專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低豐度低分子量蛋白富集材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及ー種用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的，低豐度低分子量蛋白富集材料的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著群體蛋白質(zhì)組學(xué)概念的提出和其在實(shí)際研究中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用之間的距離將進(jìn)ー步縮短。由于人體體液中因疾病引起的蛋白質(zhì)的含量及種類(lèi)變化是臨床上各種病癥早期診斷及評(píng)價(jià)病情的重要指標(biāo)，因此應(yīng)用現(xiàn)代生物技木，尋找與疾病相關(guān)的特異性蛋白的變化是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。然而，迄今為止能用于常規(guī)臨床檢測(cè)的生物標(biāo)志物還非常的少。理論上，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分子量較大，較難進(jìn)入體液循環(huán)中，而ー些蛋白質(zhì)降解后的片段，卻有可能通過(guò)某種途徑進(jìn)入到體液或血液中。以血清為例，近年來(lái)，血清蛋白質(zhì)組中的低分子量范圍頗受關(guān)注。而質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛使用，又為血清蛋 白質(zhì)組中的低豐度低分子量范圍的研究提供了有效的手段?，F(xiàn)有的針對(duì)低豐度蛋白檢測(cè)的方法都需要使用富集材料將目標(biāo)分析物進(jìn)行富集，再輔以后續(xù)步驟，從而進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。顯然，富集材料的制備及其性能對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)是舉足輕重的。目前，常用的蛋白質(zhì)富集材料是磁性介孔材料，它的缺點(diǎn)主要在于1)在分離過(guò)程中目標(biāo)蛋白容易丟失和被其它高分子量的蛋白酶降解；2)容易受到鹽、表面活性劑等小分子的干擾影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低豐度低分子量蛋白富集材料的制備方法。為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的一種低豐度低分子量蛋白富集材料的制備方法，包括如下步驟
A)將P型摻硼硅片固定在電解池中，按體積比為I:4 6的比例加入こ醇和重量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽(yáng)極，鉬電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，設(shè)定電流強(qiáng)度為0100mA，刻蝕時(shí)間為(Γ15分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用こ醇沖洗干凈后超聲粉碎5 20分鐘，再用氮?dú)獯蹈?，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ；
B)將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理5 20分鐘，形成表面硅氧鍵；
C)將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的硅烷化試劑與有機(jī)溶劑的混合溶液中反應(yīng)I小時(shí)，再在烘箱中110°C干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用こ醇浸泡洗浄；
D)選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環(huán)氧基硅烷化試劑進(jìn)行表面修飾。本發(fā)明在用于蛋白質(zhì)檢測(cè)吋，將本發(fā)明所得的富集材料放置在分離裝置中，來(lái)得到所需的低豐度低分子量蛋白，然后進(jìn)行MALDI-T0F檢測(cè)，獲得高質(zhì)量的肽譜。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
I、本發(fā)明通過(guò)制備多孔硅顆粒達(dá)到ー步分離、富集和檢測(cè)血清樣品中低分子量蛋白的作用。多孔硅的孔徑大小可以通過(guò)電化學(xué)刻蝕條件精確控制，根據(jù)所要篩選的蛋白質(zhì)分子量大小，對(duì)相應(yīng)材料的孔隙率進(jìn)行選擇。通過(guò)表面修飾技術(shù)可以選擇性的捕獲低分子量生物標(biāo)記物，同時(shí)將人血清中含量豐富的高分子量蛋白質(zhì)和蛋白酶排阻在孔道外，防止了低豐度蛋白的降解。多孔硅顆粒的制備條件選擇是該分離材料性能優(yōu)越的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)特征。2、本發(fā)明中材料的孔徑可以根據(jù)待分析目標(biāo)物的大小進(jìn)行隨意調(diào)控，并利用多孔硅表面可進(jìn)行多種化學(xué)修飾，可選擇性地從待測(cè)生物樣品中捕獲某ー種類(lèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)。同時(shí)，可以通過(guò)在各檢測(cè)點(diǎn)內(nèi)修飾不同的基團(tuán)，進(jìn)行一種試樣的多維分析檢測(cè)。3、本發(fā)明中富集后的顆粒進(jìn)行表面清洗后無(wú)需進(jìn)行額外的洗脫除鹽步驟，即可進(jìn)行MALDI-T0F檢測(cè)，獲得高質(zhì)量的肽譜。檢測(cè)后多余的多孔硅顆?？芍苯舆M(jìn)行凝膠電泳分祈，對(duì)感興趣的差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一歩的分離鑒定。避免了樣品多步處理和洗脫過(guò)程所造成 的損失。


