專利名稱：：一種檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水產(chǎn)學(xué)科生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及一種檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
：螺原體類(spiroplasma)微生物能在淡水甲殼動(dòng)物及其他經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物(克氏原螯蟲下和南美白對(duì)蝦等)中傳播，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖構(gòu)成了極大的威脅。目前水生動(dòng)物螺原體病原的檢測(cè)可以利用光鏡，電鏡技術(shù)，微生物學(xué)，和分子生物學(xué)方法，這些技術(shù)已運(yùn)用于我們實(shí)驗(yàn)室蝦蟹類螺原體病原的常規(guī)檢測(cè)，但這些檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要特定的專業(yè)技能和儀器設(shè)備，很難在生產(chǎn)實(shí)際中推廣運(yùn)用。以血清學(xué)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)方法在不需要特殊儀器的情況下，可直接通過肉眼觀察顏色反應(yīng)變化來(lái)鑒別檢測(cè)結(jié)果，具有簡(jiǎn)潔方便，特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，所以快速有效的檢測(cè)方法和試劑盒急待開發(fā)。特別是其多抗制備條件需要進(jìn)行不斷摸索，以便獲得高效價(jià)的抗體，為試劑盒研制奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被液、洗滌液、小牛血清、一抗血清、酶結(jié)合物工作液(二抗)、顯色液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和酶標(biāo)板條；所說(shuō)的顯色液分為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、擰檬酸-磷酸鹽緩沖液和雙氧水；所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照是含水生動(dòng)物螺原體的樣本，陰性對(duì)照是不含螺原體的樣本，一抗血清為水生動(dòng)物螺原體的多克隆抗體，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體。本試劑盒中所用的包被液、洗滌液、顯色液、終止液、小牛血清以及酶結(jié)合物工作液是酶聯(lián)免疫中常規(guī)試劑。具體地，所說(shuō)的包被液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸緩沖液；洗滌液為含0.05%吐溫-20、pH7.4的磷酸緩沖液；顯色液成份有檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)固體，30%過氧化氫液體；終止液為2mol/L硫酸溶液。所說(shuō)的酶標(biāo)板條優(yōu)選12孔。上述所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照中的水生動(dòng)物螺原體，優(yōu)選蟹螺原體Spiroplasma.CRAB，龍蝦螺原體Spiroplasma.CRAYFISH和南美白對(duì)蝦螺原體Spiroplasma.SHRIMP。其中，水生動(dòng)物螺原體的多克隆抗體可通過常規(guī)的動(dòng)物免疫方法(免疫抗原采用破碎或全菌的，滅活或不滅活，免疫方式采用腹部皮下注射，耳靜脈注射，注射加佐劑或不加佐劑注射，3次和4次免疫)獲得，但本發(fā)明推薦用以下方法制備采用經(jīng)甲醛滅活后的螺原體全菌作為免疫抗原，在健康新西蘭大耳兔腹部多點(diǎn)與耳靜脈相結(jié)合進(jìn)行4次人工免疫，前兩次注射抗原加等體積佐劑，經(jīng)效價(jià)檢測(cè)后，通過心臟抽血，分離獲得高效價(jià)螺原體多克隆抗體。本發(fā)明的檢測(cè)原理為在檢測(cè)中，將對(duì)照樣本和待檢樣本分別包被微孔板(聚苯乙烯微量滴定板)，孵育后，經(jīng)洗滌加入制備好的水生動(dòng)物螺原體多克隆抗體(一抗)，該抗體與結(jié)合在微孔板上的抗原發(fā)生特異性結(jié)合；洗滌后除去未結(jié)合的抗體，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG多抗(二抗)；孵育后再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，顯色后終止。陽(yáng)性對(duì)照顯示出黃色，陰性對(duì)照則無(wú)顯色，根據(jù)待測(cè)樣本的顯色反應(yīng)與對(duì)照進(jìn)行比對(duì)，即可得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒，主要采用間接ELISA方法，檢測(cè)水生動(dòng)物血液和肌肉樣品中的螺原體，該試劑盒使用方便，快速，經(jīng)濟(jì)，敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，便于推廣應(yīng)用，能有效的檢出樣本中的螺原體。