專利名稱：：用于微通道分離的基質(zhì)和動(dòng)態(tài)聚合物體系和組合物的制作方法用于微通道分離的基質(zhì)和動(dòng)態(tài)聚合物體系和組合物本發(fā)明要求2005年11月1日提交的申請?zhí)?0/732,398的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容納入本文作參考。根據(jù)國立衛(wèi)生研究所和國立科學(xué)基金會(huì)授予西北大學(xué)的基金號(hào)1R01HG019770-01和DMR-0076097，美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：由于成本、時(shí)間和試劑消耗的降低，可能將測序與其它基因分析步驟整合到整體微量分析體系中，所以用于DNA測序的微流體芯片電泳代表了高通量測序計(jì)劃的未來發(fā)展方向。為此，開發(fā)用于DNA測序的優(yōu)良的聚合物分離基質(zhì)和壁涂層至關(guān)重要。親水性分離基質(zhì)如直鏈聚丙烯酰胺("LPA")連同共價(jià)親水性涂層一起用于微通道電泳，可獲得大于500個(gè)堿基的閱讀長度；然而，分離均需要15-18分鐘以上。聚(iV,W-二甲基丙烯酰胺)("pDMA")是利用雜交分離機(jī)制的疏水性分離基質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)的閱讀長度與現(xiàn)有技術(shù)的聚合物相似、但分離速度較快。雖然共價(jià)涂層幾乎用于所有公開的微通道DNA測序結(jié)果，但微通道模式中特別優(yōu)選花費(fèi)低得多也更容易實(shí)施的動(dòng)態(tài)涂層。然而，用于DNA測序的所有動(dòng)態(tài)涂層有些疏水性，由于DNA片段和壁涂層的相互作用導(dǎo)致分離效率降低。目前的工作己證明，聚(7V-羥乙基丙烯酰胺)fpHEA")是適用于蛋白質(zhì)分離和DNA測序的毛細(xì)管的親水性動(dòng)態(tài)涂層，但僅當(dāng)pHEA也是分離基質(zhì)時(shí)。雖然關(guān)于芯片DNA測序的大多數(shù)公開數(shù)據(jù)報(bào)道的閱讀長度大于400個(gè)堿基，但芯片上的測序時(shí)間一般為18-30分鐘。此外，毛細(xì)管電泳需要約60-90分鐘產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。時(shí)間和閱讀長度是有關(guān)電泳分離的考慮因素。發(fā)明概述根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于微通道分離的一種或多種聚合物組合物、體系和/或方法，從而克服現(xiàn)有技術(shù)的各種缺陷和缺點(diǎn)，包括上述缺陷和缺點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面可滿足某些目的，而一個(gè)或多個(gè)方面可滿足某些其它目的。各目的可能并不等同地(所有方面)作用于本發(fā)明的每個(gè)方面。同樣，可根據(jù)本發(fā)明任何一方面觀察以下目的。本發(fā)明的一個(gè)目的可以是提供動(dòng)態(tài)壁涂層聚合物，以便更好地利用與疏水性分離基質(zhì)有關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是單獨(dú)或與上述目的聯(lián)合提供親水性壁涂層聚合物，以降低電滲流和/或分析物-壁相互作用的發(fā)生率或影響。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供基質(zhì)/壁涂布體系，以及相關(guān)使用方法，以便與現(xiàn)有技術(shù)相比在較短時(shí)間內(nèi)增加序列閱讀長度。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種或多種基質(zhì)/壁涂布體系，它們能提供更長、更快的序列閱讀、流動(dòng)微通道電泳。由發(fā)明概述和以下某些實(shí)施方式的描述可以看出本發(fā)明的其它目的、特征、益處和優(yōu)點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難想到各種電泳方法和技術(shù)。由上述內(nèi)容以及所附實(shí)施例、—數(shù)據(jù)、附圖和由其而來的所有合理推論，可以看出這類目的、特征、益處和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明涉及可以通過微芯片電泳在施加電場下以較短的分離通道進(jìn)行超快的DNA測序或基因分型的新型體系。這類體系可包括聚合物分離組分和聚合物涂布組分。在某些實(shí)施方式中，含有高分子量聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(pDMA)或其共聚物的DNA分離基質(zhì)可與親水性水溶性聚合物組分聚(W-羥乙基丙烯酰胺)(pHEA)聯(lián)用，以便通過微通道電泳非?？斓胤蛛xDNA測序片段。非限制性地，pHEA可被認(rèn)為是動(dòng)態(tài)(即物理吸附性)聚合物壁涂層組分?？蓪⑵漕A(yù)涂布在微通道壁上和/或用作含有聚合物分離基質(zhì)組分的組合物的一部分。在某些其它實(shí)施方式中，這類體系或本發(fā)明組合物可包含這類分離和涂布組分，這類分離和涂層組分的分子量和/或含量足以提供新型DNA遷移模式，即將DNA蠕動(dòng)(reptation)與瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)(TEC)結(jié)合起來的新型DNA分離機(jī)制。更通常，本發(fā)明可部分涉及用于微通道電泳的DNA測序或基因分型組合物。這類組合物可包含含有式[-CH2C(R)C(0)NR'R"-L的聚丙烯酰胺的疏水性分離基質(zhì)組分，式中R可選自H或甲基，R'和R"可獨(dú)立地選自Q-約C8直鏈烷基部分、d-約Q烷氧基取代的直鏈烷基部分、Cr約Cs支鏈烷基部分以及Q-約C8垸氧基取代的支鏈垸基部分、.它們的共聚物，或者這類聚合物或/或共聚物的組合；還包含親水性高于上述基質(zhì)組分的含有聚(N-羥乙基丙烯酰胺)的疏水性壁涂層組分。在某些實(shí)施方式中，無論是均聚物、無規(guī)共聚物或嵌段共聚物，或是它們的任何組合，R可以是H，R'和R"可包括取代(如甲氧基或乙氧基、丙氧基等)或未取代的CV約C4烷基部分。在某些其它實(shí)施方式中，R'和R"可以是甲基，這類組分可包括pDMA或pDMA共聚物。在上式中，n是大于1的整數(shù)，反映這類聚合物的平均摩爾質(zhì)量。在某些實(shí)施方式中，如本領(lǐng)域所知，這類聚合物可具有中等疏水性，至少在水或水性介質(zhì)中部分可溶。因此，這類組分可包含pDMA、聚(7V-甲氧基乙基丙烯酰胺)或聚(W-乙氧基乙基丙烯酰胺)、它們的組合，以及它們的共聚物(其單體對應(yīng)于本文所述或推知的任何一種或多種聚合物組分)(例如但不限于，AUV-二甲基丙烯酰胺和7V,W-二己基丙烯酰胺的共聚物)。無論如何，R'和R"的組合僅受賦予這類聚合物組分的疏水性特征以及分子內(nèi)或分子間物理相互作用和/或與其它這類部分或聚合物組分相連的能力的限制，直至至少部分地足以提供這類物質(zhì)的功能作用(下文更詳細(xì)地描述)?？梢哉J(rèn)為這類親水性壁涂層組分的親水性特征足以至少部分減少電滲流和/或減少有害的分析物-壁相互作用。pHEA的分子量范圍可以是約600，000-約4百萬克/摩爾(MDa)或約5百萬克/摩爾(MDa)或更高。無論如何，根據(jù)分子量和/或終端應(yīng)用，pHEA在流體介質(zhì)中的含量小于該介質(zhì)的0.5%(w/v)。在某些其它實(shí)施方式中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，pHEA在這類介質(zhì)(如水性介質(zhì))中的含量約為0.1-0.4%(w/v)。無論如何，在某些實(shí)施方式中，pHEA涂層組分可以與一種或多種上述疏水性聚丙烯酰胺分離基質(zhì)組分組合使用，或加入一種或多種上述疏水性聚丙烯酰胺分離基質(zhì)組分中。無論如何，所得基質(zhì)組分在含有本文所述種類的流體介質(zhì)(如水或水性8介質(zhì)，例如但不限于緩沖溶液)的組合物中的濃度(W/V)高達(dá)約5%或更高，這類濃度可取決于平均摩爾質(zhì)量。在某些實(shí)施方式中，高達(dá)約3。/。