專利名稱：：凝固檢查用試劑及其試劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于外源性血液凝固檢査的凝固檢查用試劑及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：凝血致活酶是一種被稱為組織因子的蛋白質(zhì)和磷脂的復(fù)合物。凝血致活酶參與血液凝固。因此，凝血致活酶被應(yīng)用于各種凝固檢査。比如，綜合性檢測血中第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的凝固功能的凝血檢查用試劑中含有牛腦組織凝血致活酶、纖維蛋白原、第V因子、鈣和磷脂。凝血檢査用試劑的主要成份之一牛腦組織凝血致活酶是磷脂結(jié)合到被稱為組織因子的蛋白質(zhì)中生成的復(fù)合物。組織因子正如高模裕子(音譯)等人所著文獻(xiàn)("cDNAandaminoacidsequencesofbovinetissuefactor",BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,Vol.181,1991，pages1145-1150)的圖3所示，全部氨基酸數(shù)為257個(gè)的蛋白質(zhì)。組織因子由從N末端到第213位的細(xì)胞外區(qū)(可溶性細(xì)胞區(qū))、從第214到第236位的跨膜區(qū)和從237到257位的細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成。有此種結(jié)構(gòu)的凝血致活酶歷來以牛大腦為原料通過用丙酮粉或生理鹽水提取凝血致活酶的方法生產(chǎn)。作為原料使用的牛大腦是瘋牛病(BSE)的高感染部位之一。因此，近年來，生產(chǎn)現(xiàn)場發(fā)出了不使用牛大腦作原料的呼聲。有報(bào)告稱可以利用遺傳工程學(xué)技術(shù)生產(chǎn)作為檢測試劑成份之一的具有活性的重組組織因子基因。例如WO93/07492、WO98/48283，CheiylLBrucatol等所著文獻(xiàn)("ExpressionofrecombinantrabbittissuefactorinPichiapstoris,anditsapplicationinaprothrombintimereagent",ProteinExpressionandpurification,Vol.26,2002，pages386-393)。具體而言，根據(jù)WO93/07492，先在大腸菌中表達(dá)重組人組織因子遺傳基因，再運(yùn)用固定針對人組織因子的單克隆抗體的親和色譜法，純化重組人組織因子。并將純化的重組人組織因子應(yīng)用到凝血致活酶試劑。根據(jù)CherylLBrucatol等所著文獻(xiàn)，在酵母中表達(dá)重組兔組織因子(rTF)，然后利用組氨酸標(biāo)記純化rTF，將所得rTF應(yīng)用到凝血酶原時(shí)間測定試劑。此文獻(xiàn)報(bào)告稱，所表達(dá)的兔組織因子是由細(xì)胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞外區(qū)組成的全長因子。同樣，WO98/48283也是在酵母中表達(dá)由細(xì)胞外區(qū)、脂質(zhì)結(jié)合區(qū)、細(xì)胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成的全長重組兔組織因子，然后利用有選擇性地放大重組組織因子的組氨酸標(biāo)記，純化重組兔組織因子。將純化的兔組織因子應(yīng)用于凝血酶原時(shí)間測定試劑。如上所述，上述任何一種形式都使用經(jīng)色譜法等純化的重組組織因子來防止來源于宿主細(xì)胞的不純物混入試劑所造成的試劑凝固活性降低和測定精度降低等問題。然而，要純化重組組織因子，必須構(gòu)筑有效分離、去除來源于宿主細(xì)胞的不純物的體系。當(dāng)大量生產(chǎn)重組組織因子時(shí)，這種純化工作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)成本，給重組組織因子的生產(chǎn)效率帶來問題。比如使用特異性抗體的親和色譜法在大量純化、生產(chǎn)時(shí)，特異性抗體的使用是造成高成本的原因。使用組氨酸標(biāo)記的親和色譜法作為適于大量生產(chǎn)的純化方法在重組兔組織因子中已經(jīng)實(shí)用化。然而，根據(jù)宿主的種類和組織因子的種類不同，有些種類中組氨酸標(biāo)記與重組組織因子的結(jié)合會影響凝固活性。因此，這種純化方法一般在純化后切斷組氨酸標(biāo)記。追加這種標(biāo)記切斷步驟，是生產(chǎn)成本增加的原因。有些種類的組織因子由于其立體結(jié)構(gòu)，即使使用組氨酸標(biāo)記的色譜法也不能很好地純化。由于上述原因，在使用遺傳工程學(xué)技術(shù)的組織因子生產(chǎn)中，有必要構(gòu)筑一個(gè)既不影響凝固活性、又能滿足成本和產(chǎn)量等生產(chǎn)率的生產(chǎn)體系。而且，人們希望有一種凝固檢查試劑能夠應(yīng)用所構(gòu)筑的生產(chǎn)體系生產(chǎn)的組織因子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)
發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。本發(fā)明的第一方面提供一種凝固檢查用試劑，包含磷脂與以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主所獲得的重組組織因子的復(fù)合物；以及來源于所述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。所述重組組織因子為具有可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)的重組牛組織因子。所述重組組織因子有序列號1所示的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被缺失、附加或取代而獲得的氨基酸序列。所述重組組織因子所具有的氨基酸序列與序列號1所示的氨基酸序列有至少95%的相同性。所述昆蟲為鱗翅目昆蟲，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。所述來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份包含來源于所述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性蛋白質(zhì)。所述凝固檢查用試劑是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑、肝促凝血活酶試驗(yàn)用試劑或凝血致活酶時(shí)間用試劑。所述試劑，還包含選自于由第I因子、第V因子、硫酸鋇吸附血漿和鈣離子構(gòu)成的組群中的至少一種成份。本發(fā)明的第二方面提供一種凝固檢查用試劑的生產(chǎn)方法，包括以下步驟將組織因子的cDNA插入桿狀病毒(BacuLovirus)DNA中獲得重組桿狀病毒，讓昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞感染此重組桿狀病毒；在上述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)用上述cDNA編碼的重組組織因子；破碎表達(dá)上述重組組織因子的昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，從含所得破碎物的溶液中去除不溶性成份，獲得含上述重組組織因子的可溶性組份；以及混合上述可溶性組份和磷脂，生成上述重組組織因子和磷脂的復(fù)合物。所述cDNA對牛組織因子的可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)編碼。所述cDNA對具有序列號2所示的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被缺失、附加或取代而獲得的氨基酸序列的重組組織因子進(jìn)行編碼。所述cDNA所編碼的重組組織因子有與序列號2所示氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。