專利名稱：具有抑制Ⅰ型單純皰疹病毒復(fù)制功能的蛋白分子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種由單純皰疹病毒結(jié)合細(xì)胞受體后特異誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白分子。
一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)提示HSV感染不同細(xì)胞后會表現(xiàn)不同的感染過程和不同的感染結(jié)局，最為關(guān)鍵的原因就是HSV結(jié)合不同的細(xì)胞表面的受體后，所誘導(dǎo)的基因反應(yīng)有一定的差異，而這些各異的基因反應(yīng)產(chǎn)物對HSVI進(jìn)入細(xì)胞后的感染過程有直接的影響。因此導(dǎo)致了病毒感染可能走向不同結(jié)局。
隨著分子病毒學(xué)研究的深入，對病毒進(jìn)入細(xì)胞過程的各個環(huán)節(jié)均有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。因此，可以明確，病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用—即感染過程—實(shí)際上開始于病毒顆粒與其位于細(xì)胞膜上的特異受體相結(jié)合之時。而病毒與相應(yīng)受體的結(jié)合，事實(shí)上模擬了生理配體與相應(yīng)受體的結(jié)合過程，這個結(jié)合過程可以和正常生理配體一樣使受體發(fā)生活化，并通過激酶反應(yīng)過程激活信號傳導(dǎo)成分，使相應(yīng)信號導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，此信號必然會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一系列的基因反應(yīng)，而此基因反應(yīng)將可以產(chǎn)生多種具有基因調(diào)控活性的蛋白分子或者某些功能性產(chǎn)物，后者可能以細(xì)胞因子或其它形式表現(xiàn)，并對細(xì)胞的生物學(xué)活性及病毒的復(fù)制過程產(chǎn)生一定影響。由于病毒結(jié)合受體之后較短時間內(nèi)即進(jìn)入細(xì)胞，并以其增殖過程破壞細(xì)胞，所以，由病毒引起的最具有意義的細(xì)胞基因反應(yīng)屬于早期基因反應(yīng)，對細(xì)胞基因反應(yīng)的研究表明，在細(xì)胞對外界信號刺激的反應(yīng)過程中，早期基因反應(yīng)具有啟動某些次級基因反應(yīng)的功能，同時還具有向其它細(xì)胞傳遞特殊信號，例如與免疫系統(tǒng)相關(guān)的信號因子以及表現(xiàn)某些特定生理作用的功能。因此，可以認(rèn)為，對病毒與細(xì)胞的相互作用研究能夠?yàn)椴《九c細(xì)胞相互作用的研究中引入一種綜合的觀念，即由于病毒對受體的結(jié)合，使得細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的早期基因反應(yīng)，已和未經(jīng)病毒結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有所差異，而病毒所表現(xiàn)的病理感染結(jié)果，實(shí)際上是在這樣的特定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境作用下形成的。
對由病毒結(jié)合受體所導(dǎo)致的細(xì)胞早期基因反應(yīng)的分析，是目前病毒與細(xì)胞相互作用研究領(lǐng)域中的空白點(diǎn)。但這個領(lǐng)域的研究在探索細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生的相應(yīng)反應(yīng)的機(jī)理，和病毒與細(xì)胞相互作用的各種可能的生物學(xué)意義及結(jié)果，以及由此確定的，進(jìn)一步的病毒感染病理學(xué)結(jié)局研究，都具有很大的意義和潛力。雖然該領(lǐng)域內(nèi)的國內(nèi)外專家均已公認(rèn)病毒結(jié)合受體的確會給細(xì)胞導(dǎo)入特定信號，但此信號所導(dǎo)致的基因反應(yīng)--尤其是早期基因反應(yīng)對病毒在該細(xì)胞或與該細(xì)胞相鄰的同種細(xì)胞中感染過程的各種影響，尚無具體的研究探索。
