專利名稱：乙酸測定試劑盒及乙酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙酸濃度的 方法，屬于食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景隨著配制食醋標(biāo)準(zhǔn)的出臺，食品添加劑乙酸(醋酸)的質(zhì)量合格與否又直接關(guān)系著人民身體健康與否。在條文強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)配制食醋G B 10337—2000中明確規(guī)定，配制食醋所用的乙酸應(yīng)符合G B 1903—1996的 規(guī)定，即應(yīng)符合食品添加劑醋酸的要求。用工業(yè)醋酸假冒"食品添加劑醋 酸"，例如，使用某些副產(chǎn)品或回收的工業(yè)醋酸進(jìn)行脫色，濃度不夠時加入 鹽酸、磷酸等以增加酸度。這類醋酸對人體的危害很大，因為這類醋酸不 僅含有添加的有毒、有害無機(jī)物，還含些很難說清的有害有機(jī)物。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定乙酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的乙酸測定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進(jìn)行乙酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實 的推廣應(yīng)用。本發(fā)明乙酸濃度測定方法原理如下-乙酸+ 二氧化碳+亞鐵細(xì)胞色素bl 丙酮酸氧化酶丙酮酸+高鐵細(xì)胞色素M +水:氧化碳+丙酮酸+還原型輔f蘋果酸脫氫酶(脫羧化) l-蘋果酸+輔酶這種方法應(yīng)用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ; EC 1.2.2.2)酶(偶)聯(lián)蘋 果酸脫氫酶(malate dehydrogenase ; EC 1.1.1.38; EC 1丄1.39;EC 1.1.1.40; EC 1丄1.83)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/速率比色法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸 反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過(偶)聯(lián)合蘋果酸脫氫酶的脫羧化作用，最終將 還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸 收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度， 通過測量340nrn處吸光度下降的程度/速度，可以測算乙酸的濃度大小。 實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乙酸測定試劑盒較為理想:緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶二氧化碳亞鐵細(xì)胞色素bl丙酮酸氧化酶 蘋果酸脫氫酶100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L 8000 U/L 10000U/L本發(fā)明的乙酸測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl、丙 酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1 '緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl。 試劑2 '緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫 氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使 用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素b1。. 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶。 還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫 氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定乙酸濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一本實施例的乙酸測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑 還原型輔酶 二氧化碳 亞鐵細(xì)胞色素M100mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L20 mmol/L5 mmol/L丙酮酸氧化酶 8000 U/L蘋果酸脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸 光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙酸樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約 0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的濃度大小( 實施例二本實施例的乙酸測定試劑為雙試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶二氧化碳亞鐵細(xì)胞色素bl100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶 蘋果酸脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的濃度大小。實施例三本實施例的乙酸測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶二氧化碳亞鐵細(xì)胞色素M試劑2(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑蘋果酸脫氫酶試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑丙酮酸氧化酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體」100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L 5 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L100mmol/L500 mmol/L8000 U/L:試劑，可以直接使用測定乙酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間 IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測乙酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的 濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙酸濃度測定方法，其方法原理如下乙酸+二氧化碳+亞鐵細(xì)胞色素b1丙酮酸氧化酶丙酮酸+高鐵細(xì)胞色素b1+水二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化) L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出乙酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種乙酸測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 二氧化碳 亞鐵細(xì)胞色素bl丙酮酸氧化酶 蘋果酸脫氫酶20--500 mmol/L-4000 mmol/L0.1-0.35mmol/L1-50 mmol/L1-50 mmol/L1000——80000 U/L1000--80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。二氧化碳以碳酸氫鹽取代，例如碳 酸氫鈉或碳酸氫鉀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素M、丙酮 酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl組成；試劑2,由緩沖液、 穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、二氧化碳、 亞鐵細(xì)胞色素bl、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl、丙酮 酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素bl組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧 化酶組成。還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素M、丙酮酸氧化酶、 蘋果酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、二氧化碳、亞鐵細(xì)胞色素b1、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出乙酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101324510SQ20071002336
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司