所述方法，在獲得所述可溶性組份的步驟中，含破碎物的溶液含有表面活性劑圖1為顯示含有重組組織因子的溶液SW的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果的照片。圖2為顯示含有重組組織因子的溶液SF的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果的照片。圖3為對照試劑1的活性值與試劑SW的活性值的關(guān)系圖。圖4為對照試劑1的活性值與試劑SF的活性值的關(guān)系圖。圖5為在使用實(shí)施例中制備的PIVKA感受性試驗(yàn)用試劑的測定中血漿的稀釋倍率和凝固時(shí)間的關(guān)系圖。具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明一實(shí)施方式的凝固檢査用試劑包括:磷脂與以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主獲得的重組組織因子的復(fù)合物以及來源于上述毘蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。此凝固檢査用試劑含有用遺傳工程學(xué)技術(shù)制造的重組組織因子，還含有宿主為昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。但是，它顯示出能夠與含有天然凝血致活酶的傳統(tǒng)凝固檢查用試劑相匹敵的凝固活性和敏感度。因此，此凝固檢査用試劑由于使用重組組織因子取代天然凝血致活酶，所以在生產(chǎn)現(xiàn)場可以不使用造成瘋牛病等原因的大腦，非常安全。而且，此凝固檢査用試劑在其生產(chǎn)方法中可以簡化重組組織因子的純化工序，故具有優(yōu)越的生產(chǎn)效率并可期望降低生產(chǎn)成本。重組組織因子和該組織因子的磷脂復(fù)合物首先，就用于凝固檢査用試劑的重組組織因子和該重組組織因子與磷脂的復(fù)合物(以后也稱重組組織因子一磷脂復(fù)合物)進(jìn)行說明。重組組織因子由以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主、通過遺傳工程學(xué)方法生成的。作為重組組織因子有如通過遺傳工程學(xué)方法生成的重組牛組織因子、重組兔組織因子和重組人組織因子等。天然組織因子通過與磷脂復(fù)合，激活來源于人血的第VII因子。因此，作為重組組織因子至少應(yīng)該有天然組織因子的可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)。重組組織因子的可溶性區(qū)域是與第VII因子相互作用所需的區(qū)域，跨膜區(qū)則是合成與磷脂的復(fù)合物所必需的區(qū)域。更理想的重組組織因子應(yīng)該是在不破壞其與磷脂合成復(fù)合物、激活第vn因子的能力的范圍內(nèi)具有可溶性區(qū)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)。如以重組牛組織因子為例，序列號i所示氨基酸序列中的數(shù)個(gè)氨基酸被取代、附加或缺失，但可與磷脂合成復(fù)合物，激活第vn因子。具體而言，重組組織因子以其序列至少95%與序列號i所示氨基酸序列相同為宜，重組組織因子其序列至少97%與序列號1所示氨基酸序列相同更好，重組組織因子的序列最好至少99%與序列號1所示氨基酸序列相同。在此，序列號1為上述高稷裕子(音譯)等人所著文獻(xiàn)的圖3所示正常牛組織因子的氨基酸序列。即，在序列號1中，從第1位氨基酸到第213位氨基酸為可溶性區(qū)域(細(xì)胞外區(qū))，從第214位氨基酸到第236位為跨膜區(qū)，從第237位到第257位為細(xì)胞內(nèi)區(qū)。上述重組組織因子通過以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主的遺傳工程學(xué)方法生成。詳待后述。重組組織因子一磷脂復(fù)合物是磷脂結(jié)合到上述重組組織因子的跨膜區(qū)的產(chǎn)物，而且具有與天然凝血致活酶(磷脂復(fù)合物型的天然組織因子)同等程度的凝血活性。這種復(fù)合物用眾所周知的方法通過重組組織因子與磷脂混合即可制備。比如，可以用WO93/07492、WO98/48283和上述CherylLBrucatol等人的文獻(xiàn)所記載的方法制造。用于合成復(fù)合物的磷脂以含有一般碳原子數(shù)為12~22的脂肪酸的磷脂為宜。脂肪酸可以是飽和脂肪酸也可以是不飽和脂肪酸。具體而言，理想的磷脂有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰絲氨酸等。這些磷脂也可以是天然物或合成品之一。這些磷脂也可以有不同種類的脂肪酸。而且，這些磷脂根據(jù)所希望的性狀、特性等也可以將二種混合用于復(fù)合物的合成。凝固檢査用試劑作為本發(fā)明實(shí)施方式的凝固檢查用試劑含有上述重組組織因子一磷脂復(fù)合物或獲得重組組織因子時(shí)使用的來源于宿主昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。凝固檢査用試劑所含重組組織因子是用以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主的遺傳工程學(xué)方法獲得的基因。作為宿主使用的昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份是與重組組織因子一起從宿主中提取出來的，最終與重組組織因子一起含在凝固檢查用試劑中。作為宿主使用的昆蟲，對其種類沒有限定。作宿主用的昆蟲可以使用鱗翅目昆蟲。在鱗翅目昆蟲中尤以家蠶(學(xué)名^w^戸/won')更好。用作宿主的昆蟲如可以有Sf9、Sf21、HiFive等。其中，以使用Sf9更好。從宿主中提取重組組織因子時(shí)，首先要在水和緩沖液等適當(dāng)溶液中破碎作為宿主的昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過過濾和離心分離等從含有破碎所得破碎物的溶液中除去不溶成份。來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份是通過過濾從含昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞破碎物的溶液中除去不溶性成份所得濾液中可能含有的成份。或來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份是通過離心分離從含昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞破碎物的溶液中除去不溶成份所得上清液中可能含有的成份。比如，溶在昆蟲體液中的成份、溶在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)溶膠(細(xì)胞溶膠)中的成份等。具體而言，含有構(gòu)成昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性蛋白質(zhì)、水溶性糖鏈或昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性蛋白等。凝固檢查用試劑含有上述重組組織因子一磷脂復(fù)合物和上述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。也可根據(jù)凝固檢査用試劑的種類(即要檢測的凝固因子的種類)適當(dāng)?shù)卦谠噭┲刑砑幽桃蜃?、鈣離子和磷脂等。比如，如果凝固檢査用試劑為第II、第VII、第IX、第x因子測定用試劑，則試劑含有重組牛組織因子一磷脂復(fù)合物、昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。作為其他成份，試劑最好還含有第I因子、第v因子和鈣離子。也可以用除去第n因子、第VII因子、第IX因子和X因子的血衆(zhòng)取代添加第I因子和第V因子。該血漿最好使用用硫酸鋇吸附血漿(以牛血漿為宜)所得的硫酸鋇吸附血漿。硫酸鋇吸附血漿可以在血漿(以牛血漿為宜)中添加硫酸鋇，混合后再除去硫酸鋇來制備。如果凝固檢查用試劑為綜合性檢測第n、第vn、第x因子的凝固功能的肝促凝血活酶試驗(yàn)(HepaplastinTest、HPT)用試劑，則試劑含有重組兔組織因子-磷脂復(fù)合物、昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。