技術(shù)方案1.序列特征編碼該蛋白分子基因全長為904bp，其具有完整的5′-非編碼區(qū)和3′-非編碼區(qū)，編碼區(qū)可編碼一個由121個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(命名為SR-15)，分子量為14.9KD，該蛋白結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為N端具有一個RS重復(fù)區(qū)域，在中部具有一個PPLP結(jié)構(gòu)域，并以含有16.5％的精氨酸和12.4％的絲氨酸為基本特征。
2.SR-15基因序列表1GGCGCGCCCG GGACGGAACC TGGGGCGTCA GAACGAAAGG CAGCGGCGCC GCGCTTCCCACCGCGCGGGC CCTGCCTTGG ACCCCGCAGT CTTGCTTTCC GTCGCCGCGG CGCGAAGGGT61GCCGGCCAGC CTCCCGCGCA GCGCCCCGGC CGGAAGCCTC CTCGCCGCCG CTTCCTCTCGCGGCCGGTCG GAGGGCGCGT CGCGGGGCCG GCCTTCGGAG GAGCGGCGGC GAAGGAGAGC121AGAAGGCGCG GGGCGGGCTG TCCGGCCCGC AGGGCGGTCG AGCCCGCGGC GCCATGGCTCTCTTCCGCGC CCCGCCCGAC AGGCCGGGCG TCCCGCCAGC TCGGGCGCCG CGGTACCGAG181ACGTCGGCTC CCGCAAGCGC TCGAGGAGTC GCAGCCGGTC CCGGGGACGG GGGTCGGAAATGCAGCCGAG GGCGTTCGCG AGCTCCTCAG CGTCGGCCAG GGCCCCTGCC CCCAGCCTTT241AGAGAAAGAA GAAGAGCAGG AAAGACACCT CGAGGAACTG CTCGGCCTCC ACATCCCAAGTCTCTTTCTT CTTCTCGTCC TTTCTGTGGA GCTCCTTGAC GAGCCGGAGG TGTAGGGTTC301GTCGCAAGGC CAGCACGGTC CCTGGGGCGG AGGTTCTTCT AGCTCCTCTT CTTCCTCCTCCAGCGTTCCG GTCGTGCCAG GGACCCCGCC TCCAAGAAGA TCGAGGAGAA GAAGGAGGAG361GTCCTCCTCC TCTTCCTCCA GTGATGGCCG GAAGAAGCGG GGGAAGTACA AGGACAAGAGCAGGAGGAGG AGAAGGAGGT CACTACCGGC CTTCTTCGCC CCCTTCATGT TCCTGTTCTC421GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA GGAAGAACTG AAGAAGAAGG GCAAGGAGAA GGCGGAAGCACTCCTTCTTC TTCTTCTTCT CCTTCTTGAC TTCTTCTTCC CGTTCCTCTT CCGCCTTCGT481CAGCAGAACA TCATCCGCAA GGTGGTGGAC CCTTAGACGG GGCGCACCAG GCTTATTAAGGTCGTCTTGT AGTAGGCGTT CCACCACCTG GGAATCTGCC CCGCGTGGTC CGAATAATTC541GGAGATGGCG AGGTCCTAGA GGAAATCGTA ACCAAAGAAC GACCCAGAGA GATCAACAAGCCTCTACCGC TCCAGGATCT CCTTTAGCAT TGGTTTCTTG CTGGGTCTCT CTAGTTGTTC601CAACCCACCC GAGGGGACTG CCTGGCCTTC CAGATGCGAA CTGGGTTGCT TCCCTGAGGGGTTGGGTGGG CTCCCCTGAC GGACCGGAAG GTCTACGCTT GACCCAACGA AGGGACTCCC661CCCCCGCTGG CCAAGGCCTG TGGACGACGC TTGCGGCCCA GCCTGGGCAG GTTTCAGGGTGGGGGCGACC GGTTCCGGAC ACCTGCTGCG AACGCCGGGT CGGACCCGTC CAAAGTCCCA721GCCAGTGGGA AGCCTGATGG GTGTTGGTGG CCTTTCCCCG GTGGATTGGT CTCTGGCCCA
