專利名稱：用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的體系和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的表達(dá)體系和使用相同體系用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法。
背景分泌性蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)-高爾基體系中進(jìn)行折疊和其它翻譯后修飾。破壞該體系的穩(wěn)態(tài)引起可以導(dǎo)致凋亡的細(xì)胞應(yīng)激。ER穩(wěn)態(tài)可以因Ca2+濃度或氧化還原狀態(tài)、糖基化作用的變化、或ER腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)堆積而改變。為克服應(yīng)激，分泌體系已經(jīng)演化了稱為解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。哺乳動(dòng)物UPR的活化引起至少三種應(yīng)答(1)轉(zhuǎn)運(yùn)至ER腔內(nèi)的新蛋白質(zhì)的量因翻譯減弱而減少；(2)堆積在ER腔內(nèi)的蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)并受到降解；以及確良(3)重建ER-高爾基分泌體系以便增強(qiáng)體系中的蛋白質(zhì)折疊和加工能力。
增強(qiáng)響應(yīng)應(yīng)激的ER-高爾基體系的能力涉及上調(diào)起折疊作用和加工作用的酶。這些酶包括ER蛋白伴侶、參與糖基化作用和二硫鍵形成的酶和參與小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的酶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，IRE1和ATF6蛋白是UPR途徑中此支路的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。IRE1蛋白是在其C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有激酶活性和核酸內(nèi)切酶活性的ER跨膜糖蛋白。在小鼠中已經(jīng)至少鑒定了兩個(gè)IRE1基因-IRE1α和IRE1β。IRE1α對(duì)活力重要并且表達(dá)廣泛。僅在胃腸粘膜內(nèi)檢測(cè)到IRE1β。ER應(yīng)激導(dǎo)致IRE1蛋白寡聚化和其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域反式自體磷酸化(trans-autophosphorylation)。IRE1的磷酸化激活其核酸內(nèi)切酶活性，該活性自轉(zhuǎn)錄因子X(jué)盒結(jié)合蛋白1(XBP1)的mRNA切除內(nèi)含子。此剪接事件導(dǎo)致將轉(zhuǎn)錄失活性XBP1同種型(即XBP1u)轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)錄激活性XBP1同種型(即XBP1s或XBP1p)。隨后XBP1p進(jìn)入細(xì)胞核，在那里它結(jié)合至ER-高爾基蛋白伴侶/酶基因調(diào)節(jié)區(qū)中的靶序列，包括ER應(yīng)激反應(yīng)元件(ERSE)和UPR元件(UPRE)，以誘導(dǎo)它們轉(zhuǎn)錄。眾多UPR靶基因在其啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)具有ERSE或UPRE序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
ATF6(激活性轉(zhuǎn)錄因子6)是另一種ER跨膜蛋白。ER應(yīng)激導(dǎo)致ATF6蛋白轉(zhuǎn)移至高爾基區(qū)室，在那里其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域由Site1蛋白酶和Site2蛋白酶切割。切下的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核并且通過(guò)結(jié)合至ERSE序列充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，隨后上調(diào)分泌途徑中的多種蛋白伴侶和加工酶。
活化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的UPR途徑還導(dǎo)致經(jīng)過(guò)PERK信號(hào)途徑短暫抑制蛋白質(zhì)翻譯。PERK是能夠磷酸化真核性翻譯起始因子eIF2α作為響應(yīng)ER應(yīng)激的ER跨膜激酶。eIF2α的磷酸化阻止43S核糖體起始前復(fù)合體裝配并且因此導(dǎo)致翻譯減弱。自相矛盾的是eIF2α的磷酸化還導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4迅速合成，這反過(guò)來(lái)增強(qiáng)了促進(jìn)凋亡的轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)。CHOP啟動(dòng)細(xì)胞死亡，此時(shí)ER應(yīng)激的有害效應(yīng)不再可以克服。
分泌性重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)經(jīng)常導(dǎo)致低產(chǎn)率。為提高蛋白質(zhì)產(chǎn)生常用的方法是提高轉(zhuǎn)錄率，如使用較強(qiáng)啟動(dòng)子，或提高基因拷貝數(shù)。然而，提高的轉(zhuǎn)錄率可以加劇ER應(yīng)激，并且因此經(jīng)常不能顯著地提高產(chǎn)率。在某些情況下，這可以進(jìn)一步降低產(chǎn)率。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供具有改進(jìn)的分泌性蛋白或膜蛋白產(chǎn)率的表達(dá)體系。該體系使用具有改良的并且在許多情況下增強(qiáng)的蛋白質(zhì)折疊或加工能力的基因工程化動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
在一個(gè)方面，本發(fā)明描述了基因工程化動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，其包含編碼(1)目的蛋白質(zhì)和(2)UPR途徑的組分或調(diào)節(jié)物的一種或多種重組表達(dá)盒。合適的UPR組分或調(diào)節(jié)物包括，但不限于，在UPR途徑中發(fā)揮作用的非IRE1分子。它們可以是宿主細(xì)胞的內(nèi)源性UPR組分，或其變體或功能等同物。它們還可以是直接或間接調(diào)節(jié)內(nèi)源性UPR組分的活性或表達(dá)的天然存在或非天然存在分子。在許多情況下，UPR組分/調(diào)節(jié)物如此加以選擇以致它們的表達(dá)或活化提高宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)折疊或加工能力。
示例性UPR組分/調(diào)節(jié)物包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄因子如XBP1或ATF6或其生物活性片段或變體。也可以使用XBP1或ATF6介導(dǎo)的UPR途徑中的其它組分。此外，可以使用停留在ER中的(ER-resident)蛋白伴侶或加工酶。
可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括，但不限于，促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素、胰島素、干擾素、生長(zhǎng)因子、膜蛋白或其它治療性、預(yù)防性或診斷性蛋白質(zhì)。在眾多實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)由宿主細(xì)胞表達(dá)為分泌性蛋白或膜蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的基因工程化細(xì)胞可以衍生自細(xì)胞系、原代培養(yǎng)物或者其它分離的或培養(yǎng)的細(xì)胞。基因工程化細(xì)胞還可以是雜交細(xì)胞。在許多情況下，雜交細(xì)胞通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞和癌細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞)融合產(chǎn)生。編碼目的蛋白質(zhì)或UPR組分/調(diào)節(jié)物的重組表達(dá)盒可以先于或后于融合事件引入或?qū)腚s交細(xì)胞。此外，本發(fā)明的基因工程化細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因工程化細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
重組表達(dá)盒可以通過(guò)多種方式引入宿主細(xì)胞。例如，表達(dá)盒可以穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞的染色體或基因組。整合可以為隨機(jī)或定向(例如通過(guò)使用噬菌體P1的Cre-/ox重組體系)。表達(dá)盒還可以通過(guò)非整合性表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
重組表達(dá)盒可以由組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。它還可以由組織特異性或發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子控制。其他類型的啟動(dòng)子也可以用于本發(fā)明。
在另一方面，本發(fā)明描述了基因工程化動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，其包含編碼(1)目的蛋白質(zhì)和(2)能夠結(jié)合至宿主細(xì)胞UPRE或ERSE的多肽的一種或多種重組表達(dá)盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合至UPRE或ERSE的多肽是轉(zhuǎn)錄因子，如XBP1或ATF6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合至UPRE或ERSE的多肽可以將另一種蛋白質(zhì)召集至UPR基因的啟動(dòng)子區(qū)，并且后一種蛋白質(zhì)包含能夠活化UPR基因轉(zhuǎn)錄的反式激活結(jié)構(gòu)域(例如XBP1或ATF6的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)。
本發(fā)明的基因工程化細(xì)胞可以從相同或不同的重組表達(dá)盒上表達(dá)目的蛋白質(zhì)和UPR組分/調(diào)節(jié)物。目的蛋白質(zhì)和UPR組分/調(diào)節(jié)物可以由相同或不同啟動(dòng)子控制。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因工程化細(xì)胞包含(1)編碼目的蛋白質(zhì)的第一重組表達(dá)盒和(2)編碼UPR組分或調(diào)節(jié)物或者UPRE結(jié)合蛋白或ERSE結(jié)合蛋白(例如XBP1或ATF6)的第二重組表達(dá)盒。第一重組表達(dá)盒總數(shù)對(duì)第二重組表達(dá)盒總數(shù)的比率范圍在細(xì)胞中可以是但不限于從不超過(guò)0.1∶1至至少10∶1。在許多情況下，第一重組盒所用的啟動(dòng)子可以具有與第二重組盒所用啟動(dòng)子的相同或相似強(qiáng)度，并且第一重組盒總數(shù)對(duì)第二重組盒總數(shù)的比率范圍是從0.5∶1至10∶1(如至少1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1)。第一重組盒和第二重組盒內(nèi)的啟動(dòng)子還可以具有不同強(qiáng)度。例如，第一重組盒內(nèi)的啟動(dòng)子可以比第二重組盒內(nèi)的啟動(dòng)子更強(qiáng)，如強(qiáng)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。
仍在另一方面，本發(fā)明描述了包含本發(fā)明基因工程化細(xì)胞的動(dòng)物或植物。用于將遺傳修飾的細(xì)胞引入動(dòng)物或植物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。在眾多實(shí)施方案中，動(dòng)物或植物是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物。