作為其他成份，試劑最好還含有第I因子、第V因子和鈣離子。也可以用除去第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的血漿取代添加第I因子和第V因子。如果凝固檢查用試劑為凝血活酶時(shí)間用試劑，則試劑含有重組兔組織因子一磷脂復(fù)合物或重組人組織因子一磷脂復(fù)合物及昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。作為其他成份，試劑最好還含有鈣離子。上述鈣離子源一般從氯化鈣、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣等選擇。根據(jù)需要，也可以在試劑中添加選自HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycine等組群的緩沖液，使其PH值達(dá)59、最終濃度約為10100畫o有以上組份的凝固檢查用試劑雖然含有來源于獲取重組組織因子時(shí)使用的宿主昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份，但盡管如此，凝固檢查用試劑也具有可以與天然凝血致活酶試劑相匹敵的凝固活性。當(dāng)凝固檢査用試劑為含有重組牛組織因子-磷脂復(fù)合物的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑時(shí)，在對維生素K缺乏或拮抗劑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(PIVKA:proteininducedinvitaminKabsenceorantagonists)的感受性上，凝固檢査用試劑也不亞于使用天然凝血致活酶的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑。因此，凝固檢査用試劑也可以作為用于監(jiān)視華法林(Warfarin)等療效的試劑使用。所謂PIVKA是無正常凝血因子活性的前驅(qū)體的總稱。PIVKA在維生素K缺乏或維生素K拮抗物存在的情況下出現(xiàn)在血液中。比如，凝血因子中第II、第VII、第IX和第X因子都在肝臟合成。在其合成的最后階段需要維生素K。因此，當(dāng)維生素K缺乏癥、用華法林等維生素K抑制劑時(shí)，這些因子以無正常凝血因子活性的前驅(qū)體出現(xiàn)在血液中。Hemker等人的文獻(xiàn)("Kineticaspectsoftheinteractionofbloodclottingenzymes.III.DemonstrationofaninhibitorofprothrombinconversioninvitaminKdeficiency.",ThrombDiathHaemorrh,Vol.19，pages346-363,1968)禾卩Denson等人的文獻(xiàn)(DensonKW,ReedSV,HaddonME."ValidityoftheINRsystemforpatientswithliverimpairment.",ThrombHaemost,Vol.73，pases162，1995)報(bào)告稱，牛組織因子對PIVKA的感受性高，兔組織因子和人組織因子對PIVKA的感受性低。因此，現(xiàn)在檢測華法林等療效時(shí)多利用含牛組織因子的第II、第VII、第IX和第X因子測定用試劑。使用含牛組織因子的第II、第VII、第IX和第X因子測定用試劑進(jìn)行的檢測也稱為凝血試驗(yàn)(Thrombotest)。凝固檢査用試劑的生產(chǎn)方法凝固檢査用試劑的生產(chǎn)方法包括以下步驟將組織因子的cDNA插入桿狀病毒DNA獲得重組桿狀病毒，讓昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞感染桿狀病毒；讓被上述cDNA編碼的重組組織因子在上述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)；破碎表達(dá)上述重組組織因子的昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，從含有上述所得破碎物的溶液中除去不溶性成份，獲得含上述重組組織因子的可溶性成份；以及混合上述可溶性成份和磷脂，合成上述重組組織因子與磷脂的復(fù)合物。在生產(chǎn)方法中使用的組織因子的cDNA是用于目標(biāo)凝固檢査用試劑的組織因子的cDNA。組織因子的cDNA至少有編碼可溶性區(qū)域的堿基序列和編碼跨膜區(qū)的堿基序列。組織因子的cDNA最好有能夠編碼組織因子的可溶性區(qū)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)全部區(qū)域的堿基序列。比如，以牛組織因子為例，最好使用能夠?qū)π蛄刑?所示氨基酸序列(AAB20755)的堿基序列編碼或能夠?qū)υ摪被嵝蛄兄幸粋€(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸取代、附加或缺失的氨基酸序列編碼的堿基序列。具體而言，以能夠?qū)εc序列號2所示氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列編碼的堿基序列為宜，能夠?qū)χ辽?7%相同的氨基酸序列編碼的堿基序列更好，最好是能夠?qū)χ辽?9%相同的氨基酸序列編碼的堿基序列。更具體地說，可以使用能夠從Clonetech公司和Stratagene公司的cDNA庫等得到的牛組織因子的cDNA。將這種cDNA插入桿狀病毒DNA中，制備重組桿狀病毒。桿狀病毒作為基因有雙鏈環(huán)狀DNA。桿狀病毒是昆蟲病原病毒。作為桿狀病毒如有核型多角體病毒(NPV:nucleopolyhedrovirus)、GN(geanulovirus)等。作為桿狀病毒以使用NPV為宜。NPV是一種在感染的細(xì)胞內(nèi)大量合成被稱為多角體的蛋白質(zhì)的病毒。對這種多角體蛋白質(zhì)編碼的基因在桿狀病毒擴(kuò)增中是不需要的。通過將目標(biāo)組織因子的cDNA插入多角體基因的啟動子下游取代多角體基因即可以在感染細(xì)胞內(nèi)大量合成目標(biāo)組織因子。作為桿狀病毒，最好使用人為地使半胱氨酸蛋白酶基因缺失的桿狀病毒，以避免病毒產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶造成蛋白質(zhì)分解的影響。導(dǎo)入了組織因子cDNA的重組桿狀病毒可以用眾所周知的重組技術(shù)制備。比如，將組織因子cDNA插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。將所得轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞。在昆蟲細(xì)胞內(nèi)生成相同的重組，以此即可構(gòu)建組織因子cDNA被插入桿狀病毒DNA的重組桿狀病毒。當(dāng)使用含桿狀病毒的大腸桿菌DH10Bac(GibcoBRL公司)時(shí)，通過將插入組織因子cDNA的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH10Bac，即可構(gòu)建重組桿狀病毒。然后，讓作為宿主的昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞感染構(gòu)建的重組桿狀病毒。如果宿主是昆蟲，則對昆蟲種類沒有特別限定。用作宿主的昆蟲最好是鱗翅目昆蟲。鱗翅目昆蟲中尤以家蠶(學(xué)名^w6j^附on')更好。對蠶的種類無特別限定，最好使用裸蛹家蠶。裸蛹家蠶是結(jié)繭基因變異的一種。因此，裸蛹家蠶化蛹但不結(jié)繭。這種裸蛹家蠶已知有比如Nd、Ndb、Nd-s和Nd-t系統(tǒng)的家蠶。最好使用這種蠶的蛹。蛹存在于家蠶幼蟲的消化管中用于分解食物(桑)的絲氨酸蛋白酶活性比蠶蟲體低得多。可以利用這一點(diǎn)防止在蠶內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)分解。蠶蛹對桿狀病毒的感受性比幼蟲高。因此，病毒很容易在蠶蛹內(nèi)增殖，可使大量組織因子表達(dá)。