CGGTCACCCT TCGGACTACC CACAACCACC GGAAAGGGGc CACCTAACCA GAGACCGGGT781GCCCAGTCTC TTCTAAGGGG CAGGGGGTGG AGGTTGGGGT CACCGGCCTG CTTGGCACCCCGGGTCAGAG AAGATTCCCC GTCCCCCACC TCCAACCCCA GTGGCCGGAC GAACCGTGGG841CCATCTGAAA GAGCAGCACT TCTCAGCTAT TAAAGGCCCC CTGGATAGAA AAAAAAAAAAGGTAGACTTT CTCGTCGTGA AGAGTCGATA ATTTCCGGGG GACCTATCTT TTTTTTTTTT901AAGATTCT3.SR-15蛋白分子的氨基酸序列表1 MAHVGSRKRS RSRSRSRGRG SEKRKKKSRK DTSRNCSAST SQGRKASTVP GAEVLLAPLL61 PPRPPpLPPV MAGRSGGSTR TRGGRRRRRG RTEEEGQGEG GSTAEHHPQG GGPLDGAHQA121 Y
本發(fā)明提供了具有抑制I型單純皰疹病毒復(fù)制功能的蛋白分子的制備方法，該法包括以下步驟1、SR-15cDNA的克隆與鑒定-構(gòu)建HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞的cDNA文庫；-對經(jīng)HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞進(jìn)行mRNA差異顯示分析；-制備特異的EST差異片段的α-32P-dATP標(biāo)記探針，對HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞的cDNA文庫進(jìn)行雜交篩，獲得SR-15cDNA，并測序鑒定；-利用200bp上述基因的片段制備探針對HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞及細(xì)胞對照進(jìn)行Northern雜交分析，以探討該基因的表達(dá)與HSVI結(jié)合的關(guān)系。
2.SR-15編碼蛋白的表達(dá)純化及抗體制備-將SR-15cDNA中的編碼區(qū)序列147bp-536bp，共363nt克隆入pGEX-5T表達(dá)載體中進(jìn)行融合表達(dá)；-對融合表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析，制備SR-15純化蛋白，并定量至5μg/ml；-以上述蛋白對小鼠進(jìn)行肌肉及靜脈注射免疫，5周后制備抗血清，即為抗SR-15蛋白抗體本發(fā)明具有以下有益效果1.從病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的角度，探索這種結(jié)合所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞早期基因反應(yīng)產(chǎn)物與病毒之間的相互作用。由此，為病毒與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系提供新的探索途徑，并通過對HSVI與人成纖維細(xì)膜上的相應(yīng)受體結(jié)合所誘導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)物SR-15蛋白的功能分折，為HSVI感染機(jī)理和病理學(xué)機(jī)理提供直接的資料。通過對HSVI等病毒與相應(yīng)受體結(jié)合后細(xì)胞早期基因反應(yīng)差異的初步研究，并克隆到的一個新蛋白分子一SR-15。完成SR-15蛋白對細(xì)胞內(nèi)前RNA剪切過程直接或間接影響的探索分析；以及該蛋白對HSVI復(fù)制過程中前RNA剪切過程影響分析。SR-15蛋白作為HSVI誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞表達(dá)的特異產(chǎn)物對細(xì)胞和/或病毒的功能意義分析，并以此為線索，進(jìn)一步探索HSVI與人成纖維細(xì)胞相互作用的可能模式。從而為深入了解HSVI與細(xì)胞之間相互作用所形成的特定病理學(xué)結(jié)果的分子機(jī)理，尤其是HSVI感染細(xì)胞分子病理學(xué)機(jī)理提供直接的依據(jù)；SR-15蛋白為開發(fā)新型抗病毒生物活性因子提供了的可能性，同時也為相應(yīng)的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。