仍在另一方面，本發(fā)明描述了以編碼(1)目的蛋白質(zhì)和(2)UPR途徑的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物的一種或多種表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物。在眾多實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含編碼目的蛋白質(zhì)的第一重組表達(dá)盒和編碼UPR組分或調(diào)節(jié)物(例如XBP1或ATF6)的第二重組表達(dá)盒。第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒可以由相同或不同表達(dá)載體攜帶。第一重組表達(dá)盒對(duì)第二重組表達(dá)盒的摩爾比范圍在細(xì)胞培養(yǎng)物中可以例如是從不超過(guò)0.1∶1至至少10∶1，如至少1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或更多。細(xì)胞培養(yǎng)物可以是適用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)物、植物細(xì)胞培養(yǎng)物或其它培養(yǎng)物。
本發(fā)明還描述了使用基因工程化的細(xì)胞、動(dòng)物、植物或細(xì)胞培養(yǎng)物用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法。
此外，本發(fā)明描述了編碼(1)目的蛋白質(zhì)和(2)UPR途徑的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物的表達(dá)載體。
本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)在后續(xù)的詳細(xì)說(shuō)明中顯而易見(jiàn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是詳細(xì)的說(shuō)明雖然顯示了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但僅僅是以示例方式給出，并不構(gòu)成限制。本發(fā)明范圍內(nèi)的多種改動(dòng)和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言從詳細(xì)的說(shuō)明中是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述為說(shuō)明提供附圖，但并不構(gòu)成限制。


圖1表明在BMP6在PA DUKX細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)引起ER應(yīng)激。
圖2顯示外源XBP1在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中在非應(yīng)激條件或應(yīng)激條件下的表達(dá)。
圖3顯示BMP6在數(shù)個(gè)XBP1細(xì)胞系中比親代CHO DUKX細(xì)胞中提高的分泌。
圖4顯示IL11RFc在數(shù)個(gè)XBP1細(xì)胞系中比親代CHO DUKX細(xì)胞中提高的分泌。
圖5顯示GFP轉(zhuǎn)染效率在所選擇的XBP1細(xì)胞系和親代CHO DUKX細(xì)胞系中相似。
圖6顯示GFP轉(zhuǎn)錄效率和翻譯效率在所選擇的XBP1細(xì)胞系和親代CHO DUKX細(xì)胞系中相似。
圖7顯示可誘導(dǎo)的ATF6蛋白在COS-1細(xì)胞中的成功表達(dá)。
圖8描述與靶蛋白cDNA呈不同比例的XBP1或ATF6對(duì)靶蛋白產(chǎn)生的影響。
圖9顯示XBP1或ATF6對(duì)不同靶蛋白表達(dá)的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的體系和方法。本發(fā)明的表達(dá)體系使用具有改良或改進(jìn)蛋白質(zhì)折疊或加工能力的基因工程化動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因工程化細(xì)胞包含編碼目的蛋白質(zhì)和UPR途徑的組分或調(diào)節(jié)物的一種或多種重組表達(dá)盒。共表達(dá)UPR組分/調(diào)節(jié)物顯著地提高目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。適用于本發(fā)明的UPR組分/調(diào)節(jié)物包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄因子如XBP1或ATF6或其生物活性片段或變體。還可以使用ER相關(guān)的蛋白伴侶或酶。
本發(fā)明的多個(gè)方面在如下分項(xiàng)中更詳細(xì)地描述。分項(xiàng)的用途并非意在限制本發(fā)明。每一分項(xiàng)可以用于本發(fā)明的任意方面。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“或”意指“和/或”，除非另外申明。
A.目的蛋白質(zhì)可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括，但不限于治療性、預(yù)防性或診斷性蛋白質(zhì)如促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素、胰島素、白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子、干擾素、集落刺激因子、血液因子、疫苗、膠原、纖維蛋白原、人血清白蛋白、組織纖溶酶原激活物、葡萄糖苷酶、阿糖苷酶(alglucerases)、髓鞘堿性蛋白、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸羥化酶、多巴脫羧酶或抗體。服從于本發(fā)明的示例性抗體包括，但不限于單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成性抗體、重組抗體、雜合抗體、Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb或其功能性片段。使用體外(in vitro)呈現(xiàn)技術(shù)或演化策略所選擇的高親和性結(jié)合物也可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生。這些高親和性結(jié)合物包括，但不限于肽、抗體和抗體模擬物。見(jiàn)例如Binz等，NAT BIOTECHNOL.，22575-582(2004)以及Lipovsek和Pluckthunm，J IMMUNOLMETHODS，29051-67(2004)。其它目的蛋白質(zhì)如激酶、磷酸酶、G蛋白偶聯(lián)受體、生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、細(xì)胞表面抗體(膜結(jié)合免疫球蛋白)、BMP/GDF-受體、神經(jīng)元受體、離子通道、蛋白酶、轉(zhuǎn)錄因子或聚合酶也可以由本發(fā)明產(chǎn)生。
在眾多實(shí)施方案中，由本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是重組蛋白。如本文中所用，重組蛋白指的是使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。重組蛋白可以具有天然存在的序列或基因工程化的序列。它可以例如從重組載體或從對(duì)宿主細(xì)胞為內(nèi)源但具有基因工程化調(diào)節(jié)序列的基因表達(dá)。例如，重組蛋白可以自具有基因工程化的病毒啟動(dòng)子的內(nèi)源性基因表達(dá)。
在許多情況下，重組蛋白是融和蛋白，包括促進(jìn)所表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化、檢測(cè)、固定、穩(wěn)定、折疊或定向的多肽標(biāo)簽。
在眾多其它情況下，重組蛋白包括信號(hào)肽。信號(hào)肽對(duì)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以是內(nèi)源性或異源性的。信號(hào)肽經(jīng)常決定蛋白質(zhì)是在粗面ER還是在游離核糖體上產(chǎn)生。信號(hào)肽可以與信號(hào)識(shí)別顆粒相互作用并且指導(dǎo)核糖體至發(fā)生共翻譯性插入的ER上。眾多信號(hào)肽高度疏水，具有正電荷殘基。信號(hào)肽可以自生長(zhǎng)的肽鏈由位于ER潴泡面的特異性蛋白酶-信號(hào)肽酶切下。
由信號(hào)序列定向至ER的蛋白質(zhì)可以作為分泌性蛋白質(zhì)釋放至細(xì)胞外空間。例如，含有分泌性蛋白質(zhì)的小泡可以與細(xì)胞膜融合并將其內(nèi)容物釋放至細(xì)胞外空間-一種稱作胞吐的過(guò)程。胞吐可以組成型地發(fā)生或在接受觸發(fā)信號(hào)后發(fā)生。在后一情況下，蛋白質(zhì)貯藏在分泌泡(或分泌顆粒)內(nèi)直至觸發(fā)胞吐。類似地，定居在細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)可以通過(guò)蛋白水解性切割將該蛋白質(zhì)固定至膜上的“接頭”而分泌至胞外空間。
目的蛋白質(zhì)可以自表達(dá)體系通過(guò)多種方法分離。用于蛋白質(zhì)分離的初始材料實(shí)例包括，但不限于，培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物。合適的分離方法包括，但不限于，親和層析(包括免疫親和層析)、離子交換層析、疏水相互作用層析、大小排阻層析、HPLC、蛋白質(zhì)沉淀(包括免疫沉淀)、差異性溶解、電泳、離心、結(jié)晶或其組合。多肽標(biāo)簽如鏈親和素標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、多組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶或Fc片段可以與目的蛋白質(zhì)融合以促進(jìn)目的蛋白質(zhì)的分離或純化。在一個(gè)情況下，多肽標(biāo)簽可從目的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白酶切除。
在眾多實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明分離的目的蛋白質(zhì)基本上沒(méi)有其它蛋白質(zhì)或雜質(zhì)。例如，分離的蛋白質(zhì)可以是至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％無(wú)其它蛋白質(zhì)的純度。在一個(gè)實(shí)例中，分離的蛋白質(zhì)含有不超過(guò)非顯著量的會(huì)干擾該蛋白質(zhì)預(yù)期用途的雜質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明分離的目的蛋白質(zhì)可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如SDS-PAGE或免疫測(cè)定法進(jìn)行驗(yàn)證。SDS-PAGE可以用考馬斯藍(lán)試劑、銀試劑或其它合適試劑染色以顯影分離的蛋白質(zhì)。合適的免疫測(cè)定法包括，但不限于，Western印跡、ELISA、RIA、夾心或免疫度量測(cè)定法、乳膠或其它顆粒凝集試驗(yàn)或蛋白質(zhì)組芯片。也可以使用蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜法以驗(yàn)證或分析分離的蛋白質(zhì)。
B.UPR組分/調(diào)節(jié)物服從于本發(fā)明的UPR組分/調(diào)節(jié)物包括在UPR途徑中發(fā)揮作用的分子。它們可以是天然存在分子或非天然存在分子。可以對(duì)它們進(jìn)行遺傳工程化、化學(xué)合成或生物分離。UPR組分/調(diào)節(jié)物可以源自與宿主細(xì)胞相同或不同的物種。UPR組分/調(diào)節(jié)物的表達(dá)改進(jìn)宿主細(xì)胞的分泌作用或ER加工能力。在許多情況下，UPR組分/調(diào)節(jié)物與目的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)改進(jìn)目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率至少2、3、4、5、10倍或更多。
