專(zhuān)利名稱(chēng)：一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法，屬于生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
地西泮(Diazepam)為苯二氮卓類(lèi)鎮(zhèn)靜安眠藥，化學(xué)名稱(chēng)為1-甲基-5-苯基-7-氯-l,3-二氫-2H-l,4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動(dòng)物飼料添加劑，作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑, 具有使動(dòng)物嗜睡少動(dòng)，生長(zhǎng)快且有改變?nèi)赓|(zhì)的作用。也用在屠宰和動(dòng)物檢疫之前: 或?qū)?dòng)物轉(zhuǎn)移屠宰之前，起鎮(zhèn)靜作用，以減輕動(dòng)物緊張狀態(tài)，降低動(dòng)物傷害和死 亡率。此類(lèi)藥物常見(jiàn)嗜睡，可見(jiàn)無(wú)力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見(jiàn)皮疹、肝 損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)。若隨意在飼料中添加此類(lèi)藥物，蓄積的藥物通過(guò)食 物鏈進(jìn)入人體，將造成巨大的危害。為此許多國(guó)家將此類(lèi)藥物列入禁用藥物名 單。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)地西泮的檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜 法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但 這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)檢材的要求也比較高，需要進(jìn)一步的提 純處理才能進(jìn)行，且不能適應(yīng)高通量、現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。因此實(shí)現(xiàn)具有快速， 便攜優(yōu)點(diǎn)的免疫檢測(cè)方法的多殘留檢測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法，為了克服 現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的缺陷，提供一種便攜，快速適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)地西泮的免疫層 析色譜檢觀(guān)W去(gold immunochromatography assay; GICA)。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙，由樣品墊、結(jié)合釋放 墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結(jié) 合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結(jié)合釋放墊上包被了抗地西泮多抗-膠體金
標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上依次包被有地西泮偶聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體，以地
西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè)試線(xiàn)，以羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)； 制備步驟為
(1) 將地西泮與牛血清蛋白分子進(jìn)行偶聯(lián)，作為地西泮偶聯(lián)抗原；
(2) 用地西泮偶聯(lián)抗原按常規(guī)方法免疫制得抗地西泮多抗；
(3) 用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；
(4) 將3mL膠體金調(diào)至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗地 西泮多抗0.05mL，放置30min后加入5%牛血清蛋白BSA溶液使終濃度為1%，放置至少30min后，10000轉(zhuǎn)離心50min，移去上清液后用含5。/。蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸鹽緩沖液3mL重懸，重復(fù)2次，最后用0.3mL緩沖液溶解，得到 穩(wěn)定的抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物；
(5) 將抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合釋放墊上，將地西泮偶 聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，地西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè) 試線(xiàn)和羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，在37t:烘箱干燥；
(6) 試紙條的組裝將樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫檢測(cè)的地西泮膠體金法檢測(cè)試紙。
本發(fā)明檢測(cè)原理是利用樣品墊形成的毛細(xì)管虹吸效應(yīng)，使被檢測(cè)物質(zhì)首先 與膠體金標(biāo)記的抗地西泮多抗發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)形式的結(jié)合，其后果是，當(dāng)膠體金標(biāo)記 的抗地西泮多抗過(guò)量時(shí)，多余的多抗漂移到測(cè)試線(xiàn)，與地西泮偶聯(lián)抗原結(jié)合并 顯色；而與檢測(cè)物結(jié)合的膠體金標(biāo)記的抗地西泮多抗，其V區(qū)結(jié)合位點(diǎn)被檢測(cè) 物質(zhì)占據(jù)，只能跨越測(cè)試線(xiàn)漂移到質(zhì)控線(xiàn)以C區(qū)位點(diǎn)與羊抗兔IgG抗體非特異 性結(jié)合，同測(cè)試線(xiàn)進(jìn)行比色而得到檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明應(yīng)用層析式一步競(jìng)爭(zhēng)法原理，試紙中上下線(xiàn)比 色來(lái)半定量檢測(cè)血清或尿液樣品中的地西泮殘留量，在5-10min內(nèi)，快速準(zhǔn)確地 檢測(cè)出樣品是否含有地西泮，以確定地西泮是否超標(biāo)，能夠滿(mǎn)足食品安全對(duì)地 西泮殘留量檢測(cè)需求，適用于屠宰企業(yè)及政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、經(jīng)濟(jì)快捷、 制作容易、成本低廉的特點(diǎn)。


圖1本發(fā)明地西泮膠體金法檢測(cè)試紙的側(cè)視圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例h地西泮檢測(cè)試紙的制備
(1) 將地西泮與牛血清蛋白分子偶聯(lián)，作為地西泮偶聯(lián)抗原，
(2) 用地西泮偶聯(lián)抗原免疫獲得抗地西泮多抗
(3) 用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；
(4) 將3mL膠體金調(diào)至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗地 西泮多抗0.05mL，放置30min后加入5%牛血清白蛋白(BSA)溶液使終濃度為 1%，放置至少30min后，10000轉(zhuǎn)離心50min，移去上清液后用0.002mol/LpH 9.0的硼酸鹽緩沖液(含5。/。蔗糖)3mL重懸，重復(fù)2次，最后用0.3mL緩沖液溶 解，得到穩(wěn)定的抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物；
(5) 將抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合釋放墊上，將地西泮偶
聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，作為測(cè)試線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)， 在37X:烘箱干燥。(6)試紙條的組裝將樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于檢測(cè)的地西泮膠體金法檢測(cè)試紙。 實(shí)施例2:試紙要求
(1) 陰性參考品符合率
用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L， pH7.4)配制濃度為10ng/mL的鹽酸異丙 嗪標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測(cè)，以正?；虺C正目力觀(guān)察結(jié)果，反應(yīng)時(shí)間在 5min時(shí)觀(guān)察結(jié)果，應(yīng)為陰性。
用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L， pH 7.4)配制濃度為10ng/mL的巴比妥標(biāo) 準(zhǔn)品溶液進(jìn)行10次平行檢測(cè)，以正常或矯正目力觀(guān)察結(jié)果，反應(yīng)時(shí)間在5min 時(shí)觀(guān)察結(jié)果，應(yīng)為陰性。
(2) 陽(yáng)性參考品符合率
用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L， pH 7.4)配制濃度為50、 100、 150ng/mL
的地西泮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行平行檢測(cè)，各濃度進(jìn)行10次平行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間在5min 時(shí)觀(guān)察結(jié)果，不得出現(xiàn)陰性。
(3) 最低檢出量
用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L， pH 7.4)分別配制濃度為0、 2、 5、 10、 20、 50、 100ng/mL的地西泮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各濃度進(jìn)行10次平行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間 在5min時(shí)，以正?；虺C正目力觀(guān)察結(jié)果，最低檢出量不高于50ng/mL。
(4) 再現(xiàn)性
用磷酸鹽緩沖液(PBS: 0.01mol/L， pH 7.4)分別配制濃度為50ng/mL的地西 泮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行10次平行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間在5min時(shí)，以正?；虺C正目力 觀(guān)察結(jié)果，結(jié)果一致，顯色度均一。
(5) 穩(wěn)定性測(cè)試
37'C放置10天后，各項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)符合以上要求。 實(shí)施例3:試紙使用方法
(1) 樣品制備
血清抽取待檢動(dòng)物血液，離心或靜置后取透明上清液使用；若血清有過(guò) 度溶血現(xiàn)象，將血清用蒸餾水稀釋一倍后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則試劑片紅色太深， 影響測(cè)試結(jié)果。
尿液用尿液直接進(jìn)行測(cè)試，如渾濁，先離心取上清液或以蒸餾水l : l稀釋。
(2) 操作
將試紙箭頭端浸泡在待測(cè)樣本中，不要超過(guò)樣品墊lcm。浸入30sec取出放 平，10min讀取結(jié)果。
(3) 檢測(cè)結(jié)果陰性
兩條帶都顯色，且測(cè)試線(xiàn)顏色深于質(zhì)控線(xiàn)顏色，說(shuō)明樣品中不含地西泮。 兩條帶都顯色，且測(cè)試線(xiàn)顏色與質(zhì)控線(xiàn)顏色相同或接近，說(shuō)明樣品的地西
泮含量低于50ppb(50ng/mL)。
陽(yáng)性
兩條帶都顯色，但測(cè)試線(xiàn)顏色淺于質(zhì)控線(xiàn)顏色，說(shuō)明檢測(cè)樣品中地西泮含
量超過(guò)50ppb(50ng/mL)。
測(cè)試線(xiàn)不顯色，質(zhì)控線(xiàn)顯色，說(shuō)明樣品中的地西泮含量高于 腦ppb(畫(huà)ng/mL)。
權(quán)利要求
1、一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙，其特征在于由樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結(jié)合釋放墊上包被了抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上依次包被有地西泮偶聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體，以地西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè)試線(xiàn)，以羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)。
2、 權(quán)利要求1所述地西泮膠體金法檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于制備步驟為(1) 將地西泮與牛血清蛋白分子進(jìn)行偶聯(lián)，作為地西泮偶聯(lián)抗原；(2) 用地西泮偶聯(lián)抗原按常規(guī)方法免疫制得抗地西泮多抗；(3) 用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；(4) 將3mL膠體金調(diào)至pH 9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗地 西泮多抗0.05mL，放置30min后加入5°/。牛血清蛋白BSA溶液使終濃度為1%， 放置至少30min后，10000轉(zhuǎn)離心50min，移去上清液后用含5%蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸鹽緩沖液3mL重懸，重復(fù)2次，最后用0.3mL緩沖液溶解，得到 穩(wěn)定的抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物；(5) 將抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合釋放墊上，將地西泮偶 聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，地西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè) 試線(xiàn)和羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)，在37"C烘箱干燥；(6) 試紙條的組裝將樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫檢測(cè)的地西泮膠體金法檢測(cè)試紙。
全文摘要
一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法，屬于生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明檢測(cè)試紙由樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結(jié)合釋放墊上包被了抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上依次包被有地西泮偶聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體，以地西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè)試線(xiàn)，以羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線(xiàn)。本發(fā)明具有使用方便、經(jīng)濟(jì)快捷、制作容易、成本低廉的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101320039SQ200810022250
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者劉麗強(qiáng), 彭池方, 李秋生, 胡擁明, 胥傳來(lái), 緩 袁 申請(qǐng)人:江南大學(xué)