2.本發(fā)明的研究工作、已克隆及即將克隆到的與病毒感染過程特異相關(guān)的新基因，還包括這些基因產(chǎn)物功能的特定生理學(xué)病理學(xué)意義，均在病毒與細(xì)胞相互作用的研究領(lǐng)域中具有開辟新方向的意義，并從新的角度為病毒與細(xì)胞相互作用的研究提供思路和概念，以及更為廣闊的研究空間和資料。
3.本發(fā)明提示HSVI與其它病毒如脊灰病毒甲型肝炎病毒對同一細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)的早期感染時(吸附細(xì)胞后1小時)，誘導(dǎo)了具有明顯差異的基因反應(yīng)，而HSVI對不同細(xì)胞的早期感染過程中，(吸附后1小時)亦能誘導(dǎo)具有明顯差異的基因反應(yīng)，在這些差異的基因反應(yīng)中，有50％屬于作為細(xì)胞調(diào)控因子的原癌基因產(chǎn)物，另外一些都是具有未知功能的新基因。
4.具有RS重復(fù)區(qū)域是SR蛋白家族的特征，該蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)前mRNA剪切過程中的重要組分，但其結(jié)構(gòu)中的RS重復(fù)域位于分子的C-末端，并具有特征性的RNA識別區(qū)域(RRM)；PPLP區(qū)域是一與Src類蛋白結(jié)合的特征結(jié)構(gòu)。在對SR-15蛋白分子序列與部分SR蛋白的同源性分析比較提示，該蛋白在某些特征部位具有與SR家族相似的結(jié)構(gòu)，但整體同源性小于10％。利用該蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物所制備的特異抗體，經(jīng)免疫熒光分析證實(shí)該蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)中，Northern亦證實(shí)了其是由HSVI結(jié)合細(xì)胞受體后所特異誘導(dǎo)。本發(fā)明的研究結(jié)果證實(shí)，該蛋白質(zhì)可能在兩個方面具有值得進(jìn)一步探索的潛在意義。其一，該蛋白作為一種由HSVI結(jié)合受體后特異誘導(dǎo)的早期基因產(chǎn)物，以其結(jié)構(gòu)特性，可能參與了細(xì)胞或者病毒mRNA的剪切過程，但對細(xì)胞而言，該過程發(fā)生于核內(nèi)，因此要探索這一點(diǎn)，必須先明確其是否及如何進(jìn)入核內(nèi)。另外，由于該蛋白分子表現(xiàn)了一種明顯與核酸分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，同時又具有與Src蛋白類結(jié)合的活性域(PLPP)。進(jìn)一步的研究表明，SR-15蛋白在正常生理?xiàng)l件下并不表達(dá)，僅在細(xì)胞受到HSVI刺激時產(chǎn)生，僅出現(xiàn)于G1/S期間，這意昧著受病毒感染的細(xì)胞很可能通過此蛋白分子對病毒有一定調(diào)節(jié)細(xì)胞前mRNA剪切的作用，并以此機(jī)理阻滯HSVI前mRNA剪接而影響病毒的增殖。對本發(fā)明所克隆到的新的SR-15蛋白分子在HSVI感染細(xì)胞內(nèi)對細(xì)胞生理功能和病毒復(fù)制過程的潛在作用影響進(jìn)行全面的分析，為深入了解HSVI與細(xì)胞之間相互作用所形成的特定病理學(xué)結(jié)果的分子機(jī)理，尤其是細(xì)胞分子病理學(xué)機(jī)理提供直接的依據(jù)，提供了開發(fā)新型抗病毒生物活性因子的可能性，同時也為相應(yīng)的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。
5.SR-15蛋白分子的抗病毒應(yīng)用意義由于該蛋白的表達(dá)與HSVI結(jié)合細(xì)胞受體有直接的關(guān)系，因此在了解該蛋白對細(xì)胞的功能之時，將著重了解其對HSVI感染過程中的某些組分的影響。