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例中所說(shuō)的螺原體是依照現(xiàn)有技術(shù)從患顫抖病的中華絨螯蟹，患系統(tǒng)性疾病的龍蝦和南美白對(duì)蝦體內(nèi)分別分離培養(yǎng)出蟹螺原體Spiroplasma.CRAB,龍蝦螺原體Spiroplasma.CRAYFISH和南美白對(duì)蝦螺原體Spiroplasma.SHRIMP;申請(qǐng)人保存的上述菌抹20年內(nèi)可以向公眾提供。實(shí)施例1:檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒(1)抗原的制備從患顫抖病的中華絨螯蟹，患系統(tǒng)性疾病的龍蝦和南美白對(duì)蝦體內(nèi)分別分離培養(yǎng)出蟹螺原體Spiroplasma.CRAB，龍蝦螺原體Spiroplasma.CRAYFISH和南美白對(duì)蝦螺原體Spiroplasma.SHRIMP,在R2培養(yǎng)基中傳代2—3代后的菌株進(jìn)行冷凍干燥或一70度保存?？乖苽鋵⒎蛛x、培養(yǎng)獲得的蝦蟹螺原體(蟹螺原體Spiroplasma.CRAB，龍蝦螺原體Spiroplasma.CRAYFISH或南美白對(duì)蝦螺原體Spiroplasma.SHRIMP病原，采用0.4%甲醛12-15小時(shí)滅活。滅活病原以12000r/min離心50min，洗滌，離心，重復(fù)3次，制備成抗原，并用電鏡鑒定抗原純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。然后置4"C冰箱保存?zhèn)溆?。病菌培養(yǎng)物上置電鏡銅網(wǎng)吸附2min，濾紙吸干后滴一滴4%戊二醛液，20s后吸干，滴一滴2%磷鉤酸鈉，放置5s，置于日立H-600型透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡下觀察，可見其含大量的螺原體，未見雜菌。通過光鏡計(jì)數(shù)法測(cè)得濃度為1()S個(gè)/ml。紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗原蛋白濃度，根據(jù)公式蛋白濃度(g/L)=(樣品吸光值/標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值)*標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度計(jì)算得出。(2)—抗血清(多克隆抗血清)的制備選用2公斤以上健康雄性健康新西蘭大耳兔作為免疫動(dòng)物，將分離培養(yǎng)的螺原體作為免疫抗原，216嗎/ml，4'C保存；然后進(jìn)行免疫注射程序，將0.9ral免疫抗原加0.9ml弗氏完全佐劑，充分混合，在家兔腹部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.3ml(第一次免疫)；第一次免疫一周后，用lml免疫抗原加lml弗氏完全佐劑，充分混合，在家兔腹部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.4ml(第二次免疫)；第二次免疫一周后，用0.4ml免疫抗原耳靜脈注射(第三次免疫)；第三次免疫一周后耳靜脈微量取血，間接ELISA測(cè)3免抗體效價(jià)，若達(dá)不到要求次曰繼續(xù)耳靜脈注射0.5ml進(jìn)行4免；一周后，心臟采血，分離血清，加入O.l%NaN3，在-70。C下保存，得中華絨螯蟹顫抖病病原菌純培養(yǎng)物TDA的多克隆抗體。(3)酶結(jié)合物工作液(二抗)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。(4)陽(yáng)性、陰性對(duì)照的制備陽(yáng)性對(duì)照取自具有典型顫抖病癥狀的蟹和患螺原體病的蝦，病蟹血上置電鏡銅網(wǎng)吸附2min，濾紙吸干后滴一滴4%戊二醛液，20s后吸干，滴一滴2%磷鎢酸鈉，放置5s，置于日立H-600型透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡下觀察，可見其含大量的螺原體。陰性對(duì)照來(lái)自健康蟹和蝦血液則觀察到背景干凈，沒有螺原體。(5)小牛血清購(gòu)自中美合資蘭州民海生物工程有限公司。(6)其他試劑的配制包被液pH9.6的碳酸緩沖液；洗滌液pH7.4，含0.05%吐溫-20的磷酸緩沖液；顯色液分為檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)固體，30%過氧化氫液體；終止液2mol/ml硫酸溶液。(7)酶標(biāo)條FEP11096,96孔可拆板，購(gòu)自南京布克生物技術(shù)有限公司。