適合本發(fā)明的UPR組分/調(diào)節(jié)物的實(shí)例包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄因子如XBP1或ATF6。也可以使用這些轉(zhuǎn)錄因子的功能等同物如XBP1或ATF6的片段。這些片段至少保留了轉(zhuǎn)錄激活的XBP1或ATF6蛋白的實(shí)質(zhì)部分轉(zhuǎn)錄活性。也可以使用XBP1或ATF6的下游效應(yīng)物如參與蛋白質(zhì)糖基化作用或小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的ER蛋白伴侶或酶。
此外，也可以使用可活化XBP1或ATF6介導(dǎo)的UPR途徑的組分表達(dá)或生物學(xué)功能的非IRE1調(diào)節(jié)物。該調(diào)節(jié)物可以通過(guò)不同于自我過(guò)量表達(dá)的機(jī)制調(diào)節(jié)UPR途徑。例如，該調(diào)節(jié)物可通過(guò)直接結(jié)合至UPR組分而活化此組分的功能，或通過(guò)結(jié)合至編碼此組分的基因中的調(diào)節(jié)序列而調(diào)節(jié)此組分表達(dá)。
此外，也可以使用可抑制PERK信號(hào)途徑的組分表達(dá)或生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)物。這些調(diào)節(jié)物包括但不限于抗體、反義RNA或RNAi序列。此外，可以使用PERK途徑組分的顯性失活突變體。此類顯性失活突變體的實(shí)例是在第51位置(鼠序列)具有絲氨酸替換為丙氨酸的eIF2A S51A突變體。該替換取消了蛋白質(zhì)被磷酸化的能力并且因此終止該蛋白質(zhì)在ER應(yīng)激期間對(duì)蛋白質(zhì)翻譯速率的抑制效應(yīng)。類似地，可以向PERK的激酶結(jié)構(gòu)域?qū)胪蛔円韵驕p少其磷酸化eIF2a的激酶活性，因此阻止ER應(yīng)激期間翻譯減弱或凋亡的誘導(dǎo)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用XBP1蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段以提高宿主細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。XBP1蛋白質(zhì)包括在轉(zhuǎn)錄因子中經(jīng)常找到的賦予DNA結(jié)合和二聚化作用能力的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。已知XBP1是通過(guò)結(jié)合至稱作X盒的啟動(dòng)子元件對(duì)MHC II類基因調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子。XBP1還結(jié)合至T細(xì)胞白血病病毒1型的啟動(dòng)子中的增強(qiáng)子。
UPR途徑的活化在秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)和哺乳動(dòng)物模型體系中均導(dǎo)致小內(nèi)含子自XBP1 mRNA的IRE1依賴性剪接。得到的外顯子由tRNA連接酶連接。該剪接事件在XBP1 mRNA內(nèi)產(chǎn)生移碼，這產(chǎn)生了具有原有N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域但具有新的C端反式激活結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在鼠細(xì)胞中，該剪接事件將267個(gè)氨基酸XBP1同種型轉(zhuǎn)換為371個(gè)氨基酸XBP1同種型(XBP1s或XBP1p)。見(jiàn)Calfon等，NATURE，41592-96(2002)。
XBP1p蛋白質(zhì)結(jié)合至眾多ER蛋白伴侶或UPR基因啟動(dòng)子區(qū)的ERSE或UPRE序列上，激活這些基因轉(zhuǎn)錄。在哺乳動(dòng)物中，已經(jīng)鑒定至少兩個(gè)ERSE序列ERSE-I和ERSE-II。ERSE-I具有如SEQ ID NO1(CCAATNNNNNNNNNCCACG)中所示的保守序列。ERSE-II具有如SEQ IDNO2(ATTGGNCCACG)中所示的保守序列。此外，已經(jīng)鑒定至少兩個(gè)哺乳動(dòng)物的UPRE序列，一個(gè)序列具有如SEQ ID NO3(TGACGTGG)中所示的保守序列，并且另一個(gè)序列具有如SEQ ID NO4(TGACGTGA)中所示的保守序列。
XBP1蛋白質(zhì)編碼序列可以自多種來(lái)源獲得。例如，用于人、小鼠、大鼠、雞、果蠅和斑馬魚XBP1蛋白的編碼序列可自國(guó)立生物信息中心(NCBI)(Bethesda，MD)的Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)得到。這些序列分別具有Entrez登錄號(hào)NM_005080、NM_013842、NM_001004210、NM_001006192、NM_079983或NM_131874。
XBP1蛋白的生物學(xué)活性片段至少保留XBP1p蛋白的實(shí)質(zhì)部分轉(zhuǎn)錄激活活性。例如，在本發(fā)明中使用的XBP1片段可以保留XBP1p至少50％、60％、70％、80％、90％或更高的轉(zhuǎn)錄激活活性。可通過(guò)多種方法選擇具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1片段。在一個(gè)實(shí)例中，具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP1片段基于其激活ERSE或UPRE序列下游的基因轉(zhuǎn)錄的能力加以選擇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用ATF6蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段以改進(jìn)宿主細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。ATF6是包括位于EER腔內(nèi)的“感知”結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。ER應(yīng)激后，ATF6的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被切下并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，在那里它結(jié)合至ERSE序列并且因此激活下游的UPR基因。已經(jīng)鑒定了至少兩種ATF6蛋白，即ATF6α和ATF6β。ATF6α和ATF6β在結(jié)構(gòu)上相關(guān)并且在其b-zip結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有顯著的相似性。用于人、小鼠、綿羊和雞ATF6蛋白的示例性編碼序列分別具有Entrez登錄號(hào)NM_007348、XM_129579、AY942654和XM_422208。
與本發(fā)明中所用XBP1片段相似，ATF6蛋白的生物學(xué)活性片段至少保留了活化的ATF6蛋白或其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的實(shí)質(zhì)部分轉(zhuǎn)錄激活活性。生物學(xué)活性ATF6片段可以通過(guò)監(jiān)測(cè)它結(jié)合至ERSE序列和該片段激活ERSE序列下游的基因轉(zhuǎn)錄的能力加以選擇。
仍在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用停留在ER中的加工酶或蛋白伴侶以提高宿主細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。位于ER的合適酶/蛋白伴侶實(shí)例包括，但不限于，GRP78、GRP94、GRP58、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶、鈣聯(lián)結(jié)蛋白和肌鈣網(wǎng)蛋白(calrecticulin)。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中所用ER酶(或蛋白伴侶)的內(nèi)源對(duì)應(yīng)物具有包含一個(gè)或多個(gè)ERSE-I或ERSE-II序列的啟動(dòng)子區(qū)。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中所用ER酶(或蛋白伴侶)的內(nèi)源對(duì)應(yīng)物具有包含一個(gè)或多個(gè)UPRE序列的啟動(dòng)子區(qū)。
本發(fā)明還描述了作為內(nèi)源性蛋白質(zhì)變體的UPR組分的用途。內(nèi)源UPR組分的變體可以是天然存在的如通過(guò)等位變異或多態(tài)性，或是為有意設(shè)計(jì)。變體的UPR活性與原始蛋白質(zhì)(例如XBP1p、轉(zhuǎn)錄性激活的ATF6蛋白或其生物學(xué)活性片段)相比沒(méi)有顯著下降。在眾多實(shí)施方案中，本發(fā)明中所用變體至少保留相應(yīng)原始蛋白質(zhì)UPR活性的50％。例如，變體可以至少保留原始蛋白質(zhì)UPR活性的60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中所用變體顯示與原始蛋白質(zhì)相比提高的UPR活性。UPR組分的所需要變體可以如此加以選擇以致該變體的表達(dá)或活化增強(qiáng)宿主細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)的分泌。
變體的氨基酸序列與原始蛋白質(zhì)的氨基酸序列基本相同。在很多情況下，變體的氨基酸序列具有與原始蛋白質(zhì)至少80％、85％、90％、95％或99％的總體序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可以通過(guò)多種方法確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，序列同一性或相似性通過(guò)使用序列比對(duì)算法確定。用于此目的的合適算法包括，但不限于，Altschul等，J.MOL.BIOL.，215403-410(1990)中所述的基本局部比對(duì)工具(BLAST)、Needleman等，J.MOL.BIOL.，48444-453(1970)的算法、Myers和Miller，COMPUTE.APPLE.BIOSCL，411-17(1988)算法和點(diǎn)矩陣分析(dot matrix analysis)。用于此目的合適計(jì)算機(jī)程序包括，但不限于，NCBI提供的BLAST程序、DNASTAR(Madison，WI)提供的MegAlign和Genetics Computer Group(GCG)GAP程序(Needleman-Wench算法)。對(duì)于GAP程序，可以使用默認(rèn)值(例如在序列之一中打開(kāi)缺口的罰值是11并且對(duì)延伸缺口的罰值是8)。相似氨基酸可以通過(guò)BLOSSOM替換矩陣進(jìn)行定義。
眾多方法可用于制備UPR組分的所需要變體。例如，變體可以通過(guò)至少1、2、3、4、5、10、20個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替換、缺失、插入或其它修飾衍生自原始蛋白質(zhì)。替換可以是保守性的或非保守性的。在多數(shù)情況下，保守性氨基酸替換可以導(dǎo)入蛋白質(zhì)序列而不顯著改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)活性。保守性氨基酸轉(zhuǎn)換可以基于殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性或兩親性質(zhì)實(shí)施。例如，保守性氨基酸替換可以在具有堿性側(cè)鏈的氨基酸如賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)；具有不帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸如天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)和酪氨酸(Tyr或Y)或具有非極性側(cè)鏈的氨基酸如丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(He或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)、色氨酸(Trp或W)或半胱氨酸(Cys或C)中進(jìn)行。常用氨基酸替換實(shí)例在表1中說(shuō)明。
表1氨基酸替換的實(shí)例

也可以將其它想要的氨基酸替換導(dǎo)入U(xiǎn)PR組分。例如，可以將氨基酸替換導(dǎo)入U(xiǎn)PR組分以提高其穩(wěn)定性。對(duì)另一個(gè)實(shí)例，可以將氨基酸替換導(dǎo)入以提高或降低UPR組分的UPR活性。