當(dāng)宿主是昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，可使用Sf9、Sf21、HiFive等培養(yǎng)的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞。其中尤以Sf9為宜。使用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)的生成蛋白的組織因子可以在細(xì)胞外分泌也可在細(xì)胞內(nèi)積累。作為感染方法可以利用眾所周知的方法。比如，當(dāng)宿主為昆蟲時(shí)，可以運(yùn)用向昆蟲注射病毒液的注射法、將涂有微量病毒液的針給昆蟲接種的微量接種法?；蛘邔⒅亟M桿狀病毒轉(zhuǎn)染到昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，將所得昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間使重組桿狀病毒增殖，再將增殖的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞接種到昆蟲，這樣也可以讓昆蟲感染病毒。使用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主時(shí)，可以通過在含有病毒的培養(yǎng)液中培養(yǎng)昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞一定時(shí)間，讓昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞感染病毒。當(dāng)宿主為昆蟲時(shí)，飼養(yǎng)感染昆蟲510天。在飼養(yǎng)過程中，插入重組桿狀病毒的cDNA在宿主內(nèi)表達(dá)，在昆蟲內(nèi)生成目標(biāo)組織因子。生成的組織因子在昆蟲內(nèi)積蓄。在昆蟲內(nèi)積蓄的組織因子可以認(rèn)為其N端經(jīng)翻譯后的處理已經(jīng)被切斷。比如，以重組牛組織因子為例，在昆蟲內(nèi)積蓄的重組牛組織因子為序列號1所示因子。飼養(yǎng)一定時(shí)間后，將生成的組織因子從宿主中提取出來。當(dāng)宿主為昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，將昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞與病毒液一起培養(yǎng)27天。培養(yǎng)過程中，插入重組桿狀病毒的cDNA在宿主內(nèi)表達(dá)，在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)生成目標(biāo)組織因子。生成的組織因子在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)積蓄或在培養(yǎng)基內(nèi)分泌。與宿主為昆蟲的情況一樣，在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，可以認(rèn)為其N端經(jīng)翻譯后的處理已經(jīng)被切斷。比如，以重組牛組織因子為例，在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)積蓄的重組牛組織因子為序列號1所示因子。培養(yǎng)一定時(shí)間后，將生成的組織因子從培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)基內(nèi)提取出來。如果以昆蟲為宿主，組織因子可以通過以下方法從昆蟲提取。先破碎有重組組織因子表達(dá)的昆蟲。從含所得破碎物的溶液中除去不溶性成份。這樣就可以獲得含有上述重組組織因子的可溶性成份。昆蟲可以用攪拌器、均質(zhì)器、攪切器(blender)和超聲波等機(jī)械粉碎。機(jī)械處理還可以配合使用表面活性劑等非機(jī)械處理使用。昆蟲的破碎最好在水和緩沖液等適當(dāng)溶液中進(jìn)行。這種溶液以下稱"破碎處理液"。破碎處理液如有水、磷酸緩沖液和三羥甲基氨基甲垸緩沖液等緩沖液以及添加表面活性劑的緩沖液等。從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份可通過過濾、離心分離或這些方法適當(dāng)組合使用。若以昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主，則組織因子可以通過如下方法從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基抽取。首先破碎表達(dá)重組組織因子的培養(yǎng)細(xì)胞。從含有所得破碎物的溶液中除去不溶性成份。如此即可獲得含有上述重組組織因子的可溶性成份。培養(yǎng)細(xì)胞可用均質(zhì)器和超聲波等機(jī)械破碎。培養(yǎng)細(xì)胞還可用表面活性劑等非機(jī)械破碎溶解。也可將機(jī)械處理與非機(jī)械處理配合使用。培養(yǎng)細(xì)胞的破碎與以昆蟲為宿主時(shí)一樣，最好在適當(dāng)破碎處理液中進(jìn)行。從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份可通過過濾、離心分離或這些方法適當(dāng)組合使用。含破碎昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞所得破碎物的溶液中含有含重組組織因子的可溶性組份?？扇苄越M份含有重組組織因子和來源于宿主昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。含破碎物的溶液中除含此可溶性組份外，還含有導(dǎo)入基因時(shí)使用的桿狀病毒。表面活性劑有抑制此病毒活性的作用，因此最好在抽取上述重組組織因子時(shí)使用表面活性劑。作為表面活性劑可用非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑任何一種。從殺菌性看，最好使用非離子型表面活性劑作為表面活性劑。而且添加非離子型表面活性劑還可促進(jìn)重組組織因子的溶解。所謂破碎處理液，如上所述，是破碎宿主昆蟲和昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用的溶液。作為破碎處理液如有水、磷酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷緩沖液等緩沖液以及添加表面活性劑的緩沖液等。在破碎處理液中破碎昆蟲和昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，生成的重組組織因子和來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份會溶解在破碎處理液中。在此，所謂來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份指可溶于破碎處理液的成份，因此，即使在通過過濾和離心分離等方法從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份后，仍然可含在經(jīng)過濾除去不溶性成份所得濾液和經(jīng)離心分離除去不溶性成份所得上清中。昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份如有昆蟲體液或溶于昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)溶膠(胞質(zhì)溶膠)的成份。具體而言，如有構(gòu)成昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性蛋白質(zhì)、水溶性糖鏈、昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性蛋白等。所謂不溶性成份指不溶于上述破碎處理液的成份。具體而言，如有破碎的角質(zhì)層和細(xì)胞膜等固體成份、脂蛋白、脂質(zhì)和不溶性蛋白質(zhì)等。如此從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份，獲得不溶性成份去除液。作為不溶性成份去除液，具體來說，有過濾含破碎物溶液所得濾液和離心分離含破碎物溶液所得上清等。而且這種不溶性成份去除液可作為含重組組織因子的溶液(以下稱"重組組織因子含有液")使用。還可以HEPES等緩沖液(pH6~7)等為外液透析除去不溶性成份后的不溶性成份去除液。