(w/v)的基質(zhì)組分是pDMA，其重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa。在其它這類實(shí)施方式中，基質(zhì)組分還可包含約1。/。-2。/。(w/v)的重均摩爾質(zhì)量較低，例如但不限于約200-300kDa的pDMA。可以獲得一定濃度范圍的各種其它基質(zhì)組分，僅由單體組分和相應(yīng)部分的選擇來確定和限制。除非另有說明，本文中所有用數(shù)字表示的屬性如摩爾質(zhì)量、百分?jǐn)?shù)等應(yīng)理解為在所有情況下均被術(shù)語"約"修飾。因此，除非另有說明，本文的數(shù)值參數(shù)是近似值，可能取決于所需的聚合物或體系特性或者準(zhǔn)備用相關(guān)方法實(shí)現(xiàn)的結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明可以改變這些百分?jǐn)?shù)和摩爾質(zhì)量。提到本發(fā)明的組合物、體系、方法和/或設(shè)備，本文所述或推出的聚合物可能適當(dāng)?shù)匕魏紊鲜鰡误w、由其組成或基本由其組成，不論任何這類單體在相應(yīng)聚合物中所占的百分?jǐn)?shù)。這類聚合物或共聚物或其單體組分組成不同、特征獨(dú)特，本發(fā)明中可單獨(dú)使用或聯(lián)用。因此，也應(yīng)理解，可以在不存在任何一種聚合物、單體組分和/或步驟(無論是否在本文中公開、提及或推出)的情況下實(shí)施或使用本文所述的本發(fā)明組合物、體系、方法和/或設(shè)備，本文中可能并未特別公開、提及或推出它們不存在。本發(fā)明也可能部分涉及用于RNA和DNA分離的微通道電泳體系。這類體系可包含含pDMA的疏水性分離基質(zhì)組分和含pHEA的親水性壁涂層組分；和選自微尺寸毛細(xì)管(例如但不限于，將內(nèi)徑限定為約10微米-約150微米)或微通道尺寸相似的微流體電泳芯片的微通道基材。這類體系可包含上述種類的pDMA基質(zhì)組分。在某些非限制性實(shí)施方式中，基質(zhì)組分可包含約3y。(w/v)重均摩爾質(zhì)量范圍約為3-5MDa的pDMA;和約1。/。-2。/。(w/v)重均摩爾質(zhì)量較低(如約200-300kDa)的pDMA，。本發(fā)明也可部分涉及使用聚合物壁涂層和分離基質(zhì)體系進(jìn)行DNA或RNA電泳分離的方法。這類方法可包括提供含有pDMA組分和pHEA組分的體系，pDMA組分約占該體系的3%(w/v)-5%(w/v);將該體系引入選自微通道電泳毛細(xì)管或微流體測序芯片的基材；和使DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物或RNA組分的混合物與該體系相接觸，施加一定電壓作用一段時(shí)間，至少部分地足以進(jìn)行電泳分離。這類方法可包括含有上述種類的pDMA組分的體系。在某些實(shí)施方式中，可使所述pHEA組分與基材相接觸，然后引入分離基質(zhì)體系。在這類實(shí)施方式中，pHEA組分可用作水性溶液，接觸基材一段時(shí)間，以便提供本文所述種類的壁涂層組分。無論如何，可采用這類方法分離長度長達(dá)約800個(gè)堿基的DNA序列(如單鏈DNA)，這類分離取決于時(shí)間和微通道長度。下文提供了這類分離/測序方法的非限制性例子。與上述內(nèi)容相關(guān)的是，本發(fā)明也可涉及微通道電泳設(shè)備。這類設(shè)備可包括基材和其上的聚合物體系，這類基材選自微米尺寸的毛細(xì)管和微流體電泳芯片。如果不受限于微通道基片或設(shè)備構(gòu)造，這類體系可包含含有pDMA組分和上述種類的pHEA組分的聚合物體系，其中pDMA組分約占該體系的3%-5%(w/v)。已證明這類聚合物體系的分離和/或壁涂布性能，也可與本領(lǐng)域已知的毛細(xì)管或微通道基質(zhì)或壁涂層材料一起或聯(lián)合使用。本發(fā)明也可部分涉及使用疏水性聚合物基質(zhì)提高DNA分離速度的方法。這類方法可包括提供選自微尺寸的毛細(xì)管或微流體電泳芯片微通道基材；將親水性pHEA壁涂層組分偶聯(lián)或施加于這類基材；將疏水性分離基質(zhì)引入該基材，這類基質(zhì)組分選自本文所述的聚丙烯酰胺、其共聚物和這類聚丙烯酰胺和/或這類共聚物的組合；和使DNA序列組分與這類基質(zhì)組分的混合物相接觸，施加一定電壓作用一段時(shí)間，至少部分地足以對這類混合物進(jìn)行電泳分離，其中基質(zhì)組分的分子量和濃度至少部分足以使混合物內(nèi)DNA組分發(fā)生瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)或蠕動(dòng)。在某些實(shí)施方式中，分離可以是瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)和蠕動(dòng)的組合。在某些這類實(shí)施方式中，在約50%的遷移時(shí)間中，DNA組分可通過瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)遷移，在約50%的遷移時(shí)間中，通過蠕動(dòng)遷移。無論如何，可利用落射熒光視頻顯微鏡檢測熒光染色的DNA分子，從而監(jiān)測這類遷移的動(dòng)力學(xué)概況。在某些實(shí)施方式中，與采用現(xiàn)有技術(shù)的LPA基質(zhì)進(jìn)行分離相比，這類方法提供的分離速度快3倍以上。非限制性地，在某些實(shí)施方式中，這類方法的基質(zhì)組分可選自pDMA和/或其共聚物。關(guān)于前者，這類基質(zhì)組分可包含約3M(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的pDMA和約1。/。(w/v)-約2。/。(w/v)重均摩爾質(zhì)量較低如約200-300kDa的pDMA。無論如何，在這類實(shí)施方式中，遷移的特征可以是通過基質(zhì)的DNA電泳遷移率與DNA分子大小的雙對數(shù)曲線圖的直線區(qū)域，其中分子大小可表示為堿基和/或堿基對。例如但不限于，DNA分子大小范圍可以是約200個(gè)堿基-約800個(gè)堿基，這種雙對數(shù)曲線圖線性區(qū)域的斜率約為曙4.40至-0.60。附圖簡要說明圖1.通過GPC-MALLS鑒定pDMA。幾個(gè)非限制性實(shí)施例中使用的pDMA的摩爾質(zhì)量分布。該分布是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。圖2.在適合測序的濃度下pDMA基質(zhì)的粘度顯著提高。然而，這一粘度仍然比現(xiàn)有技術(shù)的LPA基質(zhì)低得多，更易加載到微通道中。圖3.與現(xiàn)有技術(shù)LPA基質(zhì)相比，pDMA基質(zhì)的ssDNA分離。3%和4%pDMA中的所有37個(gè)峰相互分離。觀察到5%pDMA和LPA基質(zhì)中分辨率喪失。DNA片段遷移時(shí)間取決于濃度。圖4A-B.A)圖2中分離得到的峰的選擇性O(shè)ii卞iV^g)。這兩種基質(zhì)顯示了相似的峰分離。B)通過250個(gè)堿基，LongReadTM基質(zhì)的峰比pDMA基質(zhì)寬得多(這種條帶加寬是此基質(zhì)測序性能降低的主要原因)。圖5.pDMA基質(zhì)中ssDNA梯的遷移率數(shù)據(jù)。條件與圖l相同。用虛線標(biāo)記出該曲線為線性時(shí)的DNA大小。對3%、4%和5%基質(zhì)而言，線性區(qū)域的斜率分別是-0.54、-0.59和-0.50。圖6.由DNA成像視頻捕獲的數(shù)字圖像。以所示時(shí)間間隔開的一系列畫面顯示了通過本發(fā)明代表性網(wǎng)絡(luò)移動(dòng)的兩種DNA分子。上面一種分子在給定時(shí)間內(nèi)蠕動(dòng)通過整個(gè)觀察框。下面一種分子先是蠕動(dòng)，然后以類似瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)的基質(zhì)鉤住和牽拉聚合物網(wǎng)絡(luò)通過觀察框。某些實(shí)施方式的詳述?？赡苡绊慏NA電泳分離的纏結(jié)聚合物的溶液特性。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的某些實(shí)施方式，考慮了以下內(nèi)容開發(fā)用于測序的最優(yōu)聚合物基質(zhì)是微通道系統(tǒng)商業(yè)化的最大限制之一。只可能在聚合物鏈重疊并形成纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)的半稀釋聚合物溶液中進(jìn)行DNA測序。