此外，本發(fā)明描述了可以結(jié)合至宿主細(xì)胞UPRE或ERSE序列的多肽的用途。這些多肽，無(wú)論是單獨(dú)或與其它蛋白質(zhì)組合，均可以作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用以激活具有UPRE或ERSE啟動(dòng)子區(qū)的基因轉(zhuǎn)錄。
C.重組表達(dá)盒和宿主細(xì)胞本發(fā)明中所用的一般重組表達(dá)盒包含有效地連接至5′非翻譯調(diào)節(jié)區(qū)和3′非翻譯調(diào)節(jié)區(qū)的蛋白質(zhì)編碼序列。蛋白質(zhì)編碼序列可以是基因組序列、cDNA序列、其組合，或者其它可表達(dá)的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，重組表達(dá)盒包括指導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的全部調(diào)節(jié)元件。合適的5′非翻譯調(diào)節(jié)元件實(shí)例包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或Kozak序列。合適的3′非翻譯調(diào)節(jié)元件實(shí)例包括聚腺苷酸化序列或其它轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。為表達(dá)盒選擇合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員水平范圍內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)。眾多此類元件在文獻(xiàn)中描述并且可通過(guò)供應(yīng)商得到。
適合于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以對(duì)宿主細(xì)胞為內(nèi)源性或異源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用組織特異性啟動(dòng)子。合適的組織特異性啟動(dòng)子包括，但不限于，肺特異性啟動(dòng)子、淋巴樣特異性啟動(dòng)子、T細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子、胰腺特異性啟動(dòng)子或乳腺特異性啟動(dòng)子。也可以使用發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子?？梢允褂镁哂薪M織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子的重組表達(dá)盒以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物。此種重組表達(dá)盒所編碼的蛋白質(zhì)可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物的特定組織內(nèi)或特定發(fā)育階段產(chǎn)生。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用誘導(dǎo)型表達(dá)體系以產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)或UPR組分/調(diào)節(jié)物。適合于此目的的體系包括，但不限于，Tet-開(kāi)/關(guān)體系、蛻皮素體系和雷帕霉素體系。Tet-開(kāi)/關(guān)體系基于衍生自大腸桿菌(E.coli)Tn10轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素抗性操縱子的兩個(gè)調(diào)節(jié)元件。該體系包括兩種組分，調(diào)節(jié)盒和報(bào)告盒。在一個(gè)形式的Tet-關(guān)閉體系中，調(diào)節(jié)盒編碼了包含與單純皰疹病毒(HSV)VP 16激活結(jié)構(gòu)域融合的Tet阻遏物(tetR)的雜合蛋白。報(bào)告盒包括有效地連接至報(bào)告基因的tet響應(yīng)元件(TRE)。報(bào)告基因可編碼例如目的蛋白質(zhì)或UPR組分/調(diào)節(jié)物。在缺乏誘導(dǎo)物(例如四環(huán)素或強(qiáng)力霉素)時(shí)，tetR-VP 16融和蛋白結(jié)合至TRE，并因此活化報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。在Tet-on體系的另一個(gè)形式中，調(diào)節(jié)盒編碼了包含與HSV VP 16激活結(jié)構(gòu)域融合的突變Tet阻遏物(rtetR)的雜合蛋白。rtetR是反Tet阻遏物，其在誘導(dǎo)物(例如四環(huán)素或強(qiáng)力霉素)存在時(shí)結(jié)合至并且激活TRE。
蛻皮素體系基于果蠅(Drosophila)中的蛻皮誘導(dǎo)體系。在一個(gè)形式中，該體系包括編碼功能性蛻皮素受體的調(diào)節(jié)盒以及包含有效地連接至報(bào)告基因的蛻皮素響應(yīng)啟動(dòng)子的報(bào)告盒。在誘導(dǎo)物(如松甾酮A或muristerone A)存在時(shí)，蛻皮素受體結(jié)合至蛻皮素響應(yīng)啟動(dòng)子，激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。
雷帕霉素體系，也稱作CID體系(“二聚化的化學(xué)誘導(dǎo)物”)，使用兩種嵌合蛋白。第一種嵌合蛋白包括與結(jié)合至DNA響應(yīng)元件的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的FKBP 12。第二種嵌合蛋白包括與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合的FRAP。添加雷帕霉素引起兩種嵌合蛋白二聚化，因此激活受DNA響應(yīng)元件控制的基因表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中所用的重組表達(dá)盒包含SEQ ID NO5。SEQID NO5的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非剪接的人XBP1 mRNA。ER應(yīng)激活化IRE1，這將內(nèi)含子從非剪接的mRNA中切下。經(jīng)剪接mRNA的翻譯產(chǎn)生成熟且具有功能性的XBP1蛋白，其氨基酸序列在SEQ ID NO6中描述。
在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中所用重組表達(dá)盒包含SEQ ID NO7。SEQID NO7不包括任何可切割的內(nèi)含子序列。SEQ ID NO7的表達(dá)產(chǎn)生成熟和具有功能性的人XBP1蛋白(SEQ ID NO6)。還可以使用編碼SEQ IDNO6或其功能等同物的其它核酸序列以便產(chǎn)生本發(fā)明的重組表達(dá)盒。這些核酸序列可以包含或不包含內(nèi)含子或其它可移去的序列。
仍在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中所用重組表達(dá)盒包含SEQ ID NO8。SEQID NO8的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生人ATF6蛋白，其氨基酸序列在SEQ ID NO9中顯示。
在又一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明中所用重組表達(dá)盒包含了編碼SEQ ID NO9的氨基酸殘基1-366的核酸序列。此核酸序列的實(shí)例是SEQ ID NO8的核苷酸1-1098。SEQ ID NO9的氨基酸殘基1-366包括人ATF6蛋白的完整堿性區(qū)域和大部分亮氨酸拉鏈區(qū)域。已經(jīng)證實(shí)此ATF6片段能夠活化內(nèi)源GRP78基因。見(jiàn)Haze等，MOL.BIOL.CELL，103787-3799(1999)。
還可以在本發(fā)明中使用編碼自非人物種衍生的XBP1或ATF6蛋白的重組盒。例如，可以使用嚙齒類動(dòng)物或其它動(dòng)物物種的XBP1或ATF6蛋白。這些XBP1或ATF6蛋白可以如此加以選擇以致這些蛋白質(zhì)與目的蛋白質(zhì)的共表達(dá)改進(jìn)了宿主細(xì)胞中的目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。
重組表達(dá)盒可以通過(guò)多種方法引入宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組表達(dá)盒通過(guò)使用轉(zhuǎn)染載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)載體導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞。適合于此目的的載體包括，但不限于，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體(例如桿狀病毒表達(dá)載體)或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。這些載體可以自多種來(lái)源如附加體、粘粒、病毒或其組合衍生。在多數(shù)情況下，這些載體包括可選擇標(biāo)記以便促進(jìn)它們引入宿主細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明中所用重組表達(dá)盒通過(guò)修飾宿主細(xì)胞中的內(nèi)源基因構(gòu)建。內(nèi)源性基因可以編碼目的蛋白質(zhì)或UPR組分/調(diào)節(jié)物?？梢孕揎梼?nèi)源性基因中的許多部分以實(shí)現(xiàn)所需要的表達(dá)或調(diào)節(jié)效果。例如，內(nèi)源性基因的原始啟動(dòng)子可以由病毒啟動(dòng)子替換以提高基因表達(dá)水平。
可以將重組表達(dá)盒以多種形式引入宿主細(xì)胞。例如，可以將重組表達(dá)盒整合至宿主細(xì)胞的染色體或基因組。重組表達(dá)盒還可以由宿主細(xì)胞中的非整合性表達(dá)載體攜帶。用于將表達(dá)載體或表達(dá)盒穩(wěn)定地或瞬時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知。在一個(gè)實(shí)例中，將表達(dá)載體或表達(dá)盒通過(guò)定向整合導(dǎo)入宿主細(xì)胞染色體。適合于此目的的方法包括，但不限于，Cre-/ox重組體系和在美國(guó)專利號(hào)6,656,727、6,537,542和6,541,231中所描述的那些重組體系。
在眾多實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因工程化細(xì)胞包括(1)編碼目的蛋白質(zhì)的第一重組表達(dá)盒和(2)編碼UPR組分/調(diào)節(jié)物(例如XBP1或ATF6)第二重組表達(dá)盒。第一重組表達(dá)盒總數(shù)對(duì)第二重組表達(dá)盒總數(shù)的比率范圍在細(xì)胞中可以是，不限于，例如從不超過(guò)0.1∶1至至少10∶1。合適比例的非限制性實(shí)例包括從0.2∶1至5∶1、從0.5∶1至5∶1、從1∶1至2∶1、從1∶1至3∶1、從1∶1至4∶1、從1∶1至5∶1、從2∶1至3∶1、從2∶1至4∶1以及從2∶1至5∶1。第一重組表達(dá)盒和第二重組表達(dá)盒可以由相同或不同載體攜帶并且由具有相同或不同強(qiáng)度的相同或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在一個(gè)例子中，第一重組表達(dá)盒中的啟動(dòng)子具有與第二重組表達(dá)盒中的啟動(dòng)子相同或相似的強(qiáng)度，并且第一重組盒總數(shù)對(duì)第二重組盒總數(shù)的比率范圍在細(xì)胞中是至少1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1或更多。