A.在上述基礎(chǔ)上，對不同時相KMB-17細(xì)胞的HSVI感染情況的分析，即以同樣方法感染G1/S、G1、S、G2期的KMB-17、Hela細(xì)胞，進(jìn)行病毒滴度測定，檢測可以感染HSVI的各類細(xì)胞，以及不同病毒(如polio)在結(jié)合其受體時是否亦有同樣蛋白分子表達(dá)。如果這一現(xiàn)象為HSVI感染多種細(xì)胞所共有，則可以進(jìn)一步探討其對HSVI感染影響的共性。若此現(xiàn)象僅為人成纖維細(xì)胞所特有，則將該蛋白的基因?qū)際SVI易感細(xì)胞，再從HSVI感染過程的生物學(xué)特性，如感染動力學(xué)；感染過程中的mRNA剪切效率變化和感染復(fù)制過程中的病理學(xué)機(jī)理等方面確定SR-15的功能意義。
B.研究Gl/S期HSVI的復(fù)制抑制與早期基因的特異性產(chǎn)物的相關(guān)性，將帶有SR-15基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入某些細(xì)胞，如Hela，Hep-2等；檢查該基因表達(dá)產(chǎn)物對病毒感染的影響，進(jìn)一步探索SR-15蛋白的功能意義。將SR-15cDNA編碼區(qū)序列147bp-536bp，共363nt克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3中轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞后，通過Western blot檢測蛋白表達(dá)，一天后以HSVI感染，并檢測病毒滴度。
C.體外剪切抑制試驗(yàn)，使用T7聚合酶和32P-UTP在重組質(zhì)粒pHSVP中合成標(biāo)記的HSVI RL2基因的前體mRNA片段，通過HSVI基因轉(zhuǎn)錄過程中的某些基因的體外剪接過程，如即刻早期基因前體mRNA的體外剪切抑制試驗(yàn)研究細(xì)胞G1/S期內(nèi)SR-15蛋白分子剪切調(diào)節(jié)活性與HSVI的復(fù)制抑制關(guān)系。
試驗(yàn)例2圖2是SR-15在pGEX-5T中的表達(dá)。如附圖2所示，克隆入pGEX-5T表達(dá)載體中的SR-15蛋白得到了較好的融合表達(dá)，對融合表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析。圖中1.SR-15在pGEX-5T中的表達(dá)；2.對照；3.蛋白Marker。
試驗(yàn)例3SR-15蛋白的結(jié)構(gòu)特征與功能特征試驗(yàn)研究。SR-15蛋白該蛋白結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為N端具有一個RS重復(fù)區(qū)域，在中部具有一個PPLP結(jié)構(gòu)域，并以較多的精氨酸和絲氨酸為基本特征。資料表明，具有RS重復(fù)區(qū)域是SR蛋白家族的特征，該蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)前mRNA剪切過程中的重要組分，但其結(jié)構(gòu)中的RS重復(fù)域位于分子的C-末端，并具有特征性的RNA識別區(qū)域(RRM)；PPLP區(qū)域是一與Src類蛋白結(jié)合的特征結(jié)構(gòu)(見

圖1)。35S和32P免疫沉淀結(jié)果顯示了SR-15蛋白在HSVI刺激細(xì)胞后表達(dá)并發(fā)生了磷酸化，提示SR-15蛋白作為中介因子介導(dǎo)了病毒感染與細(xì)胞周期的關(guān)系。其結(jié)果見圖3。圖3是HSVI結(jié)合KMB-17后SR-15蛋白的免疫沉淀；在圖3中AHSVI結(jié)合KMB-17后32P-phosphate and SR-15 labeled by35S-methioine標(biāo)記的SR-15蛋白的免疫沉淀，1.35S-methioine標(biāo)記細(xì)胞對照；2.Cells in32P-phosphate標(biāo)記細(xì)胞對照；3.HSVI刺激后35S-methioine標(biāo)記細(xì)胞；4.HSVI刺激后32P-phosphate標(biāo)記細(xì)胞。BHSVI結(jié)合KMB-17后G1/S，G1，S and G2各時相及細(xì)胞對照的32P-phosphate標(biāo)記的SR-15蛋白的免疫沉淀；1，2，3，4，HSVI結(jié)合細(xì)胞后G1/S，G1，S and G2時相。5，6，7，8，細(xì)胞對照的G1/S，G1，S and G2時相。