也可將透析后所得不溶性成份去除液作為重組組織因子含有液使用。重組組織因子-磷脂復(fù)合物的合成可以按照常規(guī)方法進(jìn)行(參照MethodsEnzymo1.,222，p173，1993等)。尤以在有鎳參與的條件下混合重組組織因子含有液和磷脂溶液，合成復(fù)合物為佳。重組組織因子一磷脂復(fù)合物的合成工序在過濾、離心分離等除去不溶性成份后進(jìn)行即可。如果要透析不溶性成份去除液，則復(fù)合物合成工序既可在透析后，也可在透析前進(jìn)行。鹽析也同樣，復(fù)合物合成工序既可在鹽析后，也可在鹽析前進(jìn)行。上述磷脂溶液含有合成復(fù)合物所用的磷脂。作為磷脂最好使用有碳原子數(shù)為12-22的脂肪酸或不飽和脂肪酸的磷脂。具體而言，可使用上述重組組織因子-磷脂復(fù)合物例示的磷脂。重組組織因子含有液和磷脂液的克分子比率約為l:101:2xl()7范圍為宜，1:30001:15000更好。作為鎳，可使用氯化鎳和硫酸鎳等鎳鹽水溶液或?qū)㈡嚾芙庠诰彌_液中形成的溶液。將以上重組組織因子含有液、磷脂液和鎳鹽溶液混合攪拌，反應(yīng)約1~2個(gè)小時(shí)，即可合成組織因子和磷脂的復(fù)合物。當(dāng)要生產(chǎn)的凝固檢査用試劑含有鈣離子時(shí)，在生產(chǎn)過程中添加氯化朽、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣等作為鈣離子源。當(dāng)要生產(chǎn)的凝固檢査用試劑是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑時(shí)，在生產(chǎn)過程中，添加第i因子和第v因子。也可用除去第n因子、第vn因子、第ix因子和第x因子的血漿取代第i因子和第v因子。作為該血漿也可使用用硫酸鋇吸附血漿(最好是牛血漿)獲得的硫酸鋇吸附血漿。硫酸鋇吸附血漿的配制無特別限定，比如可以用Charles等所著文獻(xiàn)("One-stageProthrombinTimetechniques",ThrombosisandBleedingDisordersTheoryandMethod,1971，p92-97)中記述的Owren等方法配制。另夕卜，在生產(chǎn)過程中，根據(jù)需要，還可按pH5~9、最終濃度約10100mM添加選自HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycine等組群中的緩沖液。根據(jù)需要添加的第I因子和第V因子(或硫酸鋇吸附血漿等)、韓離子源、緩沖劑等既可以在牛組織因子-磷脂復(fù)合物合成前添加，也可以在復(fù)合物合成后添加。對第I因子和第V因子、鈣離子源、緩沖劑等的添加順序也沒有特別限定。如上制備的凝固檢查用試劑含有重組組織因子-磷脂復(fù)合物和作為凝固檢查用試劑不可缺少的成份。在此，作為凝固檢查用試劑不可缺少的成份，具體而言，如果是凝血酶原時(shí)間測定試劑，則有鈣離子。如果是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑或肝促凝血活酶試驗(yàn)用試劑，則有鈣、第I因子和第V因子。也可以用硫酸鋇吸附血漿取代第I因子和第V因子。用上述配制方法制備的凝固檢查用試劑含有上述重組組織因子構(gòu)建中使用的宿主的可溶性成份。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)宿主(昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞)的可溶性成份不影響檢查中的凝血反應(yīng)。基于這一發(fā)現(xiàn)，在抽取用遺傳工程學(xué)生產(chǎn)的重組組織因子的過程中，即使不使用色譜法等對重組組織因子進(jìn)行高度純化，實(shí)際上也可以提供沒有問題的凝固檢查用試劑。因此，用上述凝固檢查用試劑的配制方法簡化了遺傳工程學(xué)方法生產(chǎn)重組組織因子的純化步驟，可望降低生產(chǎn)成本。實(shí)例以家蠶為宿主的重組組織因子的生成購買牛腦的cDNA庫(Clonetech公司)，根據(jù)非專利文獻(xiàn)1的方法用PCR擴(kuò)增牛組織因子的基因，克隆對牛組織因子的可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)編碼的全長牛組織因子編碼遺傳基因。用PCR法擴(kuò)增時(shí)，作為上游引物使用有BgIII片段的引物(5'-agatctatggcgacccccaacgggcc)，作為下游引物使用有EcoRI片段的弓1物(5'-acttaagaatacgtcgcaactcgccgc)。用DNAsequencer(DNA測序儀(4200型、萊卡))對克隆基因的堿基序列進(jìn)行測序，確認(rèn)是序列號2的蛋白質(zhì)編碼的DNA。將克隆的cDNA插入半胱氨酸蛋白酶基因缺失病毒(片倉工業(yè)、pYNG)的克隆細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。以此構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)體系，使牛組織因子表達(dá)。讓蠶蛹感染重組桿狀病毒，5"C放置7天，使之充分感染。用均質(zhì)器在緩沖液中破碎感染后的蠶蛹。通過過濾和離心分離等方法從所得破碎液中除去固形成份。在此，從牛組織因子cDNA插入桿狀病毒到除去固形成份的過程中均使用片倉工業(yè)株式會社的"Superworm"服務(wù)。從片倉工業(yè)株式會社購買除去固形成份的溶液，再對此溶液進(jìn)行均質(zhì)化(AS-1會社、轉(zhuǎn)數(shù)5000rpml0沖程)和離心分離(3000xG、8°C、10分)處理?；厥丈锨?，向8容量上清添加2容量的10%NP-40表面活性劑(Calbiochem公司)。所得混合液的NP—40表面活性劑最終濃度為2%。然后，3(TC培養(yǎng)混合液3小時(shí)，讓桿狀病毒失活，同時(shí)對重組組織因子增溶。桿狀病毒失活的確認(rèn)是根據(jù)Reed-MuencH法(Reed，L丄andMuench,H.:Amer丄Hyg.,27，493(1938))用顯微鏡目測有無病毒感染來確認(rèn)混合液的病毒價(jià)。離心分離(3000xG、8°C、30分鐘)混合液，得除去脂朊和脂質(zhì)成份的上清。接下來將所得上清用20MMHEPES(150MM氯化鈉緩沖液(pH7.2))透析(透析用纖維素管、三光純藥株式會社)。透析后，抽取透析管內(nèi)的溶液，以此作為重組牛組織因子含有液SW。此重組牛組織因子含有液SW含重組牛組織因子和來源于家蠶的可溶性成份。以Sf9為宿主的重組牛組織因子的生產(chǎn)購買牛腦的cDNA庫(Stratagene公司)，根據(jù)非專利文獻(xiàn)1的方法用PCR擴(kuò)增牛組織因子的基因，克隆對牛組織因子的可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)編碼的全長牛組織因子編碼遺傳基因。用PCR法擴(kuò)增時(shí)，作為上游引物使用有BamHI片段的引物(5'-ggatccatggcgacccccaacgggccccg)，作為下游引物使用有Xhol片段的引物(5'-ctcgagttatgcagcgttgagcggcgtg)。用4000LDNAs叫uencer(LI-COR公司)對克隆基因的堿基序列進(jìn)行測序，確認(rèn)是序列號2的蛋白質(zhì)編碼的DNA。用BamHI和Xhol消化克隆的cDNA后，將其插入轉(zhuǎn)移載休pFastBac(GIBCOBRL公司)。將此pFastBac轉(zhuǎn)移到含有桿狀病毒基因組DNA的大腸桿菌DH10Bac。最終得到導(dǎo)入了牛組織因子的cDNA的桿狀病毒(牛組織因子重組桿狀病毒)。將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染到昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf9，培養(yǎng)72小時(shí)后得到P1病毒。然后讓Sf9感染Pl病毒，在含10。/。FBS的格雷斯介質(zhì)(GraceMedium)(invitrogen公司)中培養(yǎng)4天得P2病毒。將所得P2病毒感染到其他Sf9，將感染的Sf9在Sf-900II無血清介質(zhì)(SerumFreeMedium)(invi加gen公司)中培養(yǎng)。