重疊濃度(overlapconcentration)c^定義為總體溶液濃度，它與螺管(coil)內(nèi)的聚合物濃度精確匹配。方程1根據(jù)這一定義提供了(^的估計(jì)值:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(1)當(dāng)Mw是重均摩爾質(zhì)量時(shí)，NA是阿伏加德羅常數(shù)，Rg是聚合物回轉(zhuǎn)半徑?？捎煞匠?l)，通過某些技術(shù)如光散射技術(shù)測定Mw和Rg來計(jì)算重疊濃度?；蛘?，可通過測定一系列聚合物濃度的零剪切粘度并以雙對數(shù)為軸用粘度與聚合物濃度作圖來確定重疊濃度。該曲線變?yōu)榉蔷€性的濃度是重疊濃度，該網(wǎng)絡(luò)纏結(jié)的程度可表示為c/d之比。隨著DNA通過纏結(jié)聚合物網(wǎng)絡(luò)移動(dòng)，限定該網(wǎng)絡(luò)的重要參數(shù)是聚合物篩選長度g。在聚合物溶液中，篩選長度取決于聚合物Rg和濃度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(2)在凝膠電泳中，平均孔隙尺寸對確定分離機(jī)制和嘗試將關(guān)于凝膠分離機(jī)制的理論聯(lián)系到纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)時(shí)至關(guān)重要。己提出使用篩選長度作為這些溶液的"孔隙尺寸"，可通過將"空泡(blob)"大小^定義為纏結(jié)點(diǎn)之間的平均鏈長度而進(jìn)行略微改變。這種調(diào)節(jié)僅將新的前因子引入該定義，定義為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>'(3)因此，通常可根據(jù)此空泡大小確定該聚合物網(wǎng)絡(luò)，所述空泡大小取決于聚合物濃度和螺管尺寸。'纏結(jié)聚合物溶液中的DNA分離機(jī)制。上述聚合物網(wǎng)絡(luò)參數(shù)可用于描述DNA通過纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)遷移的不同機(jī)制。分離機(jī)制取決于DNA分子的Rg相對于網(wǎng)絡(luò)中空泡大小。小于網(wǎng)絡(luò)孔隙尺寸的DNA尺寸可以遷移通過該溶液，其機(jī)制類似于Ogst。n所述通過致密纖維陣列移動(dòng)的球的機(jī)制。這通常稱為Ogston篩分，相對于自由溶液遷移率的DNA遷移率在數(shù)學(xué)上可表示為上=,其中Kr是阻滯系數(shù)，它與DNA螺管半徑的平方成正比，c是凝膠或聚合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>)(4)物濃度。通過將分析物遷移率的自然對數(shù)對凝膠的聚合物濃度作圖的弗格森(Ferguson)曲線分析此機(jī)制。然后由曲線斜率得到阻滯系數(shù)的值。當(dāng)DNA分子的螺管大小接近和超過該網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸時(shí)，預(yù)計(jì)DNA遷移率的Ogston模型會(huì)失敗。對大于孔隙尺寸的DNA的觀察產(chǎn)生DNA遷移率的有偏蠕動(dòng)模型。通過考慮DNA分子長度發(fā)生的波動(dòng)重新評(píng)價(jià)此模型，稱為有波動(dòng)的有偏蠕動(dòng)。這些模型預(yù)計(jì)，DNA遷移率迂回通過該網(wǎng)絡(luò)的方式類似于溶液的纏結(jié)聚合物熔體蠕動(dòng)理論。該機(jī)制中的重要參數(shù)是有下式給出的降低的電場(5)其中^是溶劑粘度，E是電場強(qiáng)度，kb是波耳茲曼常數(shù)，T是絕對溫度。這些模型通常推倒出(例如)低電場，或￡<<1。得到的BRP模型的遷移率形式為〃+5+2as(6)其中N是以堿基數(shù)表示的DNA大小，a是調(diào)節(jié)因子。在此模型中，小于首項(xiàng)的DNA尺寸占主導(dǎo)地位且DNA遷移率是大小依賴性的情況下，存在臨界DNA尺寸。z、i、M)3AT(7)這種DNA蠕動(dòng)方案被稱為非定向蠕動(dòng)，大多數(shù)DNA分離(包括測序)都是以這種方案進(jìn)行的。對臨界尺寸以上的DNA，第二項(xiàng)占主導(dǎo)地位，基于尺寸的分離消失。這種蠕動(dòng)方案稱為定向蠕動(dòng)。DNA的臨界尺寸取決于孔隙尺寸和電場強(qiáng)度。(8)預(yù)計(jì)臨界尺寸與網(wǎng)格大小無關(guān)，但現(xiàn)有技術(shù)顯示，非定向至定向蠕動(dòng)的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于網(wǎng)格大小。這種結(jié)果表明，較小的孔隙尺寸傾向于定向蠕動(dòng)較小的DNA尺寸。因此，電場強(qiáng)度以及纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)的空泡大小是確定電泳分離DNA的上限尺寸的重要參數(shù)。雖然Ogston篩分和有偏蠕動(dòng)的機(jī)制可應(yīng)用于纏結(jié)溶液，但Barron等發(fā)現(xiàn)了在低于重疊濃度的聚合物溶液中普遍存在的不同分離機(jī)制。在羥乙基纖維素(HEC)超稀溶液中，可以分離dsDNA大分子(〉1kbp)，纏結(jié)聚合物溶液的理論不足以解釋該結(jié)果。因此，為該分離提出稱為瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)的新機(jī)制。在這種機(jī)制中，DNA在遷移過程中碰到聚合物鏈，二者的偶聯(lián)增加了對DNA分子的牽拉阻力。碰到聚合物鏈的概率是DNA大小依賴性的，因此可以進(jìn)行分離。聚合物物理特性對測序性能有影響。通常，較長的DNA測序閱讀長度需要親水性高分子量聚合物。同時(shí)，較低粘度和涂布玻璃表面的能力為操作該體系提供了技術(shù)上和成本上的優(yōu)勢。合成條件靶向摩爾質(zhì)量超過lx106g/mo1的pDMA和pHEA。這通常是進(jìn)行較長DNA測序閱讀，同時(shí)也滿足穩(wěn)定動(dòng)態(tài)涂布需要的閾值。圖1顯示了通過GPC-MALLS測定，本研究中使用的pDMA的摩爾質(zhì)量分布。表1小結(jié)了室溫下測定的pDMA和pHEA聚合物特性。pDMA溶液的零剪切粘度見圖2。許多LPA基質(zhì)的粘度在IOO，OOOcP"數(shù)量級(jí)，將測序所用濃度范圍的pDMA基質(zhì)加載到微通道中容易得多。表l-合成的用于基質(zhì)和涂層的pDMA和pHEA的聚合物特性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ssDNA分離雖然在毛細(xì)管電泳設(shè)備中，pDMA被認(rèn)為是有效的測序基質(zhì)，但并未檢測這種聚合物在微通道體系中測序的性能。用濃度為3-5%的pDMA在微通道電泳體系中分離ssDNA片段(以市售LPA基質(zhì)為對照)。樣品是含有37種DNA片段大小的25堿基梯。這些分離的電泳圖見圖3。雖然3%和4%pDMA基質(zhì)能夠分離所有37個(gè)峰，但5%pDMA和LPA基質(zhì)不能完全分辨最大的DNA片段。因此，除了粘度較低以外，pDMA溶液分離最長達(dá)900個(gè)堿基的25堿基梯的性能優(yōu)于4%LPA基質(zhì)。此體系的有效分離距離為7.5cm，比市售CAE設(shè)備低得多。由于微通道體系采用能夠進(jìn)行更有效分離的交叉注射設(shè)計(jì)，所以大大降低了需要的通道長度，從而使分離更快。在pDMA基質(zhì)中，DNA遷移時(shí)間明顯依賴于聚合物濃度，這些pDMA基質(zhì)中的遷移時(shí)間通常短于LPA基質(zhì)。由于大多數(shù)微通道測序研究也采用了較長通道以及不同的電場強(qiáng)度和溫度以便優(yōu)化其單個(gè)體系，所以難以直接比較遷移時(shí)間。然而，在相同電泳條件下，許多微通道研究所選基質(zhì)4%LPA的遷移時(shí)間比本文所用的pDMA基質(zhì)長。DNA測序結(jié)果除與LPA相比分離速度提高外，pDMA可用作自身涂布基質(zhì)因而不再需要共價(jià)涂布通道壁，這種共價(jià)涂布過程昂貴且耗時(shí)。在高通量環(huán)境下，動(dòng)態(tài)吸附的聚合物壁涂層比共價(jià)涂布更具吸引力，因?yàn)槠涑杀窘档颓覍?shí)施更簡單。