適合本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞如細(xì)胞系或者原代培養(yǎng)物。它們還可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞。選擇合適宿主細(xì)胞和方法用于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)大、篩選、產(chǎn)生和純化產(chǎn)物在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中所用的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)例包括，但不限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞、CV-1細(xì)胞和其它由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Virginia)收集的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。在某些情況下，希望在常常為表達(dá)蛋白質(zhì)提供所需要的翻譯后修飾的人細(xì)胞中產(chǎn)生治療性或預(yù)防性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中所用的宿主細(xì)胞還可以是通過(guò)兩種或多種細(xì)胞融合所產(chǎn)生的雜交細(xì)胞。在多種情況下，本發(fā)明中所用的雜交細(xì)胞通過(guò)融合動(dòng)物細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)和癌細(xì)胞/永生細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞或胚細(xì)胞瘤細(xì)胞)產(chǎn)生。動(dòng)物細(xì)胞和癌細(xì)胞/永生細(xì)胞可以源自相同物種。它們還可以源自不同物種?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的產(chǎn)生雜合細(xì)胞的任意方法。這些方法包括，但不限于，電融合或化學(xué)融合(例如聚乙二醇融合)。
重組表達(dá)盒可以先于或后于融合事件導(dǎo)入或引入雜交細(xì)胞。例如，編碼目的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒可以先于哺乳動(dòng)物細(xì)胞與表達(dá)外源UPR組分或調(diào)節(jié)物的癌細(xì)胞融合之前引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于另一種情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以首先用編碼目的蛋白質(zhì)以及UPR組分或調(diào)節(jié)物的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)并且隨后與癌細(xì)胞融合。還可以使用其它方法以制備本發(fā)明的雜交細(xì)胞。
在眾多實(shí)施方案中，用于制備雜交細(xì)胞的癌細(xì)胞/永生細(xì)胞對(duì)一種或多種選擇劑敏感。例如，癌細(xì)胞/永生細(xì)胞可以對(duì)含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的已知為“HAT”培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感。將這些HAT敏感細(xì)胞與對(duì)HAT培養(yǎng)基不敏感的細(xì)胞融合。將如此產(chǎn)生的雜交細(xì)胞進(jìn)行殺死非融合細(xì)胞的HAT選擇。隨后對(duì)所需要的特征篩選融合細(xì)胞。
本發(fā)明還描述了包含本發(fā)明真核宿主細(xì)胞的動(dòng)物或植物。用于將重組細(xì)胞引入動(dòng)物或植物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。在眾多實(shí)施方案中，動(dòng)物或植物是包含編碼目的蛋白質(zhì)和UPR組分/調(diào)節(jié)物的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是非人動(dòng)物。
本發(fā)明還描述了以編碼(1)目的蛋白質(zhì)和(2)UPR組分/調(diào)節(jié)物的一種或多種表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染或所轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)物、植物細(xì)胞培養(yǎng)物或適用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的其它培養(yǎng)物。可以瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所用表達(dá)載體包含編碼目的蛋白質(zhì)的第一重組表達(dá)盒和編碼UPR組分/調(diào)節(jié)物(例如XBP1或ATF6)的第二重組表達(dá)盒。第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒可以由相同或不同載體攜帶。它們可以由相同或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。第一重組表達(dá)盒對(duì)第二重組表達(dá)盒的摩爾比范圍可以是例如從不超過(guò)0.1∶1至至少10∶1。
在一個(gè)實(shí)例中，第一啟重組盒所用的啟動(dòng)子可以具有與第二重組盒所用啟動(dòng)子相同或相似的強(qiáng)度，并且第一重組盒對(duì)第二重組盒的摩爾比范圍在細(xì)胞培養(yǎng)物中可以是從0.5∶1至10∶1，如至少1∶1、2∶1.3∶1、4∶1、5∶1或更高。
D.藥物組合物由本發(fā)明產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)或預(yù)防性蛋白質(zhì)可以用于制備藥物組合物以治療需要它的患者或動(dòng)物。本發(fā)明的藥物組合物通常包含有效量的治療性或預(yù)防性蛋白質(zhì)以及可藥用載體。合適的可藥用載體包括與藥物施用兼容的溶劑、增溶劑、填料、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質(zhì)、緩沖劑、潤(rùn)滑劑、受控釋放載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤(rùn)劑、潤(rùn)滑劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑或抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。此類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。輔助劑也可以引入組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可以制劑為與其預(yù)期的施用途徑兼容。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、吸入、經(jīng)皮、直腸、經(jīng)粘膜、局部和全身性施用。在一個(gè)實(shí)例中，施用通過(guò)植入物進(jìn)行。
用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可以包含如下組分無(wú)菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成性溶劑；抗菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)整張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。pH可以用酸或堿如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可以在安瓿內(nèi)、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶?jī)?nèi)封裝。
本發(fā)明的藥物組合物還可以向患者以需要的劑量施用。合適劑量的范圍可以例如是從5mg至100mg、從15mg至85mg、從30mg至70mg或者從40mg至60mg。也可以使用低于5mg或高于100mg的劑量。藥物組合物可以以一個(gè)劑量或多個(gè)劑量施用。劑量可以間隔性施用，如每日一次、每周一次或每月一次。
治療性蛋白質(zhì)的毒性和治療效果可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型中確定。例如，LD50(對(duì)50％群體致死的劑量)和ED50(50％群體中治療有效的劑量)可以得到測(cè)定。毒性效應(yīng)和治療效應(yīng)之間的劑量比率是治療指數(shù)，并且可以表述為L(zhǎng)D50/ED50比率。在多數(shù)情況下，選擇顯示出大治療指數(shù)的治療性蛋白質(zhì)。
自細(xì)胞培養(yǎng)物分析和動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于制訂在人中使用的劑量范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量是在至少50％群體內(nèi)表現(xiàn)治療有效性并具有少量毒性或無(wú)毒性的范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)根據(jù)所采用劑量形式和所使用的施用途徑變化。用于施用本發(fā)明所產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)的劑量方案可以由住院醫(yī)生基于多種因素確定，如蛋白質(zhì)的作用、病理部位、疾病嚴(yán)重度、患者年齡、性別和飲食、任意感染的嚴(yán)重度、施用時(shí)間和其它臨床因素。在一個(gè)例子中，全身施用或注射施用以最小有效的劑量開(kāi)始，并且該劑量隨著事先選擇的時(shí)間過(guò)程提高直至觀察到陽(yáng)性效果。隨后，使劑量的遞增量限于在效果上產(chǎn)生相應(yīng)增加的水平，同時(shí)考慮可能出現(xiàn)的任何有害效應(yīng)。
治療進(jìn)展可以通過(guò)定期評(píng)估疾病進(jìn)展進(jìn)行監(jiān)測(cè)。治療進(jìn)展可以例如通過(guò)X射線、MRI或其它成像方法、滑液分析或臨床檢驗(yàn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
治療性或預(yù)防性目的蛋白質(zhì)還可以通過(guò)使用基因送遞載體引入人或動(dòng)物。適合于此目的的載體包括，但不限于，病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒、甲病毒、星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、痘病毒或披膜病毒載體。脂質(zhì)體包裹的表達(dá)載體也可以用于基因送遞。在眾多實(shí)施方案，基因送遞載體既編碼目的蛋白質(zhì)又編碼UPR調(diào)節(jié)物。UPR調(diào)節(jié)物的共表達(dá)增強(qiáng)目的蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞或其它功能紊亂的細(xì)胞)內(nèi)的產(chǎn)生。目的蛋白質(zhì)和UPR調(diào)節(jié)物還可以通過(guò)使用不同載體送遞至靶細(xì)胞?；蛩瓦f可以在體內(nèi)(in vivo)或在體外(ex vivo)實(shí)施。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞特異性基因送遞方法可用于導(dǎo)入治療性/預(yù)防性目的蛋白質(zhì)或UPR調(diào)節(jié)物至靶細(xì)胞內(nèi)。本領(lǐng)域內(nèi)已知的眾多細(xì)胞特異性基因送遞方法可用于本發(fā)明。例如，細(xì)胞特異性配體(例如對(duì)靶細(xì)胞表面抗原特異的抗體)可以引入或綴合于編碼治療性/預(yù)防性目的蛋白質(zhì)或UPR調(diào)節(jié)物的病毒載體的包膜。該配體可以介導(dǎo)病毒載體進(jìn)入特定細(xì)胞類型?？贵w綴合的脂質(zhì)體也可以用于送遞基因治療載體至特定靶細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)理解如上所述的實(shí)施方案和如下的實(shí)施例僅以說(shuō)明方式給出，并不用于限制。本發(fā)明范圍內(nèi)的多種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言從本描述中將是顯而易見(jiàn)的。
E.實(shí)施例實(shí)施例1.COS-1和DUKX細(xì)胞系
COS-1細(xì)胞自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)Manassas，VA得到，ATCC編號(hào)是CRL-1650。CHO DUKX細(xì)胞和PA DUKX細(xì)胞均衍生自作為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞衍生物的CHO-K1(ATCC編號(hào)CCL-61)。