獲取培養(yǎng)后的Sf9。用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.5、含1%CHAPS)從獲得的Sf9中抽取重組牛組織因子，制備重組牛組織因子含有液SF。此重組牛組織因子含有液SF含有重組牛組織因子和來源于Sf9細(xì)胞的可溶性成份。用重組牛組織因子含有液作SDS-PAGE用在以上配制方法過程中獲得的重組牛組織因子含有液SW和重組牛組織因子含有液SF進(jìn)行SDS-PAGE(十二垸基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)。在10pL重組牛組織因子含有液SW中添加SDS上樣緩沖液pH7.5(含200MMTris、72MM甘氨酸、0.02%SDS)10pL。將所得混合液IOO'C沸騰5分鐘，制備SDS用試樣(SDS用試樣SW)。將所得SDS用試樣SW10pL注入5~10%聚丙烯酰胺梯度凝膠孔，用電泳槽(微型蛋白質(zhì)II電泳裝置(日本伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品株式會社))加電50V泳動3小時(shí)。泳動后用銀色染色試劑盒(第一化學(xué)藥品株式會社)對聚丙烯酰胺凝膠染色。其結(jié)果如圖1所示。在圖1中，條帶1為分子量標(biāo)記(標(biāo)準(zhǔn)品、日本伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品株式會社))，條帶2為SDS用試樣SW的泳動結(jié)果。重組牛組織因子的條帶出現(xiàn)的位置(約是分子量40kDa的位置)用箭頭表不o在IOmL重組牛組織因子含有液SF中添加2xSDS上樣緩沖液pH7.5(含200MMTris、72MM甘氨酸、0.02%SDS)10jxL。將所得混合液IOO'c沸騰5分鐘，制備SDS用試樣(SDS用試樣SF)。將所得sds用試樣SF10mL注入510%聚丙烯酰胺梯度凝膠孔，用電泳槽(微型蛋白質(zhì)n電泳裝置(日本伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品株式會社))加電ioov泳動1小時(shí)。泳動后用ccb染色試劑盒(和光純藥工業(yè)株式會社)對聚丙烯酰胺凝膠染色。其結(jié)果如圖2所示。在圖2中，條帶1為分子量標(biāo)記(標(biāo)準(zhǔn)品、日本伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品株式會社))，條帶2為SDS用試樣SF的泳動結(jié)果。重組牛組織因子的條帶出現(xiàn)的位置(約為分子量40kDa的位置)用箭頭表不。由圖1和圖2的結(jié)果可以看出，重組牛組織因子含有液SW中和重組牛組織因子含有液SF中除重組牛組織因子外還含有大量來源于宿主的蛋白質(zhì)。由圖1的結(jié)果可以認(rèn)為，重組牛組織因子在重組牛組織因子含有液SW中的純度約為5~10%左右。由圖2的結(jié)果可以認(rèn)為，重組牛組織因子在重組牛組織因子含有液SF中的純度約為15%左右。重組牛組織因子-磷脂復(fù)合物的合成先將基礎(chǔ)大豆卵磷脂0.4g(日清制油株式會社)溶解到0.25%去氧膽酸鈉doc(20ML)中。用旋轉(zhuǎn)混合器在室溫下讓基礎(chǔ)大豆卵磷脂完全溶解，在該混合液中懸浮1,2-油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)O.lg禾口1,2畫二油稀基-sn畫甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(l,2-dioleyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)0.3g(均為Avantipolarlipid、Inc.產(chǎn)品)，配制磷脂溶液。在此磷脂溶液37.5ML中添加0.5M氯化鎳溶液5ML、10MMHEPES緩沖液(pH7.3)5.0ML和上述重組牛組織因子含有液(重組牛組織因子含有液SW或重組牛組織因子含有液SF)2.5ML。將所得混合液旋渦攪拌30秒。攪拌后用BRANSON#2210型超聲波裝置在37"下讓混合液反應(yīng)15分鐘后，37。C放置1小時(shí)。將混合液移至透析膜(透析用纖維素管、三光純藥工業(yè)株式會社)，用10MMHEPES(含0.15M氯化鈉)pH7.3進(jìn)行三次透析，得透析管內(nèi)經(jīng)透析后的溶液，將此作為牛組織因子-磷脂復(fù)合物含有液(重組牛組織因子-磷脂復(fù)合物含有液SW或重組牛組織因子-磷脂復(fù)合物含有液SF)使用。第II、第VII、第DC、第X因子檢査用試劑的制備(1)硫酸鋇吸附血漿的配制在添加了檸檬酸的牛血漿中加入牛血漿的30w/v。/。量的硫酸鋇和牛血漿的20v/v。/。量的生理鹽水，用旋轉(zhuǎn)混合器攪拌60分鐘。將此混合液以4°C5000rpm離心分離15分鐘后，回收上清。在此上清中逐滴添加該上清的30w/vW量的硫酸鋇。這樣，血漿中的第II、第VII、第IX、第X因子即吸附于硫酸鋇中。然后，再離心分離，回收上清。將該上清注入透析管(透析用纖維素管、三光純藥工業(yè)株式會社)，以生理鹽水為外液在28'C進(jìn)行透析。用0.45pm的濾膜過濾透析管內(nèi)經(jīng)透析后的溶液。以所得濾液為硫酸鋇吸附血漿，用于以下試劑的制備。(2)第H、第VII、第IX、第X因子檢査用試劑的制備將上述配制的牛組織因子-磷脂復(fù)合物含有液和硫酸鋇吸附血漿以及40mMHEPES緩沖液(含pH7.3、4mM乳酸轉(zhuǎn))以1:2:1的比率混合攪拌，制備第II、第VII、第IX、第X因子檢查用試劑。在此，以用重組牛組織因子-磷脂復(fù)合物含有液sw制備的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑為試劑SW，以用重組牛組織因子-磷脂復(fù)合物含有液SF制備的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑為試劑SF。例1來源于蠶的可溶性成份對凝血活性的影響基于上述制備方法制備試劑SW3批(SW-1、SW-2和SW-3)。由未感染桿狀病毒的家蠶按上述制備方法制備第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑sw。以此為試劑sw(未感染)。試劑sw(未感染)中雖然含有來源于家蠶個(gè)體的可溶性成份，但是不含來源于重組牛組織因子和桿狀病毒的可溶性成份。再讓蠶蛹感染未插入牛組織因子cDNA的桿狀病毒，根據(jù)上述制備方法從感染的蠶蛹制備第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑SW。以此為試劑SW(不含cDNA)。試劑SW(不含cDNA)中雖然含有來源于蠶蛹個(gè)體及來源于桿狀病毒的可溶性成份，但是不含重組牛組織因子。用這五種試劑(SW-1、SW-2、SW-3、SW(未感染)和SW(不含cDNA))分別用全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津制作所(株))測定正常血漿的凝固時(shí)間(秒)。再將上述五種試劑以生理鹽水稀釋2倍、稀釋4倍、稀釋8倍制備稀釋試劑，用這些稀釋試劑同樣測定正常血漿的凝固時(shí)間(秒)。作為正常血漿，使用的是正常值質(zhì)控血漿N(希森美康(株))。用各種試劑獲得的凝血時(shí)間(秒)的結(jié)果如表l所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在表1中，當(dāng)使用試劑SW(未感染)和試劑SW(不含cDNA)時(shí)，沒有檢測出凝固時(shí)間。而當(dāng)使用試劑SW-1、試劑SW-2、試劑SW-3時(shí)，檢測出凝固時(shí)間。由此得知，試劑中所含來源于蠶個(gè)體的可溶性成份和來源于桿狀病毒的可溶性成份不引起凝血反應(yīng)。而且，試劑SW-1、試劑SW-2和試劑SW-3均隨著稀釋倍率的增高而凝固時(shí)間延長。試劑的稀釋倍率越高，試劑中的重組牛組織因子的濃度越低。由此可以確認(rèn)，試劑中的重組牛組織因子的濃度變化與凝固時(shí)間之間存在相關(guān)關(guān)系。從上得知，試劑中所含來源于蠶個(gè)體的可溶性成份和來源于桿狀病毒的可溶性成份不對血液的凝固反應(yīng)產(chǎn)生影響。