試驗(yàn)例4圖4是SR-15與人β-蛋白外顯子1和外顯子2、剪接位點(diǎn)及snRNA的sm結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合分析。如附圖4所示，SR-15與人β-珠蛋白外顯子1和2、剪接位點(diǎn)及snRN的sm結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合分析1.剪切位點(diǎn)；2.sm-結(jié)合位點(diǎn)；3.外顯子1；4.外顯子2。對SR-15蛋白mRNA剪切過程相關(guān)的特異序列相結(jié)合的特異性的試驗(yàn)結(jié)果，表明蛋白內(nèi)部含有DNA或RNA結(jié)合特異性區(qū)域-RRR，KKRR，推測該蛋白可能通過與HSVI的基因DNA或mRNA的相互作用影響病毒的復(fù)制，同時鑒于SR類蛋白家族與前體mRNA剪切的相關(guān)性，表明SR-15蛋白是HSVI前體mRNA的抑制因子。人β-珠蛋白基因外顯子1和外顯子2及剪接位點(diǎn)的SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合試驗(yàn)蛋白結(jié)果為這一推論提供了證實(shí)。
試驗(yàn)例5圖5是HSVI結(jié)合后不同相收獲病毒的滴度結(jié)果，圖5中HSVI/KMB-17HSVI感染KMB-17細(xì)胞后病毒滴度；HSVI/HelaHSVI感染Hela細(xì)胞后病毒滴度；PV/KMB-17Polio病毒Sabin株感染KMB-17細(xì)胞后病毒滴度。圖5中的結(jié)果表明，顯示在KMB-17細(xì)胞G1/S期的滴度明顯低于其它時相約4個log，而Hela細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)明顯差異；使用PV感染KMB-17細(xì)胞也未發(fā)現(xiàn)差異。提示病毒刺激與細(xì)胞的特異相關(guān)性。
試驗(yàn)例6圖6顯示了pcDNA-S15轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后對HSVI的復(fù)制抑制作用。圖中結(jié)果表明SR-15基因轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示了Hela細(xì)胞內(nèi)HSVI滴度比未轉(zhuǎn)染SR-15基因的細(xì)胞病毒滴度少約2個log，提示SR-15蛋白的確抑制了病毒的復(fù)制。
試驗(yàn)例7體外抑制試驗(yàn)表明在HSVI感染的G1/S期KMB-17細(xì)胞和Hela細(xì)胞的裂解液存在的情況下，SR-15蛋白可以明顯抑制HSVI RL2基因的前體mR的剪切。圖7是體外SR-15蛋白抑制HSVI RL2基因的前體mRNA的剪切，圖7中1.HSVI感染Hela細(xì)胞后1小時后的細(xì)胞裂解液與含有剪切位點(diǎn)的HSVIRL2基因的mRNA片段共同孵育；2.HSVI感染Hela細(xì)胞后1小時后的細(xì)胞裂解液和純化的SR-15蛋白與含有剪切位點(diǎn)的HSVI RL2基因的mRNA片段共同孵育；3.HSVI感染KMB-17細(xì)胞后1小時后的細(xì)胞裂解液和純化的SR-15蛋白與含有剪切位點(diǎn)的HSVI RL2基因的mRNA片段共同孵育從圖7可以看到SR-15蛋白存在是未能剪切的876nt的樣品，以及沒有SR-15蛋白時經(jīng)過剪切的365nt和511nt的樣品。
權(quán)利要求
1.一種具有抑制I型單純皰疹病毒復(fù)制功能的蛋白分子，該蛋白分子的基因特征是①基因全長為904bp，其具有完整的5′-非編碼區(qū)和3′-非編碼區(qū)，編碼區(qū)可編碼一個由121個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(命名為SR-15)，分子量為14.9KD，該蛋白結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為N端具有一個RS重復(fù)區(qū)域，在中部具有一個PPLP結(jié)構(gòu)域，并以含有16.5％的精氨酸和12.4％的絲氨酸為基本特征；②SR-15基因序列描述為1 GGCGCGCCCG GGACGGAACC TGGGGCGTCA GAACGAAAGG CAGCGGCGCC GCGCTTCCCACCGCGCGGGC CCTGCCTTGG ACCCCGCAGT CTTGCTTTCC GTCGCCGCGG CGCGAAGGGT61 GCCGGCCAGC CTCCCGCGCA GCGCCCCGGC CGGAAGCCTC CTCGCCGCCG