況下能通過UV分光光度法直接測(cè)量化合物濃度并因此也能在線測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。隔室A中的流體8中分子5的濃度開始時(shí)高于隔室B中的濃度。在這兩個(gè)隔室中的被動(dòng)擴(kuò)散程序結(jié)束時(shí)，理想地，濃度相同。通過監(jiān)測(cè)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，測(cè)定滲透系數(shù)。
權(quán)利要求
1.測(cè)量細(xì)胞膜或脂雙層的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)的方法，包括提供芯片(I )，其至少具有具有頂面和背面和至少一個(gè)納米孔或微孔(3)的基底(2)和覆蓋所述至少一個(gè)孔(3)的膜(4)；至少在所述至少一個(gè)孔(3)的區(qū)域中提供材料層(6)以在所述至少一個(gè)孔(3)處支承該膜(4)以允許穿過該膜(4)和所述至少一個(gè)孔(3)轉(zhuǎn)運(yùn)；將含有至少一種分子(5)或離子的流體(8)施加至該膜(4)的頂面以使該分子(5)或離子穿過該膜(4)、至少一個(gè)孔(3)和該材料層(6)移動(dòng)；和通過使用光學(xué)檢測(cè)法監(jiān)測(cè)已穿過該材料層(6)的該分子(5)或離子。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于通過UV/VIS吸收或熒光光譜學(xué)進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于提供材料層(6)，其由充分支承該膜(4)但足夠多孔以允許穿過該膜(4)的物質(zhì)也穿過該材料層(6)的任何種類的多孔材料，如聚合物、凝膠或多孔疏松材料制成。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于該聚合物是聚合電解質(zhì)或親水聚合物。
5.權(quán)利要求3的方法，其特征在于該凝膠是水凝膠。
6.權(quán)利要求3的方法，其特征在于該疏松材料是微米_/納米-多孔硅或金屬或陶瓷。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過旋涂或噴涂沉積該材料層(6)。
8.前述權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過燒結(jié)制造該材料層(6)。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于提供被該芯片(I)隔開的兩個(gè)隔室(A，B) 以直接測(cè)量一個(gè)隔室(B)中的化合物濃度、用于研究或宏觀檢測(cè)所述兩個(gè)隔室(A，B)之間的分子過程(molecular processes)。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于在短和長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間內(nèi)光學(xué)實(shí)時(shí)測(cè)量穿過該芯片(I)的分子(5)或離子。
全文摘要
本發(fā)明描述測(cè)量細(xì)胞膜或脂雙層的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)的方法，包括至少提供具有頂面和背面和多個(gè)納米孔或微孔的基底和從細(xì)胞膜的兩面均可進(jìn)入以供測(cè)量的覆蓋所述多個(gè)孔隙的細(xì)胞膜、位于基底頂面或背面上的至少在孔隙區(qū)域中的材料層以在孔隙處支承該細(xì)胞膜但不阻礙穿過該細(xì)胞膜和孔隙轉(zhuǎn)運(yùn)，將含有至少一種分子的流體施加至該膜的頂面以使該分子或離子穿過該膜、孔隙之一和該材料層移動(dòng)；和使用光學(xué)檢測(cè)法監(jiān)測(cè)已穿過該材料層的分子。本發(fā)明能夠監(jiān)測(cè)長(zhǎng)效被動(dòng)擴(kuò)散過程或?qū)δ苣まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白的動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102590525SQ201210003078
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者J.弗勒斯, K.蘇基哈拉, M.D.貝拉爾迪諾, T.扎貝利 申請(qǐng)人:阿克塞特里斯股份公司