然而，pDMA涂層有些疏水性，可能與分析物相互作用。pHEA的親水特性使其成為出色的壁涂層，因?yàn)樗山档碗姖B流和分析物-壁相互作用。各種濃度的pDMA和市售Pop-5TM和BeckmanLongReadTM基質(zhì)的測序結(jié)果，以及利用不同動(dòng)態(tài)涂層的結(jié)果見表2。聚合物涂層的化學(xué)特性會(huì)顯著影響閱讀長度。在4。/。pDMA基質(zhì)中，釆用pDMA作為動(dòng)態(tài)涂層時(shí)閱讀長度可以是420個(gè)堿基。pHEA用作動(dòng)態(tài)涂層時(shí)，可使閱讀長度延長130個(gè)堿基。這種閱讀長度的增加歸因于可能使分離期間條帶加寬的壁-分析物相互作用的降低。表2-玻璃微芯片的DNA測序結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*所有實(shí)驗(yàn)均在50"C和235V/cm(~3nA電流)下進(jìn)行,準(zhǔn)確度98.5%b達(dá)到平均閱讀長度的時(shí)間c無法測定另一令人感興趣的結(jié)果是，不同于在ABICAE設(shè)備中的商業(yè)應(yīng)用，Pop-5TM聚合物不可用作自身涂布基質(zhì)。這可解釋為用于制備本研究微流體芯片的玻璃與毛細(xì)管所用的熔融石英玻璃的化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)差異。存在鹽和其它雜質(zhì)能提高玻璃芯片的結(jié)合特性，但這會(huì)改變P0P-5TM聚合物的涂布能力。然而，如果P叩-5TM基質(zhì)加到芯片上之前應(yīng)用pHEA，能將閱讀長度由非常低的水平(<50個(gè)堿基)增加到約380個(gè)堿基。比較pDMA基質(zhì)與Pop基質(zhì)的結(jié)果表明，開發(fā)用于毛細(xì)管體系的聚合物基質(zhì)不一定是微通道體系的最佳基質(zhì)。通過pDMA基質(zhì)與貝克曼(Beckman)LongReadTM基質(zhì)(毛細(xì)管體系優(yōu)化的LPA基質(zhì))中獲得的更好的測序閱讀長度進(jìn)一步確認(rèn)了這一結(jié)果。pDMA測序基質(zhì)優(yōu)化配方與pHEA動(dòng)態(tài)涂布的組合在較短時(shí)間產(chǎn)生的閱讀長度大于市售基質(zhì)。4%pDMA基質(zhì)能以98.5%準(zhǔn)確度平均遞送512個(gè)堿基，包括550個(gè)堿基的長閱讀。通過比較不同pDMA濃度揭示出，在ssDNA分離中3%pDMA基質(zhì)能使500個(gè)堿基片段的遷移時(shí)間提高25%;然而，平均只準(zhǔn)確調(diào)用349個(gè)堿基進(jìn)行測序。因此，對較長的閱讀長度而言，需要這種特定pDMA摩爾質(zhì)量的濃度超過3。/。。然而，4%配方代表了最優(yōu)濃度，因?yàn)殚喿x長度在濃度為5%時(shí)降低。在圖3所示的分離中，3n/。pDMA基質(zhì)能以高分辨率快速分離DNA大片段，但無法獲得與較高pDMA濃度相當(dāng)?shù)臏y序閱讀長度。由于較高聚合物濃度是分離短DNA片段的重要參數(shù)，較低濃度有利于分離較大的片段，通過混合平均摩爾質(zhì)量較高和平均摩爾質(zhì)量較低的聚合物來配制聚合物基質(zhì)。表3顯示了兩種pDMA聚合物"混合物"的結(jié)果(準(zhǔn)確度98.5%)。平均摩爾質(zhì)量較高的pDMA(3.4MDa)的應(yīng)用濃度為3%(w/v)，而平均摩爾質(zhì)量較低的pDMA(240kDa)的應(yīng)用濃度為1%和2%(w/v)，以使這兩種基質(zhì)的總pDMA濃度為4%和5%(w/v)。雖然具有單一平均摩爾質(zhì)量的基質(zhì)運(yùn)行得也非常好，但混合摩爾質(zhì)量的基質(zhì)運(yùn)行得更好。4%混合基質(zhì)的平均閱讀長度最長為560個(gè)堿基(6分鐘閱讀長度為587個(gè)堿基)，而5%混合基質(zhì)的最長單個(gè)閱讀長度為601個(gè)堿基，僅需要6.5分鐘即可實(shí)現(xiàn)此閱讀長度。(最長測序?qū)嶒?yàn)的四色測序電泳圖未顯示。)'可以進(jìn)一步分析pDMA基質(zhì)和LongReadTMLPA基質(zhì)的分離，以確定這種市售基質(zhì)的性能較差的原因。從ssDNA分離中，圖4A-B中用這兩種分離的選擇性和峰寬對各種DNA片段大小作圖。這種選擇性是基質(zhì)分離作用的量度，定義為用平均遷移率標(biāo)準(zhǔn)化的相鄰峰之間的遷移率差異。峰寬衡量了該體系中所有條帶加寬來源的組合作用。在圖4A中，4n/。pDMA聚合物和LongReadTM基質(zhì)的選擇性明顯相似，這無法解釋測序性能的差異。然而，圖4B顯示了在大于約250個(gè)堿基的DNA尺寸下，LPA基質(zhì)的峰寬顯著增加。相信這種條帶加寬作用是這一體系性能較差的主要原因，pDMA基質(zhì)中高得多的峰效率(較小的寬度)使得這些聚合物的測序閱讀長度增加。而且，LongReadTMLPA體系的較寬峰可能需要較長的分離通道來實(shí)現(xiàn)相似的閱讀長度(也需要較長時(shí)間)。表3-采用pHEA涂層的混合摩爾質(zhì)量pDMA基質(zhì)的測序比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a運(yùn)行條件與表2相同b高摩爾質(zhì)量pDMA是3.4MDa;低摩爾質(zhì)量pDMA是240kDa'準(zhǔn)確度為98.5%時(shí)的閱讀長度研究pDMA基質(zhì)中的DNA分離機(jī)制相信通過纏結(jié)聚合物溶液的DNA分離通過上述兩種機(jī)制進(jìn)行。雖然DNA小片段傾向于通過該聚合物網(wǎng)絡(luò)篩分(Ogston篩分)，但DNA蠕動(dòng)是較大片段的分離機(jī)制。蠕動(dòng)提供了較高分辨率的分離，應(yīng)該是高性能測序所需的機(jī)制。這可以解釋為何需要較高濃度來測序較小的DNA，因?yàn)檩^高濃度下較小的網(wǎng)格大小能將蠕動(dòng)機(jī)制起始點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小的DNA。相似的推理可解釋為何較長的閱讀需要較低濃度。隨著機(jī)制轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄏ蛉鋭?dòng)，基質(zhì)喪失了所有分辨力。由于這種轉(zhuǎn)變?nèi)Q于網(wǎng)格大小(參見Eq8)，所以在較高聚合物濃度下DNA傾向于定向在較小尺寸上。在對數(shù)比例尺上將DNA遷移率對片段大小作圖，可以在數(shù)據(jù)的線性部分觀察到非定向蠕動(dòng)分離，如圖5所示的圖1ssDNA梯的分離。圖5所示數(shù)據(jù)與前述毛細(xì)管體系中pDMA基質(zhì)的數(shù)據(jù)相似。具體說，Ogston型篩分到非定向蠕動(dòng)，以及非定向蠕動(dòng)到定向蠕動(dòng)之間存在平滑轉(zhuǎn)變。在長DNA測序閱讀中，圖5曲線的線性區(qū)域延伸至較大DNA尺寸可能很重要。相對于5。/。pDMA，4y。pDMA基質(zhì)中較大DNA尺寸的遷移率保持在線性區(qū)域內(nèi)，因此向定向蠕動(dòng)的轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)移至較小的DNA尺寸。因此，4%pDMA給出的閱讀長度應(yīng)該大于5%基質(zhì)，本研究的結(jié)果證明，即使對低于此限的DNA大小而言，4%基質(zhì)也能提供較佳的測序結(jié)果。然而應(yīng)注意，遷移率曲線不能說明可降低測序所需單堿基分辨的條帶加寬作用，因此測序閱讀長度小于僅由ssDNA梯的遷移率曲線預(yù)計(jì)的值。'纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)破裂與兩個(gè)較高濃度相比，3n/。pDMA基質(zhì)的遷移率曲線的線性區(qū)域延伸更長，而該基質(zhì)的閱讀長度通常短得多。一個(gè)原因是需要較高的聚合物濃度以更好地分離小尺寸DNA(如上所述)。影響較大DNA尺寸的分離性能的另一因素是該聚合物網(wǎng)絡(luò)的纏結(jié)強(qiáng)度。通常，在給定分子量的情況下，纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)度隨著聚合物濃度的增加而增加并能更好地纏結(jié)鏈，因此在網(wǎng)格大小需要大到足以測序較大DNA時(shí)，摩爾質(zhì)量較高的聚合物更有效。