CHO DUXK細(xì)胞，也稱作DUXK B11或DXB11細(xì)胞，在參與DNA復(fù)制的重要酶二氫葉酸還原酶(dhfr)的產(chǎn)生上缺陷。為選擇兩個(gè)dhfr等位基因均突變的細(xì)胞，Urlaub和Chasin，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.，774216-4220(1980)實(shí)施了兩步驟的誘變和選擇。所用抗dhfr+細(xì)胞的選擇劑是氚化脫氧尿苷。氚化脫氧尿苷因其摻入DNA并且隨后發(fā)生放射性降解而毒害細(xì)胞。脫氧尿苷對(duì)DNA的摻入需要將脫氧尿苷轉(zhuǎn)換為thymidilicacid，這是必需DHFR的過(guò)程。Dhfr-突變細(xì)胞不能將脫氧尿苷摻入其DNA并且因此能夠在氚化脫氧尿苷存在下存活。某些dhfr+細(xì)胞以及在某些對(duì)脫氧尿苷摻入DNA所需要的酶缺陷的突變體也可以存活。Dhfr-突變體因其不能進(jìn)行重新合成甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷而不同，并且它們需要用于生長(zhǎng)的外源核苷。
在如Urlaub和Chasin等所用的第一步選擇中，將野生型細(xì)胞進(jìn)行甲磺酸乙酯(EMS)誘變并且在dhfr抑制性氨甲喋呤(MTX)存在時(shí)用氚化脫氧尿苷進(jìn)行選擇以便分離推定的雜合子(d+/d-)。通過(guò)使用足以使雜合子(d+/d-)而非純合子(d+/d+)中全部DHFR失活的MTX濃度，純合子具有殘余DHFR活性并且摻入氚化脫氧尿苷。通過(guò)這種摻入，對(duì)(d+/d+)細(xì)胞進(jìn)行選擇并且僅雜合子能夠存活。三輪選擇、匯集和擴(kuò)充仍存活的細(xì)胞后，分離了推定的雜合子細(xì)胞系UKB25。UKB25細(xì)胞進(jìn)一步以γ照射誘變并在缺乏MTX的氚化脫氧尿苷中選擇。存活的集落表現(xiàn)對(duì)甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷的三重輔源營(yíng)養(yǎng)性，顯示出dhfr-表型。將顯示此三重輔源營(yíng)養(yǎng)性的集落加以克隆并證實(shí)dhfr活性缺陷。通過(guò)Southern印跡雜交對(duì)這樣一個(gè)克隆的分析表明dhfr基因沒(méi)有發(fā)生任何總體重排。將此克隆命名為DXB11。
對(duì)如此產(chǎn)生的DXB11細(xì)胞檢查以證實(shí)細(xì)胞系預(yù)期特征。發(fā)現(xiàn)DUKXB11細(xì)胞在遺傳上與衍生它們的CHO-K1細(xì)胞系相似。它們是亞二倍體CHO細(xì)胞，具有細(xì)胞遺傳學(xué)上已經(jīng)廣泛研究的20條染色體。分裂中期DUKX B11染色體的姬姆薩帶表明DUKX B11細(xì)胞是CHO-K1衍生物。DUKX B11細(xì)胞具有DHFR缺陷并且因此對(duì)甘氨酸、嘌呤核苷和胸苷的三重輔源營(yíng)養(yǎng)性。DUKX B11細(xì)胞的這種DHFR缺陷表型是對(duì)轉(zhuǎn)移重組異源蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒至細(xì)胞的遺傳選擇基礎(chǔ)。
在一些實(shí)驗(yàn)中，用于培養(yǎng)DUKX B11細(xì)胞的培養(yǎng)基不含次黃嘌呤或胸苷。由于沒(méi)有二氫葉酸還原酶活性，細(xì)胞存活和復(fù)制的唯一手段是通過(guò)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充核苷以彌補(bǔ)細(xì)胞不能產(chǎn)生它們的能力。因此，將腺苷、脫氧腺苷和胸苷添加至用于DUKX B11細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。這些核苷均以10μg/ml的濃度添加。該濃度超過(guò)在常規(guī)小規(guī)模生長(zhǎng)條件下細(xì)胞的需要。
DUKX B11細(xì)胞用于導(dǎo)入含有用于所需要蛋白質(zhì)的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒。因?yàn)镈UKX B11細(xì)胞缺乏內(nèi)源DHFR活性，故DHFR活性可以在生成旨在產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的細(xì)胞系時(shí)作為選擇標(biāo)記和可擴(kuò)增標(biāo)記使用。通過(guò)共轉(zhuǎn)染含有用于dhfr的cDNA的另一種表達(dá)載體，或通過(guò)將dhfr cDNA在相同表達(dá)載體上置于目的cDNA附近，可以利用dhfr活性作為細(xì)胞已經(jīng)攝取含有所需要基因的表達(dá)質(zhì)粒的標(biāo)志，并且可以產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)染后通過(guò)維持外源核苷，僅引入含有dhfr基因的細(xì)胞才能夠產(chǎn)生dhfr并因此存活。存活的細(xì)胞現(xiàn)在可以產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。當(dāng)目的cDNA和dhfr在相同質(zhì)粒上時(shí)，這可以借助雙順?lè)醋有攀箤?shí)現(xiàn)，或當(dāng)基因位于不同質(zhì)粒上時(shí)，這可以通過(guò)各自信使實(shí)現(xiàn)，質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染事件期間通常共定位在染色體上。當(dāng)使用兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒時(shí)，改變含有dhfr的質(zhì)粒對(duì)含有cDNA的質(zhì)粒的比率可以增強(qiáng)人們選擇含有兩種質(zhì)粒的細(xì)胞的能力。
DUKX B11細(xì)胞由于dhfr基因中的點(diǎn)突變具有dhfr缺陷，并且因此可以回復(fù)突變?yōu)閐hfr+表型。在進(jìn)行無(wú)血清懸浮適應(yīng)期間觀察到此回復(fù)突變和在無(wú)外源核苷時(shí)生長(zhǎng)的能力。培養(yǎng)中的DUKX細(xì)胞群體對(duì)從懸浮培養(yǎng)開(kāi)始大約154次累計(jì)群體加倍(CPD)時(shí)仍保持dhfr-。然而，當(dāng)在190 CPD再檢查群體對(duì)外源核苷的依賴性時(shí)，表型回復(fù)突變明顯。與dhfr+表型同時(shí)出現(xiàn)的是細(xì)胞平均生長(zhǎng)速度的顯著增加。由于dhfr-表型是轉(zhuǎn)染和基因擴(kuò)增策略所需要的，故在153.8 CPD后，進(jìn)行已適應(yīng)的DUKX細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)。因?yàn)檫@些細(xì)胞適應(yīng)于在導(dǎo)入表達(dá)載體前生長(zhǎng)在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)物內(nèi)，故將它們稱作“預(yù)適應(yīng)的(pre-adapted)”，并且叫做“PA DUKX”。
FBS依賴的非適應(yīng)性DUKX單層可以用于轉(zhuǎn)染表達(dá)載體。在獲得異源基因和dhfr的表達(dá)后，每一新細(xì)胞系可以適應(yīng)無(wú)FBS的懸浮生長(zhǎng)。使用單層細(xì)胞轉(zhuǎn)染后適應(yīng)期往往冗長(zhǎng)?！邦A(yù)適應(yīng)的”DUKX細(xì)胞還可以作為用于轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞使用。這些PA DUKX細(xì)胞經(jīng)常提供來(lái)自時(shí)間和工作量方面的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檗D(zhuǎn)染后再適應(yīng)無(wú)血清懸浮生長(zhǎng)的時(shí)間通常較短。見(jiàn)Sinacore等，BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，52518-528(1996)。
實(shí)施例2.通過(guò)BMP 6的過(guò)量表達(dá)在PA DUKX細(xì)胞中誘導(dǎo)ER應(yīng)激將pSMED2/XBP1和pSMED2/BMP6(+)或空的pSMED2載體(-)共轉(zhuǎn)染入PA DUKX細(xì)胞。pSMED2/XBP1和pSMED2/BMP6表達(dá)載體分別編碼XBP1和BMP6。兩種載體均受CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。轉(zhuǎn)染使用Fugene6(Roche，Indianapolis，DSf)在6孔平板中進(jìn)行。細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是補(bǔ)加核苷和(熱滅活且透析的)10％FBS以及青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺(Gibco)的Alpha培養(yǎng)基(Gibco)。
細(xì)胞在添加400mM NaCl和1 Complete Mini(來(lái)自Roche，Indianapolis，IN的蛋白酶抑制劑混合物片劑)的細(xì)胞裂解緩沖液(CellSignaling Technology，Beverly，MA)中裂解。裂解物在轉(zhuǎn)染后7、24、31和48小時(shí)獲取并在10％tricine凝膠上電泳，隨后是Western印跡分析(圖1)。Western印跡分析通過(guò)使用TBS中4％脫脂乳、1％BSA和0.1％Tween20的封閉緩沖液和TBS中的0.1％Tween20的洗滌緩沖液進(jìn)行。將抗體在封閉緩沖液內(nèi)稀釋。用于Western的滴定是1∶1000抗XBP1(Santa CruzBiotechnology)，隨后1∶5000辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗兔抗體(TheJackson Laboratory)。圖1顯示BMP6在PA DUKX細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)引起ER應(yīng)激，如測(cè)量到XBP1p蛋白(大約54kD)增加。
實(shí)施例3.以XBP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系將pSMED2/XBP1載體轉(zhuǎn)化至CHO DUKX細(xì)胞以產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。在pSMED2載體上的DFHR基因允許氨甲喋呤(MTX)抗性。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在5、10或20nM MTX濃度中接種。分離了三個(gè)5nM MTX集落(5-2、5-4、5-5)、一個(gè)10nM集落(10-3)和一個(gè)20nM集落(20-10)。來(lái)自每一集落的細(xì)胞用(+)或不用(-)已知導(dǎo)致ER應(yīng)激的化學(xué)品tunacymicin(Tu)處理。將裂解物在10％tricine凝膠上電泳，隨后使用兔抗-XBP1多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)進(jìn)行Western印跡分析(圖2)。圖2顯示當(dāng)細(xì)胞因Tu處理應(yīng)激時(shí)更多成熟的XBP1在XBP1穩(wěn)定性細(xì)胞系中產(chǎn)生。
將pSMED2/BMP6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入XBP1穩(wěn)定性細(xì)胞系(5-2，5-4和20-10)和親代(CHO DUKX)細(xì)胞系。將轉(zhuǎn)染后48小時(shí)所收集的條件培養(yǎng)基在10％tricine凝膠上電泳，隨后進(jìn)行Western印跡分析。Western印跡膜(圖3)用與BMP6強(qiáng)烈交叉反應(yīng)的小鼠抗BMP5單克隆抗體(1∶2000)探測(cè)。二級(jí)抗體是辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗小鼠抗體(1∶5000)(The JacksonLaboratory)。圖3中每一泳道代表對(duì)各自細(xì)胞系的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。如圖3中所示，以5nM和10nM MTX選擇的XBP1穩(wěn)定性細(xì)胞系中比親代細(xì)胞中分泌更多BMP6。