(8)檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒1#碳酸緩沖液(包被液)1,2ml(1.5ml離心管)2#洗板用洗滌液50ml(1個(gè)50ml冷凍管)3#小牛血清280^1(5ml冷凍管)4#一抗3|al(1.5ml離心管)5#二抗0.4^1U.5ml離心管)6#TMB0.15mg(PCR管)7#檸檬酸-磷酸鹽緩沖液1.5ml(1.5ml離心管)8#雙氧水7》1(PCR管)9#終止液1.3ml(1.5ml離心管)10#陽(yáng)性對(duì)照5^1(1.5ml離心管)11#陰性對(duì)照5nl(1.5ml離心管)酶標(biāo)條1條12孔實(shí)施例2:最佳反應(yīng)條件的建立間接ELISA工作濃度的確定固定抗原的濃度150嗎/ml，系列稀釋抗血清的濃度l:50，1:250，1:1250，1:6250，1:31250，1:156250用間接ELISA技術(shù)測(cè)定抗體效價(jià)及最佳工作濃度；采用交叉連續(xù)稀釋法確定免疫血清的最佳工作濃度，抗原濃度恒定183pg/ml，調(diào)節(jié)免疫血清的稀釋度l:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400。經(jīng)間接ELISA反應(yīng)后，獲得在人=450處的吸收值；如表1所示，制備的免疫血清用間接ELISA測(cè)定的效價(jià)為1:31250;如表2所示，最佳工作濃度選取陽(yáng)性/陰性〉2.1，陽(yáng)性結(jié)果od值為l.O左右，對(duì)應(yīng)的一抗血清稀釋度為1:400;相應(yīng)包被抗原濃度為l:20，過高和過低的稀釋度都會(huì)增加非特異吸附。表l兔免疫血清效價(jià)OD值測(cè)定一抗比例1/501/2501/12501/62501/312501/156250陰性對(duì)照0.0610.0240.010.0040.0030.0033免血清1.9191.3890.9770.5850.2350.064免血清2.2721.6511.2190.8350.4990.188空白0.009注3免4免都是31250表2最佳工作濃度OD值測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3:間接ELISA方法的敏感性、特異性、重復(fù)性，保存期驗(yàn)證(1)敏感性根據(jù)實(shí)施例2確定的一抗最佳工作濃度和二抗推薦的工作濃度，系列稀釋抗原濃度，以確定最小檢測(cè)的抗原濃度；免疫血清抗體的濃度恒定為1:400;酶標(biāo)二抗的工作濃度恒定l:3000，而抗原的濃度改變范圍為0.573pg/ml-34.2pg/ml，測(cè)定免疫血清對(duì)抗原的敏感度；結(jié)果如表3可見，用此方法可測(cè)的0.573|ig/ml的抗原蛋白量。表3不同抗原稀釋度的ELISA檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>①?gòu)娘@色反應(yīng)觀察，本法最低檢測(cè)是在第7個(gè)滴度1/320，即34.2*5*1/32(^0.537ng/ml,檢測(cè)范圍為0.537嗎/ml—34.2pg/ml.②從OD值可以看出，最低檢測(cè)值也是第7個(gè)滴度約0.06左右。(2)特異性選擇嗜水氣單胞菌Jeraw朋as7/>^rap/7a，霍亂菌屬WZ)n'oC/zo/erae(江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心饋贈(zèng))，大腸桿菌Eycfew/c/z/aCo仏銅綠假單孢菌PwwtfomoraaJen/g/wwa，XcZ，鏈霧菌屬5^"e/7to附y(tǒng)c^s/，SDD，枯草桿菌5acZ〃tw5"w&z7/s，BS，不動(dòng)桿菌屬A7'恥to^c^^,W22，油菜花螺原體CR-1，蜜蜂的螺原體，CH-1(均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境微生物農(nóng)業(yè)部國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))與多克隆抗血清交叉反應(yīng)來(lái)判斷抗血清的特異性，實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的濃度為10S個(gè)/ml;由螺原體免疫實(shí)驗(yàn)兔所得的抗血清除了與水產(chǎn)螺原體有正常顯色反應(yīng)外，與水產(chǎn)常見細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)，與來(lái)自油菜花和蜜蜂的螺原體有非常弱的反應(yīng)，從顯色上能完全與陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)別，因此本實(shí)驗(yàn)室制備的多克隆血清為專一性較高的抗螺原體血清；(3)重復(fù)性通過人工回感實(shí)驗(yàn)，將發(fā)病蟹分為強(qiáng)陽(yáng)性，中陽(yáng)性，弱陽(yáng)性三類，每一類選取3只，每只重復(fù)檢測(cè)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是批間還是批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，本方法重復(fù)性良好。(4)保存2-8'C避光保存6個(gè)月，室溫27-29'C可存放至少8天，37°C以上存放不要超過24小時(shí)。