纏結(jié)強(qiáng)度也受單條鏈的螺管尺寸的影響。pDMA鏈的螺管尺寸通常小于更親水的聚合物如LPA。需要強(qiáng)烈纏結(jié)的網(wǎng)絡(luò)來分離蠕動(dòng)通過的DNA，因此遷移DNA造成該聚合物網(wǎng)絡(luò)的破壞傾向于降低分離效果和閱讀長度。在弱纏結(jié)的網(wǎng)絡(luò)中，破壞的頻率更高，尤其是通過較大DNA時(shí)。然而，隨著網(wǎng)絡(luò)被破壞DNA分子與聚合物鏈的纏結(jié)現(xiàn)象仍然趨向尺寸依賴性。此機(jī)制涉及瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)(TEC)，這種偶聯(lián)是本領(lǐng)域熟知和已確立的現(xiàn)象，由Barron等發(fā)現(xiàn)，可用于分離稀聚合物溶液中的dsDNA。(參見例如，Barron，A.E.，Soane，D.S.和Blanch，H.W.(1993)丄C&om.J652:3-16;Barron，A.E.，Blanch,H.W.和Soane，D.S.(1994)^/ec^o/^or^h15:597-615;禾口Barron，A.E.，Sunada，W.M.和Blanch,H.W.(l996)5io&c/z.5foe"g.52:259-270，各自全文納入本文作參考)。雖然未定向蠕動(dòng)是這些基質(zhì)分離DNA的主要機(jī)制，但網(wǎng)絡(luò)破壞和DNA-聚合物纏結(jié)也可能對分離有貢獻(xiàn)。因?yàn)轭A(yù)計(jì)這種網(wǎng)絡(luò)破壞(有掛鉤)比蠕動(dòng)快，所以這種機(jī)制可以解釋與LPA測序基質(zhì)相比，在較弱纏結(jié)的pDMA溶液中分離速度較高。通過視頻顯微鏡研究pDMA基質(zhì)中的dsDNA，進(jìn)一步提示了這種DNA分離的混合機(jī)制。圖6顯示了25。C下兩種DNA分子在3.0%pDMA基質(zhì)中隨時(shí)間的變化，其中一種分子通過蠕動(dòng)遷移而另一種分子破壞網(wǎng)絡(luò)并在通過溶液時(shí)牽拉聚合物鏈。較小的DNA分子蠕動(dòng)通過該溶液，然后鉤到網(wǎng)絡(luò)上并牽拉網(wǎng)絡(luò)，而較大的DNA分子在整個(gè)視屏框期間繼續(xù)蠕動(dòng)。這證明，這兩種機(jī)制可同時(shí)存在于同一基質(zhì)中。如下所示，一種用于毛細(xì)管和微芯片的新型聚合物基質(zhì)/聚合物壁涂布體系，其包含疏水性聚合物和親水性聚合物的混合物，其中疏水性聚合物例如聚(7V,A^二甲基丙烯酰胺)用作DNA分離基質(zhì)，親水性聚合物例如聚(A^羥乙基丙烯酰胺)則用作親水性動(dòng)態(tài)壁涂層，所述物質(zhì)能通過毛細(xì)管，特別是微芯片電泳超快分離DNA序列。疏水性測序聚合物與動(dòng)態(tài)親水性聚合物壁涂層的混合物未曾用于微流體電泳裝置?？稍?分鐘內(nèi)以高準(zhǔn)確率堿基調(diào)用對500-600個(gè)堿基進(jìn)行測序，特別是通過在有效分離距離僅為7.5cm的微通道電泳模式和其它條件如(優(yōu)化)施加的電場強(qiáng)度(如235V/cm)和溫度(如5(TC)下組合兩種這類聚合物進(jìn)行測序。將Mw優(yōu)選約3-4MDa的PDMA用lxTTE+7M脲緩沖液溶解至濃度為3-5%w/v提供了測序基質(zhì)，而將pHEA動(dòng)態(tài)涂層預(yù)先施加到微流體芯片中。此外，將約1-2%低摩爾質(zhì)量pDMA(200-300kDa)加入3。/。(w/v)高摩爾質(zhì)量pDMA(3-4MDa)溶液(總聚合物濃度4c/。(w/v))中產(chǎn)生的測序閱讀長度長得多，電泳6.5分鐘閱讀至多600個(gè)堿基。特別地，如果不受限于任何一種理論或操作方式，這類條件能夠通過瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)和蠕動(dòng)之間某種狀態(tài)的混合DNA分離機(jī)制對DNA進(jìn)行超快測序，這是一種未曾證明的DNA測序機(jī)制?？赏ㄟ^觀察DNA遷移率與片段大小的雙對數(shù)曲線圖推倒出這種機(jī)制，用單分子落射熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這種機(jī)制。在DNA遷移率對DNA大小的雙對數(shù)曲線中，在超快測序條件下線性區(qū)域的斜率為-0.40至-0.60。根據(jù)聚合物特性如分子量、組成和溶液濃度進(jìn)一步優(yōu)化這類分離介質(zhì)以及優(yōu)化壁涂層聚合物，能夠在較短時(shí)間閱讀更長的序列。獲得的結(jié)果代表迄今為止對這一閱讀長度最快的測序時(shí)間，因此使微通道測序技術(shù)發(fā)展向前邁進(jìn)。本發(fā)明的實(shí)施例下面的非限制性實(shí)施例和數(shù)據(jù)闡釋了與本發(fā)明的組合物、系統(tǒng)、方法和/或設(shè)備有關(guān)的各個(gè)方面和特征，包括將疏水性分離基質(zhì)聚合物組分和親水性壁涂層聚合物組分用于微通道電泳。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的組合物、方法、系統(tǒng)和/或設(shè)備提供的結(jié)果和數(shù)據(jù)是令人驚訝、出人意料和與現(xiàn)有技術(shù)相反的。雖然用幾種聚合物組分、組合物和設(shè)備闡釋了本發(fā)明的應(yīng)用，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用多種其它聚合物組分、組合物和/或設(shè)備可獲得類似的結(jié)果，這些都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)施例1PDMA合成由購自美國賓夕法尼亞州費(fèi)斯特維的單體-聚合物和達(dá)哈實(shí)驗(yàn)室公司(Monomer-PolymerandDajacLabs，F(xiàn)easterville,PA，USA)的純度為99+%的單體AUV-二甲基丙烯酰胺合成高分子量pDMA分離基質(zhì)聚合物。在水浴設(shè)定為47'C的情況下，N2流動(dòng)30分鐘使DI水中4wt。/。單體溶液脫氣，然后用V-50(二鹽酸2，2'-氮雙(2-脒基丙烷)，美國弗吉尼亞州里士滿的外克化學(xué)品公司(WakoChemicals,Richmond,VAUSA))啟動(dòng)。16小時(shí)后，將粘性聚合物溶液轉(zhuǎn)移到100,000MW截止值透析膜上，通過頻繁換水透析10天。透析后，凍干樣品，以回收摩爾質(zhì)量超過1MDa的固體pDMA聚合物。本發(fā)明的各種其它基質(zhì)聚合物和共聚物可由市場購得，或者可通過如上所述的類似方式或采用已知的合成技術(shù)或其修改形式由相應(yīng)單體制備得到，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過了解本發(fā)明能夠知道這些方式、技術(shù)或其修改形式。另外，將5mL異丙醇加入上述反應(yīng)混合物能降低pMDA的摩爾質(zhì)量，使其適合混合到混合的摩爾質(zhì)量基質(zhì)中。通過將5mL異丙醇加入單體溶液中，聚合和純化產(chǎn)生的聚合物產(chǎn)品的摩爾質(zhì)量約為200-300kDa。實(shí)施例2pHEA合成為了合成壁涂層聚合物pHEA，7V-羥乙基丙烯酰胺單體是購自刊布萊克斯公司(Cambrex)的45%溶液(商品名DuramideTM)。將一些單體溶液稀釋到100mL體積，以使單體的終濃度為0.5wt%。將水浴設(shè)定為25°C，在N2下使單體溶液脫氣30分鐘。脫氣后，通過加入100pL10wt。/。過硫酸銨溶液(阿來思科公司(AmrescoInc)，美國俄亥俄州索倫(Solon，OHUSA))和10pLTEMED(阿來思科公司)啟動(dòng)該反應(yīng)。使該反應(yīng)進(jìn)行16小時(shí)，然后將聚合物溶液轉(zhuǎn)移到100,000MW截止值透析膜上，通過頻繁換水透析10天。透析后，凍干該溶液，以回收摩爾質(zhì)量超過1MDa的固體聚合物。實(shí)施例3聚合物分子量表征通過串聯(lián)的凝膠滲透色譜-多角激光散射(GPC-MALLS)測定分子量分布。先用連續(xù)連接的ShodexOH-Pak柱SB-806HQ、SB-804HQ和SB-802.5HQ在GPC(沃特公司(WatersCorp),美國馬薩諸塞州米爾福德(Milford，MAUSA))上分餾稀聚合物溶液。