圖I是采用本發(fā)明對(duì)1.0 mg · mじ1胰島素樣品經(jīng)過(guò)處理后的MALDI-TOF-MS檢測(cè)
結(jié)果圖。圖2是采用本發(fā)明對(duì)患者血清樣品進(jìn)行直接檢測(cè)MALDI-T0F-MS結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一多孔硅的制備
取P型摻硼硅片(100)晶型，固定在電解池中，加入O. 5mlこ醇，2-3ml質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽(yáng)極，鉬電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，設(shè)定電流強(qiáng)度為l(T80mA，刻蝕時(shí)間為5分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用こ醇沖洗干凈后超聲粉碎15分鐘，再用氮?dú)獯蹈?，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ；
將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理20分鐘，形成表面硅氧鍵；
將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的氨基硅烷化試劑與こ醇溶劑的混合溶液中反應(yīng)I小時(shí)，再在烘箱中110°C干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用こ醇浸泡洗浄；選擇孔徑為10-12nm的多孔硅，用十一碳烯酸進(jìn)行表面修飾。實(shí)施例ニ對(duì)胰島素樣品的處理檢測(cè)
本實(shí)施例以26%孔隙率的經(jīng)過(guò)十一碳烯酸修飾的多孔硅顆粒作為富集材料，對(duì)低濃度的胰島素樣品進(jìn)行直接檢測(cè)，其具體步驟如下
I、樣品吸附
本實(shí)施例的胰島素樣品為醫(yī)用人體注射液，將胰島素注射液用生理緩沖液PBS稀釋成I. O mg · ml/1后作為待測(cè)溶液。吸附取四個(gè)離心管，分別標(biāo)號(hào)1，2，3，4，各加入50 uL待測(cè)溶液，再在離心管2中加入3 mg未刻蝕的硅粉，在離心管3中加入3 mg孔隙率為26%的多孔硅顆粒，在離心管4中加入3 mg經(jīng)過(guò)十一碳烯酸修飾的孔隙率為26%的多孔硅顆粒，四個(gè)離心管在室溫下共同振蕩孵育I h。分離將上述懸濁液靜置2 min,多孔硅顆粒沉降到離心管底部，用移液槍小心移除上清液。2、樣品檢測(cè)
清洗在離心管中加入100 uL清洗緩沖液(O. 2 mmol ·じ1的PB緩沖液)，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心移除上清液。再在離心管中加入100 uL去離子水，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心移除上清液。檢測(cè)將清洗后的多孔硅顆粒用移液槍轉(zhuǎn)移到MALDI靶上，室溫自然干燥，然后將I uL的有機(jī)基質(zhì)溶液(2-氰基-4-羥基肉桂酸，a -CHCA)點(diǎn)覆在顆粒表面，室溫自然干燥；將制備好的樣品送入MALDI-T0F質(zhì)譜儀檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)條件激光波長(zhǎng)337 nm，激光脈沖頻率200 Hz，加速電壓20 kV，檢測(cè)范圍(TlO kD，延遲時(shí)間為220 ns，線性正離子模式檢測(cè)。
回收檢測(cè)完畢后將多孔硅顆粒小心的從MALDI靶上轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白洗脫液(含有體積比為25%的こ腈和75%的三氟こ酸)，振蕩孵育20 min,將顆粒上吸附的蛋白洗脫下來(lái)。將上述懸濁液靜置2 min，用移液槍移除上清液，溶液揮發(fā)后得到的多孔硅顆粒可重新使用。檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖1，圖中，橫坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的質(zhì)核比，縱坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的峰強(qiáng)度。16是樣品溶液用傳統(tǒng)方法直接點(diǎn)覆在MALDI靶板上檢測(cè)得到的，17是樣品經(jīng)過(guò)硅粉吸附后，將硅粉點(diǎn)覆在靶板上檢測(cè)得到的，18是樣品經(jīng)過(guò)多孔硅顆粒富集后，將多孔硅顆粒點(diǎn)覆在靶板上檢測(cè)得到的，19是樣品經(jīng)過(guò)實(shí)施例一的多孔硅顆粒富集后，將多孔硅顆粒點(diǎn)覆在靶板上檢測(cè)得到的。19得到的樣品信號(hào)峰明顯高于傳統(tǒng)方法16。實(shí)施例三對(duì)患者血清樣品的處理檢測(cè)
本實(shí)施例以26%孔隙率的經(jīng)過(guò)十一碳烯酸修飾的多孔硅顆粒作為富集材料，對(duì)患者的血清樣品進(jìn)行直接檢測(cè)和分析，其具體步驟如下