CTTCCTCTCGCGGCCGGTCG GAGGGCGCGT CGCGGGGCCG GCCTTCGGAG GAGCGGCGGC GAAGGAGAGC121 AGAAGGCGCG GGGCGGGCTG TCCGGCCCGC AGGGCGGTCG AGCCCGCGGC GCCATGGCTCTCTTCCGCGC CCCGCCCGAC AGGCCGGGCG TCCCGCCAGC TCGGGCGCCG CGGTACCGAG181 ACGTCGGCTC CCGCAAGCGC TCGAGGAGTC GCAGCCGGTC CCGGGGACGG GGGTCGGAAATGCAGCCGAG GGCGTTCGCG AGCTCCTCAG CGTCGGCCAG GGCCCCTGCC CCCAGCCTTT241 AGAGAAAGAA GAAGAGCAGG AAAGACACCT CGAGGAACTG CTCGGCCTCC ACATCCCAAGTCTCTTTCTT CTTCTCGTCC TTTCTGTGGA GCTCCTTGAC GAGCCGGAGG TGTAGGGTTC301 GTCGCAAGGC CAGCACGGTC CCTGGGGCGG AGGTTCTTCT AGCTCCTCTT CTTCCTCCTCCAGCGTTCCG GTCGTGCCAG GGACCCCGCC TCCAAGAAGA TCGAGGAGAA GAAGGAGGAG361 GTCCTCCTCC TCTTCCTCCA GTGATGGCCG GAAGAAGCGG GGGAAGTACA AGGACAAGAGCAGGAGGAGG AGAAGGAGGT CACTACCGGC CTTCTTCGCC CCCTTCATGT TCCTGTTCTC421 GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA GGAAGAACTG AAGAAGAAGG GCAAGGAGAA GGCGGAAGCACTCCTTCTTC TTCTTCTTCT CCTTCTTGAC TTCTTCTTCC CGTTCCTCTT CCGCCTTCGT481 CAGCAGAACA TCATCCGCAA GGTGGTGGAC CCTTAGACGG GGCGCACCAG GCTTATTAAGGTCGTCTTGT AGTAGGCGTT CCACCACCTG GGAATCTGCC CCGCGTGGTC CGAATAATTC541 GGAGATGGCG AGGTCCTAGA GGAAATCGTA ACCAAAGAAC GACCCAGAGA GATCAACAAGCCTCTACCGC TCCAGGATCT CCTTTAGCAT TGGTTTCTTG CTGGGTCTCT CTAGTTGTTC601 CAACCCACCC GAGGGGACTG CCTGGCCTTC CAGATGCGAA CTGGGTTGCT TCCCTGAGGGGTTGGGTGGG CTCCCCTGAC GGACCGGAAG GTCTACGCTT GACCCAACGA AGGGACTCCC661 CCCCCGCTGG CCAAGGCCTG TGGACGACGC TTGCGGCCCA GCCTGGGCAG GTTTCAGGGTGGGGGCGACC GGTTCCGGAC ACCTGCTGCG AACGCCGGGT CGGACCCGTC CAAAGTCCCA721 GCCAGTGGGA AGCCTGATGG GTGTTGGTGG CCTTTCCCCG GTGGATTGGT CTCTGGCCCACGGTCACCCT TCGGACTACC CACAACCACC GGAAAGGGGC CACCTAACCA GAGACCGGGT781 GCCCAGTCTC TTCTAAGGGG CAGGGGGTGG AGGTTGGGGT CACCGGCCTG CTTGGCACCCCGGGTCAGAG AAGATTCCCC GTCCCCCACC TCCAACCCCA GTGGCCGGAC GAACCGTGGG841 CCATCTGAAA GAGCAGCACT TCTCAGCTAT TAAAGGCCCC CTGGATAGAA AAAAAAAAAAGGTAGACTTT CTCGTCGTGA AGAGTCGATA ATTTCCGGGG GACCTATCTT TTTTTTTTTT901 AAGATTCT③SR-15蛋白分子的氨基酸序列表1 MAHVGSRKRS RSRSRSRGRG SEKRKKKSRK DTSRNCSAST SQGRKASTVP GAEVLLAPLL61 PPRPPPLPPV MAGRSGGSTR TRGGRRRRRG RTEEEGQGEG GSTAEHHPQG GGPLDGAHQA121 Y