分餾后，使GPC流出液直接流入DAWNDSP激光光度計(jì)中，然后流入OptilabDSP干涉法折射計(jì)(這兩種設(shè)備均購自瓦特技術(shù)公司(WyattTechnologies),美國加州圣芭芭拉(SantaBarbara,CAUSA))。在鑒定過程中，將100pL稀(lmg/mL)溶液(含有由O.lMNaCl、50mMNa2HPOjn200ppmNaN3組成的流動(dòng)相)注射到該設(shè)備中，流速為0.300mL/min。用瓦特技術(shù)公司的ASTRA軟件處理GPC-MALLS數(shù)據(jù)。合成的聚合物均用摩爾質(zhì)量、旋轉(zhuǎn)半徑和多分散指數(shù)表征。實(shí)施例4施涂pHEA涂層根據(jù)Albarghouthi等所述的方案，先用1MHC1溶液填充微通道，靜置15分鐘。去除1MHC1溶液后，用去離子水洗滌該通道，然后用pHEA涂層溶液充滿該通道，靜置15分鐘。pHEA涂層溶液是用去離子水配制的聚合物的0.1。/dw/v水溶液。涂布導(dǎo)致通道的電滲流小于lxl0—5cm2/Vs。實(shí)施例5微通道/微芯片電泳在微通道電泳系統(tǒng)上分析ssM13mp18測序片段和ssDNAET-900梯(均來自安瑪西亞生物科學(xué)公司(AmershamBiosciences),美國新澤西州皮斯卡塔韋(Piscataway，NJUSA))，該系統(tǒng)是為我們在美國加利福尼亞州芒廷維尤的阿克拉拉生物科學(xué)公司(ACLARABiosciences,MountainView,CAUSA)的實(shí)驗(yàn)室定制的。該系統(tǒng)能通過激光誘發(fā)的熒光(LIF)進(jìn)行靈敏的多色檢測。該系統(tǒng)由兩個(gè)子系統(tǒng)組成為微流體裝置提供電壓的電氣系統(tǒng)和在熒光分子通過通道中的激光聚焦點(diǎn)時(shí)檢測熒光分子的光學(xué)子系統(tǒng)?？梢杂肔abView軟件中的一個(gè)程序同時(shí)控制這兩個(gè)子系統(tǒng)。實(shí)施例6該電氣系統(tǒng)由能夠獨(dú)立地控制四個(gè)電極的高壓電源供電。各電極可設(shè)定為0-4.5kV，或者可與電路斷開("浮動(dòng)")。該軟件讓使用者能夠在設(shè)定時(shí)間內(nèi)將所有四個(gè)電極的電壓設(shè)定為所需電壓設(shè)定點(diǎn)，可按順序釆用多重電壓和時(shí)間步驟來完成復(fù)雜芯片功能或不同的分離方案。光學(xué)子系統(tǒng)由共聚焦落射熒光系統(tǒng)組成，其中熒光團(tuán)由JDSUniphaseSeries2214-30sl單行488-nm氬離子激光器(美國加州圣荷塞(SanJose，CAUSA))激發(fā)。用反射鏡將激光束導(dǎo)向TE200倒置落射熒光顯微鏡。然后使該光束通過帶通濾光片，用二向色鏡反射回來，通過尼康(Nikon)10x/0.45顯微鏡物鏡聚焦到微流體通道中心，產(chǎn)生直徑約為10的激光點(diǎn)。通過同一物鏡收集發(fā)射的熒光，使其通過二向色鏡，然后通過第二個(gè)寬帶通濾光片(科羅馬技術(shù)公司(ChromaTechnology),美國佛蒙特州布萊特爾博羅(Brattleboro，VTUSA))。使濾過的光通過透射光柵并將其聚焦到冷卻至-15C的高量子效率532x64像素電荷耦合器件(CCD)(濱松公司(HamamatsuCorp.)，美國新澤西州卜利積沃特(Brigewater，NJUSA))，從而測定濾過光的光譜。對CCD相機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行像素分段(binning)，以定量測定一定范圍波長的發(fā)射光的強(qiáng)度，用溶劑的拉曼散射線進(jìn)行校正?？梢?0-50Hz的頻率收集數(shù)據(jù)。用LabView中的程序收集CCD輸出值CCD、.進(jìn)行分段、低通過濾，并儲(chǔ)存。實(shí)施例7用購自麥克羅尼微流體公司(MicronitMicrofluidicsBV)(Enschede，荷蘭)的7.5-cm有效分離距離的單通道玻璃微芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用pDMA或pHEA涂布通道的具體方法是先用1MHC1沖洗15分鐘，接著用0.1%(w/v)聚合物溶液填充該通道15分鐘。在用TTE緩沖液(50mMTris，50mMTAPS和2mMEDTA)配制的含有7M脲、Pop-5TM基質(zhì)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems，Inc)，美國加州福斯特城(FosterCity，CAUSA))和貝克曼(Beckman)LongReadTMLPA基質(zhì)(安瑪西亞公司)的pDMA(Mw=3.4MDa)和LPA(Mw=2.5MDa)基質(zhì)中分離ssDNA和測序，其濃度范圍是3-5%(w/v)。在各輪實(shí)驗(yàn)中，施加235V/cm電場60秒，然后注射樣品。同時(shí)，用1%或2%低摩爾質(zhì)量pDMA(約200-300kDA)和3%到4%高摩爾質(zhì)量pDMA配制混合摩爾質(zhì)量pDMA基質(zhì)。采用偏移量為100pm的偏移T注射器，以100V/cm注射樣品40秒。以235V/cm進(jìn)行分離，將38V/cm反偏壓施加于樣品和樣品廢液孔。在該輪實(shí)驗(yàn)期間芯片維持在50°C。用NNIM堿基調(diào)用軟件(Basecaller)(NNIM，LLC,美國猶他州鹽湖城(SaltLakeCounty,UTUSA))和測序軟件(Sequencher)v4.0.5(遺傳密碼公司(GeneCodesCorp.),美國密歇根州安阿伯(AnnArbor，MIUSA))完成堿基調(diào)用(basecalling)。這類pDMA基質(zhì)在6-7分鐘的測序閱讀長度約為500-600個(gè)堿基，而市售基質(zhì)的測序長度不超過約400個(gè)堿基。實(shí)施例8流變學(xué)用AntonPaarPhysicaMCR300(美國弗吉尼亞州阿什蘭(Ashland，VA，USA))測定零剪切粘度，用連接于數(shù)字控制的再循環(huán)水浴(胡拉波美國公司(JulaboUSAInc.),美國賓夕法尼亞州阿倫敦(Allentown，PA，USA))的珀耳帖控制器保溫。用錐-板(CP50-1型)固定裝置和雙隙庫愛特(Couette)(DG26.7型)固定裝置在25-50。C溫度范圍內(nèi)'進(jìn)行受控剪切應(yīng)力和剪切率掃描。用這一設(shè)備產(chǎn)生零剪切粘度與聚合物濃度的曲線(參見圖2)。實(shí)施例9視頻顯微術(shù)用YOYO-1(分子探針公司(MolecularProbes),美國俄勒岡州尤金(Eugene,ORUSA))熒光標(biāo)記DNA。所有蛋白質(zhì)和糖試劑均購自費(fèi)希爾科技公司(FisherScientific)(美國賓夕法尼亞州匹茲堡(Pittsburgh，PAUSA))，48kbpds-XDNA購自英杰公司(Invitrogen)(美國加州圣地亞哥)，卩巰基乙醇(BME)購自美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MOUSA)。該標(biāo)記法每5-10個(gè)dsDNA堿基對產(chǎn)生約1個(gè)標(biāo)記。為了觀察熒光標(biāo)記的DNA，將染色溶液與過氧化氫酶母液、葡萄糖氧化酶母液、BME、20%葡萄糖緩沖液和聚合物溶液(預(yù)先混合24消失以溶解)混合。溫和混合過夜后，準(zhǔn)備對該聚合物/DNA溶液拍照。實(shí)施例10用于對DNA拍照的雜交芯片由Sylgard184聚(二甲基硅氧烷)(費(fèi)希爾科技公司，美國賓夕法尼亞州匹茲堡)微通道和1.5-厚的蓋玻片(費(fèi)希爾科技公司，美國賓夕法尼亞州匹茲堡)組成。以10:1的重量比混合預(yù)聚物和固化劑，從而形成PDMS通道。將脫氣混合物傾倒在ScotchMagicTapeTM細(xì)條上，在真空室中固化過夜。將固化PDMS切成0.5cm長的方塊，以適合蓋玻片，所得通道的深度約為50-60微米。實(shí)施例11用密歇根大學(xué)莫里斯實(shí)驗(yàn)室(Morrislab，UniversityofMichigan)建立的自制系統(tǒng)觀察DNA遷移(Albarghouthi，M.N.，Stein，T.M.和Barron，A.E.(2003)五/e"，/20m^24:1166-1175;deCarmejane，O.,Yamaguchi，Y.，Todorov，T丄和Morris,M.D.(2001)五/ec^op/zorw^22:2433-2441)。