I、樣品吸附
本實(shí)施例的血清樣品從醫(yī)院獲得，血清樣品的制備采用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，其中5-9為直腸癌患者血清，10-14為非癌癥患者血清，制備好的血清樣品儲(chǔ)存在-80で的超低溫冰箱。吸附將的血清樣品用生理緩沖液PBS稀釋10倍后取50 uL加入離心管中，再加入3 mg經(jīng)過(guò)十一碳烯酸修飾的孔隙率為26%的多孔硅顆粒，得到的懸濁液在室溫下振蕩孵育I h。分離將上述懸濁液靜置2 min,多孔硅顆粒沉降到離心管底部，用移液槍小心移除上清液。2、樣品檢測(cè)
清洗在離心管中加入100 uL清洗緩沖液(O. 2 mmol ·じ1的PB緩沖液)，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心地移除上清液。再在離心管中加入100 uL去離子水，渦旋振蕩混勻后將懸濁液靜置2 min，用移液槍小心地移除上清液。檢測(cè)將清洗后的多孔硅顆粒用移液槍轉(zhuǎn)移到MALDI靶上，室溫自然干燥，然后將I uL的有機(jī)基質(zhì)溶液(2-氰基-4-羥基肉桂酸，a -CHCA)點(diǎn)覆在顆粒表面，室溫自然干燥；將制備好的樣品送入MALDI-T0F質(zhì)譜儀檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)條件激光波長(zhǎng)337 nm，激光脈沖頻率200 Hz，加速電壓20 kV，檢測(cè)范圍(TlO kD，延遲時(shí)間為220 ns，線性正離子模式檢測(cè)?；厥諜z測(cè)完畢后將多孔硅顆粒小心的從MALDI靶上轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白洗脫液(含有體積比為25%的こ腈和75%的三氟こ酸)，振蕩孵育20 min,將顆粒上吸附的蛋白洗脫下來(lái)。將上述懸濁液靜置2 min，用移液槍移除上清液，溶液揮發(fā)后得到的多孔硅顆?？芍匦率褂?。檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖2。圖中，橫坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的質(zhì)核比，縱坐標(biāo)表示質(zhì)譜峰的峰強(qiáng)度。5-9為直腸癌患者血清樣品，10-14為非癌癥患者血清樣品，15為未處理的血清樣品。 對(duì)峰位置進(jìn)行容差為O. 15%的對(duì)齊處理，并將峰強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，把相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度低于O. 5的峰記為0，相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度高于O. 5的峰記為1，將篩選挑選出來(lái)的峰用SPSS軟件進(jìn)行分層聚類(lèi)分析，分析結(jié)果說(shuō)明本方法可以對(duì)血清樣品中的低豐度蛋白進(jìn)行直接檢測(cè)，并可以初步將正常人和癌癥患者區(qū)分開(kāi)，只有8號(hào)一例被歸入正常人中。
權(quán)利要求
1. 一種低豐度低分子量蛋白富集材料的制備方法，包括如下步驟 八)將P型摻硼硅片固定在電解池中，按體積比為I :4 6的比例加入乙醇和重量濃度為40%的氫氟酸作為電解液，以硅片為陽(yáng)極，鉬電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，設(shè)定電流強(qiáng)度為0100mA，刻蝕時(shí)間為(T15分鐘，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎5 20分鐘，再用氮?dú)獯蹈?，所得的多孔硅顆粒的孔徑在5 20nm ； B)將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理5 20分鐘，形成表面硅氧鍵； C)將氧化后的多孔硅顆粒浸泡在體積濃度為1%的硅烷化試劑與有機(jī)溶劑的混合溶液中反應(yīng)I小時(shí)，再在烘箱中110°c干燥15分鐘，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈； D)選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環(huán)氧基硅烷化試劑進(jìn)行表面修飾。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種低豐度低分子量蛋白富集材料的制備方法，包括如下步驟:將P型摻硼硅片固定在電解池中，加入乙醇和氫氟酸作為電解液，以硅片為陽(yáng)極，鉑電極為陰極，進(jìn)行直流電解刻蝕和脫膜，刻蝕脫膜后的多孔硅層用乙醇沖洗干凈后超聲粉碎，再用氮?dú)獯蹈?；將上述多孔硅顆粒進(jìn)行臭氧氧化處理；將氧化后的多孔硅顆粒浸泡硅烷化試劑與有機(jī)溶劑的混合溶液中反應(yīng)，再在烘箱中干燥，蒸干后的多孔硅顆粒用乙醇浸泡洗凈；選擇所需孔徑的多孔硅，用氨基硅烷化試劑、巰基硅烷化試劑或環(huán)氧基硅烷化試劑進(jìn)行表面修飾。本發(fā)明通過(guò)制備多孔硅顆粒達(dá)到一步分離、富集和檢測(cè)血清樣品中低分子量蛋白的作用。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102809498SQ20121025292
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者鄔建敏, 談潔, 趙偉潔 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)