因此，制備凝固檢查用試劑時(shí)不必純化重組組織因子、除去這些可溶性成份。進(jìn)而可以認(rèn)為，以Sf9等昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主時(shí)，來源于宿主的可溶性成份也同樣不會影響血液的凝固反應(yīng)。例2試劑SW和試劑SF的敏感度分別使用上述方法制備的試劑SW和試劑SF用全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津制作所(株))測定4種Ak-Calibrant(AK校準(zhǔn)品)(AK-Aa、AK-Bb、AK-Cc和AK-Dd，均為Immuno公司制，奧地利)的凝固時(shí)間(秒)及國際標(biāo)準(zhǔn)敏感度指數(shù)(ISI值)。Ak-Calibrant(AK校準(zhǔn)品)是具有在OQUASTA檢測中被預(yù)先確定INR顯示值的校準(zhǔn)品。使用算出的已知ISI值的復(fù)合因子T"KOKUSAI"作為對照試劑1與上述同樣測定AK校準(zhǔn)品的凝固時(shí)間(秒)和ISI值。復(fù)合因子T"KOKUSAI"是以牛組織因子-磷脂復(fù)合物為天然牛大腦凝血致活酶的市場銷售的凝血致活試驗(yàn)(TT)試劑。另外，作為對照試劑2制備了含純化的重組牛組織因子的第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑。用此對照試劑2與上述同樣測定AK校準(zhǔn)品的凝固時(shí)間(秒)及ISI值。對照試劑2除在制備試劑SW的工序中進(jìn)行硫銨鹽析以使重組牛組織因子含有液SW中所含重組牛組織因子純度達(dá)約95%以上外，其他均與試劑SW—樣制備。且試劑SW、試劑SF和對照試劑2在測定正常值質(zhì)控血漿N(希森美康(株))時(shí)，調(diào)制得可以得出與使用對照試劑1時(shí)相同的凝固時(shí)間。用各試劑測得的凝固時(shí)間(秒)和ISI值的結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從表2結(jié)果可以確認(rèn)，試劑SW和試劑SF對于校準(zhǔn)品AK-AaAK-Dd顯示與對照試劑1和對照試劑2同等程度的凝固時(shí)間和敏感度。據(jù)此得知，試劑SW和試劑SF的任何一個(gè)均顯示出與使用天然牛腦凝血致活酶的傳統(tǒng)試劑和含純化重組牛組織因子的試劑同樣的凝固時(shí)間和敏感度。例3試劑SW或試劑SF與對照試劑的凝固活性的相關(guān)性使用與上述例2中所用同樣試劑(試劑SW、試劑SF、對照試劑1和對照試劑2)用全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津制作所(株))測定服用華法林(Warfarin)患者的血漿(N=20)的凝固活性(％)。繪制用于計(jì)算活性值(％)的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的是正常值質(zhì)控血漿N(希森美康(株))。服用華法林患者的血漿使用的是Multi-CoumadinSet(GeorogeKingBiomedical公司)。使用各種試劑所得的活性值(％)結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>從表3的結(jié)果可以確認(rèn)，對于各種血漿標(biāo)本，試劑SW和試劑SF均顯示出與對照試劑1和對照試劑2同等程度的活性值。由此得知，試劑SW和試劑SF的任何一個(gè)均顯示出與使用天然牛腦凝血致活酶的傳統(tǒng)試劑和含純化重組牛組織因子的試劑同樣的活性值。針對各種血漿標(biāo)本，使用對照試劑1時(shí)的活性值和使用試劑SW時(shí)的活性值的關(guān)系圖如圖3所示。使用對照試劑1時(shí)的活性值和使用試劑SF時(shí)的活性值的關(guān)系圖如圖4所示。圖3的橫軸表示用對照試劑1測定吋的活性值(%)，縱軸表示用試劑SW測定時(shí)的活性值(％)。圖4的橫軸表示用對照試劑l.測定時(shí)的活性值(％),縱軸表示用試劑SF測定時(shí)的活性值(％)。正如圖3和圖4所明示，試劑SW的活性值(％)和試劑SF的活性值(%)均與傳統(tǒng)的對照試劑1的活性值(％)之間存在很高的相關(guān)性。由此得知，本實(shí)施例的試劑SW和試劑SF的活性相當(dāng)于使用天然牛腦凝血致活酶的傳統(tǒng)試劑。例4第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑對PIVKA的感受性用重組牛組織因子含有液SW測試PIVKA的感受性。具體而言，將第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑SW與20MM氯化鈣溶液等量混合。再將所得混合液與人吸附血漿混合，制備PIVKA感受性試驗(yàn)用試劑。作為對照，再用含有從牛腦抽取的凝血致活酶的牛腦來源凝血致活酶溶液和含有從兔腦抽取的凝血致活酶的兔腦來源凝血致活酶溶液與上述同樣制備PIVKA感受性試驗(yàn)用試劑。用制備的PIVKA感受性試驗(yàn)用試劑通過全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津制作所(株))測定正常血漿和3種華法林服用患者血漿的凝固時(shí)間。正常血漿使用的是正常值質(zhì)控血漿N(希森美康(株))和用生理鹽水將其稀釋的溶液。正常值質(zhì)控血漿N的稀釋倍率為稀釋3倍、稀釋5倍和稀釋7倍。華法林服用患者血漿使用Multi-CoumadinSet(GeorogeKingBiomedical公司)及其用生理鹽水稀釋的溶液。華法林服用患者血漿的稀釋倍率為稀釋2倍、稀釋3倍和稀釋5倍。所得結(jié)果如圖5所示。圖5的A為使用重組牛組織因子含有液SW時(shí)的結(jié)果。B為使用牛腦來源凝血致活酶溶液時(shí)的結(jié)果。C為使用兔腦來源凝血致活酶溶液時(shí)的結(jié)果。圖5的縱軸為凝固時(shí)間(秒)，橫軸為血漿的稀釋倍率。按照Hemker和Denson等方法探討對PIVKA的感受性。按照Hemker和Denson等方法比較正常血漿所示直線和華法林服用患者血漿所示直線。此時(shí)你會發(fā)現(xiàn)，使用牛腦來源凝血致活酶溶液時(shí)(圖5B)在華法林服用患者血漿有由PIVKA造成的抗凝(虛線)。另一方面，使用兔腦來源凝血致活酶溶液時(shí)(圖5C)沒有由PIVKA造成的抗凝(虛線)。因此可以說，天然的牛凝血致活酶對PIVKA有感受性，但天然的兔凝血致活酶對PIVKA感受性很低。這種結(jié)果與Hemker和Denson等的報(bào)告一致。使用第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑sw時(shí)(圖5A)所得結(jié)果與使用牛腦來源凝血致活酶溶液時(shí)(圖5B)—致。從這些結(jié)果可以確認(rèn)，本實(shí)施例試劑中的重組牛組織因子和磷脂的復(fù)合物顯示出與天然牛凝血致活酶同樣的性質(zhì)。還了解到，第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑SW中所含來源于蠶的可溶性成份不會對PIVKA感受性產(chǎn)生影響。從以上各實(shí)施例的結(jié)果得知，上述凝固檢査用試劑盡管含有來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份，但仍顯示出與傳統(tǒng)凝固檢查試劑同樣的敏感度和凝固活性。由此得知，上述凝固檢査用試劑可以替代傳統(tǒng)的凝固檢查用試劑使用。另外，用于上述凝固檢查用試劑的重組組織因子因?yàn)榭梢院喕兓ば?，因此可望比傳統(tǒng)的用重組組織因子的凝固檢査方法生產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低。