該成像系統(tǒng)由裝有尼康CFI100x/N.A.1.4油浸顯微鏡物鏡的尼康TE200(尼康儀器公司(NikonInstrumentsInc.),美國紐約州梅爾維爾(MeMlle，NY，USA))倒置落射熒光顯微鏡組成。用100瓦汞燈光源(通過依次排列的吸熱濾器和藍(lán)光激發(fā)濾器立方體聚焦(460nm-500nm))(科羅馬技術(shù)公司，美國佛蒙特州布萊特爾博羅)獲得DNA熒光。用0.5英寸CCD,TM-6710-CL相機(jī)(JAIPulnix，美國加州桑尼維爾(Sunnyvale，CAUSA))通過510nm寬帶濾光片(科羅馬技術(shù)公司，美國佛蒙特州布萊特爾博羅)和VS4-1845第3代圖象增強(qiáng)器(視頻示波器國際公司(VideoscopeInternational),美國弗吉尼亞州杜勒斯(Dulles，VAUSA))收集DNA發(fā)出的熒光。該高速相機(jī)的幀率可調(diào)節(jié)至120幀/秒，全部空間分辨率為648x484像素。以30幀/秒捕獲所有視頻，利用XCAP-STD(EPIX公司(EPIXINC)，美國伊利諾斯州野牛林(BuffaloGrove，ILUSA))軟件通過PIXCI控制板(EPIX公司，美國伊利諾斯州野牛林)直接儲(chǔ)存至計(jì)算機(jī)。用購自麥克羅尼公司的高電壓電源施加電泳電壓?？捎么思夹g(shù)拍攝通過聚合物基質(zhì)遷移的單個(gè)DNA分子的照片。實(shí)施例12采用動(dòng)態(tài)pHEA聚合物預(yù)先涂布的微通道，將4。/。(w/v)聚(N-甲氧基乙基丙烯酰胺)(pNMEA)聚合物溶液加載到該通道中作為測序基質(zhì)。當(dāng)溫度設(shè)定為50。C，7.5cm長的分離通道上電場為235V/cm時(shí)，約6.5分鐘實(shí)現(xiàn)的DNA測序閱讀長度為540個(gè)堿基(準(zhǔn)確度98.5%)。用NNIM堿基調(diào)用軟件和測序軟件4.0.5版進(jìn)行堿基調(diào)用。(測序電泳圖未顯示)實(shí)施例13除了在微芯片上測序DNA外，也將本發(fā)明聚合物體系(如pDMA基質(zhì)和pHEA動(dòng)態(tài)涂層)用于ABI3100市售設(shè)備的22-cm毛細(xì)管。以5(TC的溫度和250V/cm的電場進(jìn)行所有測序?qū)嶒?yàn)。原始測序數(shù)據(jù)顯示，相對于市售P0PTM-6基質(zhì)，4%混合摩爾質(zhì)量pDMA("/。低摩爾質(zhì)量和3%高摩爾質(zhì)量)能夠快速測序。這類pDMA基質(zhì)中的分離速度比POpTM基質(zhì)快3倍，這證明在毛細(xì)管設(shè)備中也可進(jìn)行更快的測序。測序結(jié)果見表4，該結(jié)果比較了pHEA涂布的毛細(xì)管中4y。混合摩爾質(zhì)量pDMA和POPTM-6。混合摩爾質(zhì)量pDMA的分離速度快得多。這種基質(zhì)能在約22分鐘內(nèi)測序650個(gè)堿基。用NNIM堿基調(diào)用程序和測序程序第4.0.5版完成堿基調(diào)用(4%混合摩爾質(zhì)量的測序電泳圖未顯示)。___表4-測序基質(zhì)的比較_聚合物涂層平均閱讀長度(11=4)長閱讀長度時(shí)間(分鐘)4%pDMA*~pHEA650+10^^POP-6pHEA677+6875760*3%高摩爾質(zhì)量(2.7MDa)+l。/。低摩爾質(zhì)量(280kDa)*承*如前述實(shí)施例所示，能夠用具有pHEA動(dòng)態(tài)涂層的pDMA基質(zhì)在6.5分鐘內(nèi)對至多600個(gè)堿基進(jìn)行DNA測序。為此工作合成的pDMA的性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于市售基質(zhì)，相對于更具疏水性的涂層選擇pHEA對延長閱讀長度至關(guān)重要。單鏈DNA片段在本研究中使用的pDMA基質(zhì)中的遷移率高于用于前述微通道研究的普通LPA基質(zhì)。pDMA基質(zhì)在短短的7.5cm分離距離上測序閱讀長度超過600個(gè)堿基的事實(shí)也對高速有貢獻(xiàn)。流變學(xué)數(shù)據(jù)和視頻顯微鏡研究提示，弱纏結(jié)的pDMA網(wǎng)絡(luò)的測序速度可能高于纏結(jié)較強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)，因?yàn)檫w移的DNA分子可能更頻繁地破壞該網(wǎng)絡(luò)。雖然網(wǎng)絡(luò)破壞通常導(dǎo)致分離能力降低，但DNA可鉤住并牽拉松散的聚合物鏈，這類似于DNA遷移率仍然是大小依賴性的TEC機(jī)制。雖然視頻顯微術(shù)提示了這種混合分離機(jī)制，但目前沒有現(xiàn)成的DNA分離理論考慮了這些機(jī)制。可優(yōu)化此系統(tǒng)，相對DNA尺寸分析遷移率時(shí)提示，可能進(jìn)行較長的閱讀。在11.5cm和15.9cm通道長度上進(jìn)行測序。假定是擴(kuò)散-限制體系，堿基調(diào)用軟件可準(zhǔn)確調(diào)用堿基的最小分辨率與通道長度的平方根成比例，而遷移時(shí)間應(yīng)線性增加。因此，采用11.5cm通道時(shí)，可用此體系在9分鐘內(nèi)閱讀至多630個(gè)堿基，而15.9cm通道將在12分鐘內(nèi)閱讀800個(gè)堿基。對于4n/。pDMA基質(zhì)在850個(gè)堿基附近開始轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄏ蛉鋭?dòng)的現(xiàn)象破壞了這些結(jié)果，這種轉(zhuǎn)變將改變遷移率對長度的依賴性，可以預(yù)計(jì)到閱讀長度變短。然而，pDMA基質(zhì)與pHEA動(dòng)態(tài)涂層在較短時(shí)間內(nèi)提供長測序閱讀的能力代表了微芯片測序系統(tǒng)的顯著進(jìn)步，必將使下一代測序技術(shù)的發(fā)展向前推進(jìn)。本發(fā)明的體系/組合物可延伸至測序中心或可采用線性聚合物基質(zhì)和動(dòng)態(tài)聚合物涂層的其它測序應(yīng)用。也可能對需要電泳分離DNA的許多基因分型和法醫(yī)應(yīng)用感興趣，因?yàn)榭梢?例如)用圖1A所示的基質(zhì)和涂層組合分離大范圍的DNA尺寸。權(quán)利要求1.一種用于微通道電泳的DNA測序或基因分型組合物，其包含疏水性分離基質(zhì)組分和親水性壁涂層組分，所述疏水性分離基質(zhì)組分含有式id="icf0001"file="A2006800500220002C1.tif"wi="48"he="4"top="50"left="22"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>的聚丙烯酰胺，式中R選自H和甲基，R′和R″獨(dú)立地選自C1-約C8直鏈烷基部分、C1-約C8烷氧基取代的直鏈烷基部分、C1-約C8支鏈烷基部分和C1-約C8烷氧基取代的支鏈烷基部分，或者它們的共聚物，所述聚丙烯酰胺至少部分可溶于水；所述親水性壁涂層組分含有聚(N-羥乙基丙烯酰胺)。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)組分選自聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)和聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)共聚物。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)組分包含水性介質(zhì)配制的約3n/。(w/v)-5e/。(w/v)聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)組分含有約3%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)組分含有約P/。(w/v)-2。/。(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。6.—種測序組合物，其包含疏水性分離基質(zhì)組分和壁涂層組分，所述疏水性分離基質(zhì)組分含有聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)組分，所述壁涂層組分含有親水性聚(N-羥乙基丙烯酰胺)組分。7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)組分包含水性介質(zhì)配制的約3。/。