還將編碼IL11RFc蛋白的pSMED2/IL11RFc瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至XBP1穩(wěn)定性細(xì)胞系和親代細(xì)胞系。將轉(zhuǎn)染后48小時(shí)所收集的條件培養(yǎng)基在10％tricine凝膠上電泳，隨后進(jìn)行Western印跡分析。Western印跡膜(圖4)用辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗人Fc抗體(The Jackson Laboratory)。在大部分的用5nM MTX所選擇的XBP1細(xì)胞系中比CHO DUKX細(xì)胞中分泌更多IL11RFc。
實(shí)施例4.比較XBP1穩(wěn)定性細(xì)胞系和它們的親代CHO細(xì)胞間的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)錄效率和翻譯效率。
將5-2、20-10和CHO DUKX細(xì)胞計(jì)數(shù)并且將等量細(xì)胞以編碼綠色熒光蛋白(GFP)的構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞在10×10放大倍率下觀察并且通過(guò)每一細(xì)胞系在三個(gè)視野內(nèi)比較GFP熒光細(xì)胞與總細(xì)胞而測(cè)定轉(zhuǎn)染效率(％表達(dá)GFP的細(xì)胞)。比較結(jié)果顯示GFP轉(zhuǎn)染效率在所測(cè)試的全部XBP1和CHO DUKX細(xì)胞系中相似(圖5)。
在又一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將編碼GFP(+)或不編碼GFP(-)的構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至XBP1穩(wěn)定性細(xì)胞系和親代細(xì)胞系。將轉(zhuǎn)染后48小時(shí)所收集的細(xì)胞裂解物在10％tricine凝膠上電泳，隨后進(jìn)行Western印跡分析(圖6)。圖6中的每一泳道代表獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。Western印跡膜用兔抗GFP多克隆抗體以及用于載量對(duì)照的小鼠抗肌動(dòng)蛋白單克隆抗體探測(cè)。如圖6顯示，對(duì)GFP的轉(zhuǎn)錄效率和翻譯效率總量在所研究的全部細(xì)胞系中相似。
實(shí)施例5.用ATF6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將加Flag標(biāo)簽的來(lái)自ATF6可溶性活化結(jié)構(gòu)域的cDNA克隆至Tet/關(guān)閉誘導(dǎo)型表達(dá)載體ptTATOP6并且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入COS-1細(xì)胞。ptTATOP6載體包括了控制包含ATF6和Flag標(biāo)簽的融和蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。將轉(zhuǎn)染后18、48和60小時(shí)所收集的細(xì)胞裂解物在10％tricine凝膠上電泳，隨后進(jìn)行Western印跡分析。Western印跡膜(圖7)用抗flag抗體探測(cè)?！癡”表示空的ptTATOP6載體，并且“P”代表flag陽(yáng)性對(duì)照。如圖7顯示，ATF6蛋白在缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)在COS-1細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。
實(shí)施例6.正確比率的靶基因與XBP1或ATF6在HEK293細(xì)胞中的共表達(dá)增強(qiáng)靶基因分泌HEK293-FT和HEK293-EBNA在具有5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中在37℃于補(bǔ)加5％胎牛血清的free-style293培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)內(nèi)生長(zhǎng)和維持。
瞬時(shí)表達(dá)在50ml旋轉(zhuǎn)器或24孔平板或1L旋轉(zhuǎn)器內(nèi)實(shí)施。對(duì)50ml(或1L)的培養(yǎng)體積，將25μg(或?qū)?L用0.5mg)質(zhì)粒DNA與400μg(對(duì)1L用8mg)聚乙烯亞胺(PEI，25kDa，線性、用HCl中和至pH7.0，1mg/ml，Polysciences，Warrington，PA)在2.5ml(對(duì)1L用50ml)無(wú)血清293培養(yǎng)基中混合。收獲前旋轉(zhuǎn)器在37℃于P2005 Stirrer(Bellco)上以每分鐘170轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)速率溫育72-144小時(shí)。對(duì)24孔平板，將1μg DNA與8μgPEI在0.5ml無(wú)血清293培養(yǎng)基中混合。隨后將混合物與在具有10％FBS的293培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞密度0.5×106個(gè)細(xì)胞/ml的0.5ml HEK293細(xì)胞混合。收獲前平板在37℃在定軌搖床(BeIlCo)以每分鐘300的轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)速率溫育72小時(shí)。
pSMED2和pSMEDA用于DNA構(gòu)建。將C端加His6標(biāo)簽的分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(sFRP-1)和C端加Flag標(biāo)簽的aggrecanase-2(Agg-2)亞克隆至pSMEDA。將C端加His6標(biāo)簽的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激酶受體2型(TrkB)亞克隆至pSMED2。這些亞克隆的基因沒(méi)有任何跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域，因此允許所表達(dá)產(chǎn)物分泌。
將C端加His6標(biāo)簽的Prop1和Prop34-LBD亞克隆至pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)。Prop1和Prop34-LBD衍生自低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)，具有缺失的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域。Prop1和Prop34-LBD的氨基酸序列分別在SEQ ID NO10和11中描述。SEQ IDNO10包括在氨基酸342-347的His6標(biāo)簽和在氨基酸348-356的Flag標(biāo)簽。SEQ ID NO11括在氨基酸795-800的His6標(biāo)簽和在氨基酸778-794的V5標(biāo)簽。
將1μg的pcDNA3.1中的Prop1-his6-Flag與0.3μg(1∶3)或1μg(1∶1)的pSMED2載體中的XBP1p共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。pcDNA3.1和pSMED2均由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。條件培養(yǎng)基在DNA轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收獲。樣品通過(guò)SDS-PAGE分離并且用抗His4抗體進(jìn)行免疫印跡。進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)(組#1和組#2)。如圖8A中所示，XBP1與Prop1以1∶1或1∶3比率共轉(zhuǎn)染顯著地提高Prop1表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將1μg的pcDNA3.1中的Prop34-LBD-V5-his6與0.3μg(1∶3)或1μg(1∶1)的ptTATOP6載體中的ATF6共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。如同pSMED2，ptTATOP6也由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。條件培養(yǎng)基在DNA轉(zhuǎn)染后72小時(shí)通過(guò)SDS-PAGE分析并且用抗His4抗體進(jìn)行免疫印跡。圖8B中顯示ATF6與Prop34-LBD-V5-his6以1∶1或1∶3比率共轉(zhuǎn)染顯著地增強(qiáng)Prop34-LBD表達(dá)。
圖9顯示XBP1p或ATF6對(duì)不同靶蛋白表達(dá)的影響。將pcDNA3.1中的Prop1-his6-Flag或Prop34-LBD-V5-His6與pSMED2載體中的XBP1p或ptTATOP6載體中的ATF-6共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。條件培養(yǎng)基在DNA轉(zhuǎn)染后72小時(shí)通過(guò)SDS-PAGE分析并且用抗His4抗體進(jìn)行免疫印跡。信號(hào)通過(guò)密度計(jì)定量如圖9中所示。結(jié)果表明XBP1p和ATF-6對(duì)Prop1和Prop34-LBD的表達(dá)具有不同影響。還觀察到當(dāng)TrkB、sFRP-1和Agg-2與XBP1p和ATF-6共表達(dá)時(shí)，XBP1p和ATF-6對(duì)這些蛋白質(zhì)不同的增強(qiáng)效果。例如，與XBP1p的共表達(dá)提高TrkB產(chǎn)率大約5倍，與此同時(shí)當(dāng)TrkB與ATF6共表達(dá)時(shí)僅觀察到提高大約兩倍。
本發(fā)明的上述描述提供示例和描述，但不打算是排他性的或?qū)⒈景l(fā)明限于所公開(kāi)的具體之一。符合以上教導(dǎo)的修改和變化可能或可以從本發(fā)明的實(shí)踐中獲得。因此應(yīng)當(dāng)指出的是本發(fā)明范圍由權(quán)利要求書和它們的等同物定義。
序列表<110>惠氏公司<120>用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的體系和方法<130>031896-085001(AM101741)<150>US 60/606,439<151>2004-09-02<160>11<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>哺乳動(dòng)物<220>
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<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n為a，c，g，或t<400>211attggnccac g<210>3<211>8<212>DNA<213>哺乳動(dòng)物
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Leu Val Trp Arg Asp Leu Asp Asn Pro Arg Ser Leu Ala Leu Asp Pro145 150 155 160Thr Lys Gly Tyr Ile Tyr Trp Thr Glu Trp Gly Gly Lys Pro Arg Ile165 170 175Val Arg Ala Phe Met Asp Gly Thr Asn Cys Met Thr Leu Val Asp Lys180 185 190Val Gly Arg Ala Asn Asp Leu Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Gln Arg Leu195 200 205Tyr Trp Thr Asp Leu Asp Thr Asn Met Ile Glu Ser Ser Asn Met Leu210 215 220Gly Gln Glu Arg Val Val Ile Ala Asp Asp Leu Pro His Pro Phe Gly225 230 235 240Leu Thr Gln Tyr Ser Asp Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Trp Asn Leu His245 250 255Ser Ile Glu Arg Ala Asp Lys Thr Ser Gly Arg Asn Arg Thr Leu Ile260 265 270Gln Gly His Leu Asp Phe Val Met Asp Ile Leu Val Phe His Ser Ser275 280 285Arg Gln Asp Gly Leu Asn Asp Cys Met His Asn Asn Gly Gln Cys Gly290 295 300Gln Leu Cys Leu Ala Ile Pro Gly Gly His Arg Cys Gly Cys Ala Ser305 310 315 320His Tyr Thr Leu Asp Pro Ser Ser Arg Asn Cys Ser Pro Pro Thr Thr325 330 335Phe Leu Leu Phe Ser Gln Lys Ser Ala Ile Ser Arg Met Ile Pro Asp340 345 350