實(shí)施例4:樣品的檢測(cè)間接ELISA病原檢測(cè)(環(huán)境25-27度，檢測(cè)3個(gè)樣品為準(zhǔn)，3次重復(fù)/樣)，用實(shí)施例1所說(shuō)的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，其操作為取樣血液檢測(cè)用lml注射器從蝦蟹附肢抽取血液以1:1與磷酸緩沖液(PBS)混合，混合液為待檢測(cè)樣；肌肉檢測(cè)用剪刀取1立方厘米大小的肌肉組織放入500nlPBS中將組織搗碎，取上清液待檢測(cè)。加樣和溫育-每孔滴加5(al檢測(cè)樣品和lOOpl碳酸緩沖液(1號(hào))的混合液，保鮮膜包裹，室溫30min溫育；lO號(hào)ll號(hào)內(nèi)分別注入lOOpl碳酸緩沖液(l號(hào))，將每管混合液分別滴入孔內(nèi)；洗滌溫育結(jié)束甩干，每孔注入洗滌液(2號(hào)，八成滿)靜置3分鐘后甩干，此操作重復(fù)3次，最后一次甩干后在吸水紙輕拍擊以促使水分吸干；配制稀釋液從第2號(hào)管取2.5ml液體加入第3號(hào)管，配成稀釋液；加一抗從第3號(hào)管取1.2mL稀釋液滴入4號(hào)混勻，100^1/孔，保鮮膜包裹，室溫30min溫育；洗滌溫育結(jié)束甩干，每孔注入洗滌液(八成滿)靜置3分鐘后甩干，此操作重復(fù)3次，最后一次甩干后在吸水紙輕拍擊以促使水分吸干；加二抗從第3號(hào)管1.2mL稀釋液滴入5號(hào)混勻，10(Vl/孔，保鮮膜包裹，室溫30min溫育；洗滌溫育結(jié)束甩干，每孔注入洗滌液(八成滿)靜置3分鐘后甩干，此操作重復(fù)4次(28-31度時(shí)此操作重復(fù)5次)，最后一次甩干后在吸水紙輕拍擊以促使水分吸干；顯色將6號(hào)8號(hào)混入7#配成顯色液，lOO^il/孔，10min顯色；終止顯色9號(hào)取終止液100pl/孔終止顯色，肉眼觀察結(jié)果。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被液、洗滌液、小牛血清、一抗血清、酶結(jié)合物工作液、顯色液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和酶標(biāo)板條；所說(shuō)的顯色液分為四甲基聯(lián)苯胺、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和雙氧水；所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照是含水生動(dòng)物螺原體的樣本，陰性對(duì)照是不含螺原體的樣本，一抗血清為水生動(dòng)物螺原體的多克隆抗體，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，其中所說(shuō)的包被液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸緩沖液；洗滌液為含0.05%吐溫-20、pH7.4的磷酸緩沖液；顯色液成份有檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，四甲基聯(lián)苯胺固體，30%過氧化氫液體；終止液為2mol/L硫酸溶液。3、根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，其中所說(shuō)的水生動(dòng)物螺原體的多克隆抗體通過以下方法制備得到采用經(jīng)甲醛滅活后的螺原體全菌作為免疫抗原，在健康新西蘭大耳兔腹部多點(diǎn)與耳靜脈相結(jié)合進(jìn)行4次人工免疫，甜兩次注射抗原加等體積佐劑，經(jīng)效價(jià)檢測(cè)后，通過心臟抽血，分離獲得高效價(jià)螺原體多克隆抗體。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒。所說(shuō)的試劑盒包括包被液、洗滌液、小牛血清、一抗血清、酶結(jié)合物工作液、顯色液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和酶標(biāo)板條；所說(shuō)的顯色液分為四甲基聯(lián)苯胺、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和雙氧水；所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照是含螺原體的樣本，陰性對(duì)照是不含螺原體的樣本，一抗血清為水生動(dòng)物螺原體的多克隆抗體，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體。主要采用間接ELISA方法，檢測(cè)水生動(dòng)物血液和肌肉組織樣品中的螺原體，該試劑盒使用方便，快速，經(jīng)濟(jì)，敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，便于推廣應(yīng)用，能有效的檢出血液和肌肉組織樣本中的螺原體。文檔編號(hào)G01N33/543GK101105494SQ20071002533公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2007年7月24日優(yōu)先權(quán)日2007年7月24日發(fā)明者霆吳,文王,王俊海,偉顧,樺黃申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)