專利名稱：無機磷診斷/測定試劑盒及無機磷濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種無機磷診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無 機磷濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
技術背景人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài) 平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關系，正常人血鈣升高則血磷降低，反 之亦然。血漿中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升 血漿鈣磷濃度的乘積為35——40。當二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽 形式沉積在骨組織，〉70時，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。當乘積<35時，則將 妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病寧軟 骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀旁腺激素及降鈣素 的調(diào)節(jié)。由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析 磷酸鹽陰離子(H2P04"， HP042-)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原 法，染料結(jié)合法，酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動 注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實驗 室測定無機磷的常規(guī)方法是比色法。磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加 入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚 化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有 光吸收，必須做標本空白，否則結(jié)果偏高。酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下 的中性范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定無機磷濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的無機磷診 斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動 生化分析儀上進行無機磷濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可 以得到切實的推廣應用。本發(fā)明無機磷濃度測定方法原理如下磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸 氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶這種方法應用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ; EC6.3丄2)酶 (偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法/速率比色法。谷氨酰胺合成酶酶解無機磷反應產(chǎn)生氨離子，再通過(偶)聯(lián)合丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nrn處 有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原 型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下 降的程度/速度，可以測算無機磷的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明無機磷診斷/測定試 劑盒較為理想緩沖液10Ommol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L谷氨酰胺10 mmol/L腺苷二磷酸20 mmol/L丙酮酸20 mmol/L谷氨酰胺合成酶10000U/L丙氨酸脫氫酶12000U/L本發(fā)明的無機磷診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、 谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮 酸。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙 氨酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶。還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙 氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是 干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機磷濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺 10mmol/L 腺苷二磷酸 20 mmol/L
丙酮酸 20 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 10000 U/L
丙氨酸脫氫酶 12000 U/L .
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸 光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大 約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出無機磷 的濃度大小。 實施例二
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
谷氨酰胺
腺苷二磷酸
丙酮酸
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶
100 mmol/L
500 mmol/L
10000 U/L 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起雄吸
光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷樣品
與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，
延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分
析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出無機磷
的濃度大小。
實施例三
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為三試劑，包括:試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶谷氨酰胺腺苷二磷酸丙酮酸試劑2(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑谷氨酰胺合成酶100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L100mmol/L500 mmol/L12000U/L100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測無機磷樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應 方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘 左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出無機磷 的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的無機磷濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨離子 +谷氨酸+腺苷三磷酸氨離子+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出無機磷的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種無機磷診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩(wěn)定劑1——4000 mmol/L還原型輔酶O.l—0.35 mmol/L谷氨酰胺l一50 mmol/L腺苷二磷酸1-50 mmol/L丙酮酸1-50 mmol/L谷氨酰胺合成酶1000———80000 U/L丙氨酸脫氫酶1000———80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、 谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、 谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔 酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫 酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、 谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 谷氨酰胺合成酶組成。還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、 谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于.還包括 穩(wěn)定劑l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的無機磷診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機磷濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出無機磷的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101324612SQ200710023369
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司