序列表<110〉<120><勝<170><210〉<211〉<212><213〉希森美康株式會社凝固檢査用試劑及其試劑的生產(chǎn)方法2Patentlnversion3.11257PRT黃牛<400>1ThrAspValValVslAlaTyrAsnlieThrTrpLysSerThrAsnPhe151015LysThrlieLeuGluTrpGluProLysProlieAsnHisValTyrThr202530ValGinlieSerProArgLeuGlyAsnTrpLysAsnLysCysPheTyr35'40■45ThrThrAsnThrGluCysAspValThrAspGlulieValLysAsnVal505560ArgGluThrTyrLeuAI3ArgValLeuSerTyrProAlaAspThrSer65707580SerSerThrValGluProProPheThrAsnSerProGluPheThrPro859095TyrLeuGluThrAsnLeuGlyGinProThrlieGinSerPheGluGin100105110ValGlyThrLysUuAsnValThrValGinAspAlaArgThrLeuVal115120125ArgAlaAsnSerAlaPheLeuSerLeuArgAspValPheGlyLysAsp130135140LeuAsnTyrThrLeuTyrTyrTrpLysAlaSerSerThrGlyLysLys145150155t60LysAlaThrThrAsnThrAsnG1yPheLeulieAspValAspLysGly165170175GluAsnTyrCysPheHisValGinAlaVallieLeuSerArgArgVal180185190AsnGinLysSerProGluSerProlieLysCysThrSerHisGluLys195200205ValLeuSerThrGluLeuPhePhelielieGlyThrValMetLeuVal210215220lielieliePhelieValValLeuSerValSerUuHisLysCysArg225230235240LysValArgAlaGluArgSerGlyLysGluAsnThrProLeuAsnAla245250255Ala<210〉<211〉<212〉<213〉2292PRT黃牛<400>2MetAlaThrProAsnGlyProArgValProCysProC'lnAlaAlaVal1510i>AlaArgAlaLeuLeuPheGlvLeuValLeulieGinGlyAlaGlyVal202530AlaGlyThrThrAspValValValAlaTyrAsnlieThrTrpLysSer354045ThrAsnPheLysThrlieUuGluTrpGluProLysProlieAsnHis505560ValTyrThrValGinlieSerProArgLeuGlyAsnTrpLysAsnLys65707580CysPheTyrThrThrAsnThrGluCysAspValThrAspGlulieVal859095LysAsnValArgGluThrTyrLeuAlaArgValLeuSerTyrProAla100105110AspThrSerSerSerThrValGluProProPheThrAsnSerProGlu115120125PheThrProTyrLeuGluThrAsnLeuGlyGinProThrlieGinSer130135140PheGluGinValGlyThrLysLeuAsnValThrVaCinAspAisArg145150155160ThrLeuValArgAlaAsnSerAlaPheLeuSerLeuArgAspValPhe165170175GlyLysAspLeuAsnTyrThrLeuTyrTyrTrpLysAlaSerSerThr18C185190GlyLysb/sLysMaThrThrAsnThrAsnGlyPheLeulieAspVal"5200205AspLysGlyGluAsnTyrCysPheHisValGinAlaVallieLeuSer210215220ArgArgValAsnGinLysSerProGluSerProlieLysCysThrSer225230235240HisGluLysValLeuSerThrGluLeuPhePhelielieGlyThrVal245.250255MetLeuVallielieliePhelieValValLeuSerValSerLeuHis260265270LysCysArgLysValArgAlaGluArgSerGlyLysGiuAsnThrPro275280285.LeuAsnAlaAla290權(quán)利要求1.一種凝固檢查用試劑，其含有磷脂與以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主所獲得的重組組織因子的復(fù)合物；以及來源于所述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。2.權(quán)利要求1所述試劑，其特征在于所述重組組織因子為具有可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)的重組牛組織因子。3.權(quán)利要求l所述試劑，其特征在于所述重組組織因子有序列號1所示的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被缺失、附加或取代而獲得的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1所述試劑，其特征在于所述重組組織因子所具有的氨基酸序列與序列號1所示的氨基酸序列有至少95%的相同性。5.權(quán)利要求l所述試劑，其特征在于所述昆蟲為鱗翅目昆蟲。6.權(quán)利要求5所述試劑，其特征在于所述鱗翅目昆蟲是家蠶。7.權(quán)利要求l所述試劑，其特征在于所述來源于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份包含來源于所述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性蛋白質(zhì)。8.權(quán)利要求l所述試劑，其特征在于所述凝固檢査用試劑是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑、肝促凝血活酶試驗(yàn)用試劑或凝血致活酶時(shí)間用試劑。9.權(quán)利要求l所述試劑，其特征在于其還包含選自于由第I因子、第V因子、硫酸鋇吸附血漿和鈣離子構(gòu)成的組群中的至少一種成份。10.—種凝固檢査用試劑的生產(chǎn)方法，包括以下步驟將組織因子的cDNA插入桿狀病毒DNA中獲得重組桿狀病毒，讓昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞感染此重組桿狀病毒；在所述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中讓用所述cDNA編碼的重組組織因子進(jìn)行表達(dá)；破碎表達(dá)所述重組組織因子的昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，從含所得破碎物的溶液中去除不溶性成份，獲得含所述重組組織因子的可溶性組份；以及混合所述可溶性組份和磷脂，合成所述重組組織因子和磷脂的復(fù)合物。11.權(quán)利要求10所述方法，其特征在于所述cDNA對牛組織因子的可溶性區(qū)域和跨膜區(qū)編碼。12.權(quán)利要求10所述方法，其特征在于所述cDNA對具有序列號2所示的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸被缺失、附加或取代而獲得的氨基酸序列的重組組織因子進(jìn)行編碼。13.權(quán)利要求10所述方法，其特征在于所述cDNA所編碼的重組組織因子有與序列號2所示氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。14.權(quán)利要求10所述方法，其特征在于在獲得所述可溶性組份的步驟中，含破碎物的溶液含有表面活性劑。全文摘要本發(fā)明提供一種凝固檢查用試劑。此凝固檢查用試劑含有磷脂與以昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為宿主獲得的重組組織因子的復(fù)合物以及來源于所述昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性成份。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)這種凝固檢查用試劑的方法。文檔編號G01N33/86GK101183109SQ20071018781公開日2008年5月21日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日發(fā)明者奧田昌宏,結(jié)城雅之,谷口友邦申請人:希森美康株式會社