2.一種權(quán)利要求1所述的具有抑制I型單純皰疹病毒復(fù)制功能的蛋白分子的制備方法，該法包括以下步驟①SR-15cDNA的克隆與鑒定-構(gòu)建HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞的cDNA文庫；-對經(jīng)HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞進(jìn)行mRNA差異顯示分析；-制備特異的EST差異片段的α-32P-dATP標(biāo)記探針，對HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞的cDNA文庫進(jìn)行雜交篩，獲得SR-15cDNA，并測序鑒定；-利用200bp上述基因的片段制備探針對HSVI刺激1小時后的KMB-17細(xì)胞及細(xì)胞對照進(jìn)行Northern雜交分析，以探討該基因的表達(dá)與HSVI結(jié)合的關(guān)系。②SR-15編碼蛋白的表達(dá)純化及抗體制備-將SR-15cDNA中的編碼區(qū)序列147bp-536bp，共363nt克隆入pGEX-5T表達(dá)載體中進(jìn)行融合表達(dá)；-對融合表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析，制備SR-15純化蛋白，并定量至5μg/ml；-以上述蛋白對小鼠進(jìn)行肌肉及靜脈注射免疫，5周后制備抗血清，即為抗SR-15蛋白的抗體。
3.一種權(quán)利要求1所述蛋白分子的用途，具體描述如下①SR-15基因轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后所顯示的抗HSVI病毒感染的作用，將SR-15基因轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)HSVI滴度比未轉(zhuǎn)染SR-15基因的細(xì)胞病毒滴度少約2個log，表明SR-15蛋白抑制I型單純皰疹病毒的復(fù)制；②在HSVI感染的G1/S期的KMB-17細(xì)胞和Hela細(xì)胞的裂解液中，使用SR-15蛋白的樣品存在有876nt的KC2 mRNA分子，而無SR-15蛋白的樣品則出現(xiàn)經(jīng)過剪切的365nt和511nt的分子，該體外抑制試驗(yàn)證明SR-15蛋白可以明顯抑制HSVI RLL基因的前體mKNA的剪切。
全文摘要
具有抑制I型單純皰疹病毒復(fù)制功能的蛋白分子及其制備方法。涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該蛋白分子基因全長為904bp,其具有完整的5’－非編碼區(qū)和3’－非編碼區(qū),編碼區(qū)可編碼一個由121個氨基酸組成的蛋白質(zhì),分子量為14.9KD,該蛋白結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為:N端具有一個RS重復(fù)區(qū)域,在中部具有一個PPLP結(jié)構(gòu)域,并以含有16.5%的精氨酸和12.4%的絲氨酸為基本特征。本發(fā)明從病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的角度,對誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞早期基因反應(yīng)產(chǎn)物與病毒之間的相互作用進(jìn)行深入研究,為病毒與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系提供新的探索途徑。并通過對HSVI與人成纖維細(xì)膜上的相應(yīng)受體結(jié)合所誘導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)物SR－15蛋白的功能分折,為HSVI感染和病理學(xué)機(jī)理提供了直接依據(jù)。
文檔編號A61P31/22GK1385440SQ02113350
公開日2002年12月18日 申請日期2002年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月6日
發(fā)明者李琦涵, 董承紅, 王麗春, 劉龍丁, 趙紅玲, 姜莉, 孫明, 王炯, 董少忠, 王晶晶, 趙樹棟, 胡方, 易紅昆 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所