Asp Gln His Ser Pro Asp Leu Ile Leu Pro Leu His Gly Leu Arg Asn355 360 365Val Lys Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Asp Lys Phe Ile Tyr Trp Val370 375 380Asp Gly Arg Gln Asn Ile Lys Arg Ala Lys Asp Asp Gly Thr Gln Pro385 390 395 400Phe Val Leu Thr Ser Leu Ser Gln Gly Gln Asn Pro Asp Arg Gln Pro405 410 415His Asp Leu Ser Ile Asp Ile Tyr Ser Arg Thr Leu Phe Trp Thr Cys420 425 430Glu Ala Thr Asn Thr Ile Asn Val His Arg Leu Ser Gly Glu Ala Met435 440 445Gly Val Val Leu Arg Gly Asp Arg Asp Lys Pro Arg Ala Ile Val Val450 455 460Asn Ala Glu Arg Gly Tyr Leu Tyr Phe Thr Asn Met Gln Asp Arg Ala465 470 475 480Ala Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Leu485 490 495Phe Thr Thr Gly Leu Ile Arg Pro Val Ala Leu Val Val Asp Asn Thr500 505 510Leu Gly Lys Leu Phe Trp Val Asp Ala Asp Leu Lys Arg Ile Glu Ser515 520 525Cys Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ala Asn Ile530 535 540
Val Gln Pro Leu Gly Leu Thr Ile Leu Gly Lys His Leu Tyr Trp Ile545 550 555 560Asp Arg Gln Gln Gln Met Ile Glu Arg Val Glu Lys Thr Thr Gly Asp565 570 575Lys Arg Thr Arg Ile Gln Gly Arg Val Ala His Leu Thr Gly Ile His580 585 590Ala Val Glu Glu Val Ser Leu Glu Glu Phe Ser Ala His Pro Cys Ala595 600 605Arg Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Ile Ala Lys Gly Asp Gly610 615 620Thr Pro Arg Cys Ser Cys Pro Val His Leu Val Leu Leu Gln Asn Leu625 630 635 640Leu Thr Cys Gly Glu Pro Pro Thr Cys Ser Pro Asp Gln Phe Ala Cys645 650 655Ala Thr Gly Glu Ile Asp Cys Ile Pro Gly Ala Trp Arg Cys Asp Gly660 665 670Phe Pro Glu Cys Asp Asp Gln Ser Asp Glu Glu Gly Cys Pro Val Cys675 680 685Ser Ala Ala Gln Phe Pro Cys Ala Arg Gly Gln Cys Val Asp Leu Arg690 695 700Leu Arg Cys Asp Gly Glu Ala Asp Cys Gln Asp Arg Ser Asp Glu Ala705 710 715 720Asp Cys Asp Ala Ile Cys Leu Pro Asn Gln Phe Arg Cys Ala Ser Gly725 730 735Gln Cys Val Leu Ile Lys Gln Gln Cys Asp Ser Phe Pro Asp Cys Ile740 745 750
Asp Gly Ser Asp Glu Leu Met Cys Glu Ile Thr Lys Pro Pro Ser Arg755 760 765Pro Leu Glu Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro770 775 780Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His785 790 795 800
權(quán)利要求
1.動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，其包含一種或多種重組表達(dá)盒，所述重組表達(dá)盒編碼目的蛋白質(zhì)和解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)途徑的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，并且所述的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物是XBP1或ATF6蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，其中所述的一種或多種重組表達(dá)盒包括編碼所述目的蛋白質(zhì)的至少一種重組表達(dá)盒；和編碼所述的XBP1或ATF6蛋白的至少另一種重組表達(dá)盒，并且其中所述至少一種重組表達(dá)盒總數(shù)對(duì)所述至少另一種重組表達(dá)盒總數(shù)的比率在所述細(xì)胞中是從0.5∶1至10∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞，其中所述至少一種重組表達(dá)盒總數(shù)對(duì)所述至少另一種重組表達(dá)盒總數(shù)的比率在所述細(xì)胞中是至少3∶1。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6.轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，其包含如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞與癌細(xì)胞融合所產(chǎn)生的雜交細(xì)胞。
8.動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，其包含一種或多種重組表達(dá)盒，所述重組表達(dá)盒編碼目的蛋白質(zhì)和能夠結(jié)合至所述細(xì)胞的UPR元件(UPRE)或ER-應(yīng)激反應(yīng)元件(ERSE)的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，并且所述多肽包括轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其中所述的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域包含XBP1或ATF6蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。
11.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物，其以一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述表達(dá)載體編碼目的蛋白質(zhì)；和UPR途徑的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物是XBP1或ATF6蛋白，并且所述的一種或多種表達(dá)載體包括編碼所述目的蛋白質(zhì)的至少一種重組表達(dá)盒；和編碼所述XBP1或ATF6蛋白的至少另一種重組表達(dá)盒，并且其中所述至少一種重組表達(dá)盒對(duì)所述至少另一種重組表達(dá)盒的摩爾比率在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中是從0.5∶1至10∶1。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，并且所述至少一種重組表達(dá)盒對(duì)所述至少另一種重組表達(dá)盒的摩爾比率在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中是至少3∶1。
14.包括在動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，所述細(xì)胞包括一種或多種重組表達(dá)盒，所述重組表達(dá)盒編碼所述目的蛋白質(zhì)；和UPR途徑的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，并且所述的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物是XBP1或ATF6蛋白。
16.包括在動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，所述細(xì)胞包括一種或多種重組表達(dá)盒，所述重組表達(dá)盒編碼所述目的蛋白質(zhì)；和能夠結(jié)合至所述細(xì)胞的UPRE或ERSE的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，并且所述多肽包含XBP1或ATF6蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。
18.包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，所述的細(xì)胞培養(yǎng)物以一種或多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述表達(dá)載體包括編碼所述目的蛋白質(zhì)的至少一種重組表達(dá)盒；和編碼UPR途徑組分或非IRE1調(diào)節(jié)物的至少另一種重組表達(dá)盒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，并且所述的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物是XBP1或ATF6蛋白，并且其中所述至少一種重組表達(dá)盒對(duì)所述至少另一種重組表達(dá)盒的摩爾比率在所述細(xì)胞培養(yǎng)物中是從0.5∶1至10∶1。
20.表達(dá)載體，其編碼治療性或預(yù)防性目的蛋白質(zhì)，和UPR途徑的組分或非IRE1調(diào)節(jié)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的體系和方法。本發(fā)明使用具有改良的蛋白質(zhì)折疊或加工能力的基因工程化的動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。在一個(gè)方面，本發(fā)明描述了基因工程化細(xì)胞，其包含編碼(1)目的蛋白質(zhì)和(2)在細(xì)胞解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)途徑中有功能的多肽的一種或多種重組表達(dá)盒。所述多肽的共表達(dá)顯著地提高基因工程化細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。在一個(gè)例子中，基因工程化細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，并且共表達(dá)的多肽是XBP1介導(dǎo)性或ATF6介導(dǎo)性UPR途徑的組分或調(diào)節(jié)物。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101048509SQ200580037014
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月2日
發(fā)明者郜軼潔, N·M·皮什, 耿梅, S·H·埃爾曼, 鐘曉天, R·克里茨, 呂志堅(jiān) 申請(qǐng)人:惠氏公司