(w/v)-5W(w/v)聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述基質(zhì)組分包含約3%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)和約l%(w/v)-2%(w/v)平均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。9.一種用于DNA和RNA分離的微通道電泳系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含疏水性分離基質(zhì)組分和親水性壁涂層組分以及微通道基材，所述疏水性分離基質(zhì)組分含有聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)，所述親水性壁涂層組分含有聚(N-羥乙基丙烯酰胺)；所述微通道基材選自微尺寸毛細(xì)管和微流體電泳芯片，所述毛細(xì)管限定的內(nèi)部尺寸約為10微米-150微米，所述微流體電泳芯片的微通道尺寸約為10微米-150微米。10.如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述基質(zhì)組分包含約3%(W/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)和約1%(w/v)-2%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。11.如權(quán)利要求IO所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述聚(N-羥乙基丙烯酰胺)與所述基材相接觸。12.—種使用聚合物壁涂層和分離基質(zhì)體系進(jìn)行電泳DNA和RNA分離的方法，所述方法包括提供含有聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)組分和聚(N-羥乙基丙烯酰胺)組分的體系，聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)組分約占所述體系的3%(w/v)-5%(w/v);將所述體系引入選自微通道電泳毛細(xì)管和微流體電泳芯片的基材；和在施加電壓下使選自DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物組分和RNA組分的混合物與所述體系接觸足以至少部分地電泳分離所述混合物的時(shí)間。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)組分包含約3%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和約1%(w/v)-2%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，使所述聚(N-羥乙基丙烯酰胺)組分與所述基材相接觸。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚(N-羥乙基丙烯酰胺)組分是用水性介質(zhì)配制的。16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述體系包含DNA測序緩沖液，所述混合物包含DNA分子。17.如權(quán)利要求16所述的方法，分離單鏈DNA，其中所述DNA序列組分之一含有至多約800個(gè)堿基，所述分離與時(shí)間和微通道長度有關(guān)聯(lián)。18.—種微通道電泳設(shè)備，其包括選自微尺寸毛細(xì)管和微流體電泳芯片的基材；以及基材上的聚合物體系，所述體系含有聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)組分和聚(N-羥乙基丙烯酰胺)組分，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)組分約占所述體系的3%(w/v)-5%(w/v)。19.如權(quán)利要求18所述的設(shè)備，其特征在于，所述基質(zhì)組分含有約3%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和約l%(w/v)-2%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。20.如權(quán)利要求18所述的設(shè)備，其特征在于，將所述聚(N-羥乙基丙烯酰胺)組分施加于所述基材。21.—種使用聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)基質(zhì)提高DNA分離速度的方法，所述方法包括提供選自微尺寸毛細(xì)管和微流體電泳芯片的微通道基材；使親水性聚(N-羥乙基丙烯酰胺)壁涂層組分偶聯(lián)于所述基材；將疏水性聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)基質(zhì)組分引入所述基材，所述基質(zhì)組分至少部分可溶于水；和在施加電壓下使DNA序列組分的混合物與所述基質(zhì)組分接觸足以至少部分地電泳分離所述混合物的時(shí)間，所述聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的分子量和濃度至少部分地足以使所述混合物中的DNA組分發(fā)生瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)和蠕動(dòng)中至少一種。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述分離是所述瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)和蠕動(dòng)的組合。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述DNA組分在約50%的所述遷移時(shí)間中通過瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)遷移，在約50%的所述遷移時(shí)間中通過蠕動(dòng)遷移。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，通過落射熒光視頻顯微術(shù)觀察熒光染色的DNA分子來監(jiān)測DNA遷移動(dòng)力學(xué)。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)含有約3%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)和約l%(w/v)-2%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述遷移的特征是通過所述基質(zhì)的DNA電泳遷移率與DNA分子大小的雙對數(shù)曲線的線性區(qū)域，所述分子大小以堿基和堿基對之一表示。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述DNA分子大小約為200個(gè)堿基到約800個(gè)堿基，所述曲線的線性區(qū)域的斜率約為-0.40至-0.60。28.—種利用疏水性聚合物基質(zhì)提高DNA分離速度的方法，所述方法包括提供選自微尺寸毛細(xì)管和微流體電泳芯片的微通道基材；使親水性聚(N-羥乙基丙烯酰胺)壁涂層組分偶聯(lián)于所述基材；將疏水性分離基質(zhì)組分引入所述基材，所述基質(zhì)組分選自權(quán)利要求1所述的聚丙烯酰胺、其共聚物、所述聚丙烯酰胺的組合、所述共聚物的組合以及任意所述聚丙烯酰胺與任意所述共聚物的組合，所述基質(zhì)組分至少部分可溶于水；和在施加電壓下使DNA序列組分的混合物與所述基質(zhì)組分接觸足以至少部分電泳分離所述混合物的時(shí)間，所述聚丙烯酰胺的分子量和濃度足以至少部分地使所述混合物中的DNA組分發(fā)生瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)和蠕動(dòng)中至少一種。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述分離是所述瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)和蠕動(dòng)的組合。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述DNA組分在約50。/。的所述遷移時(shí)間中通過瞬時(shí)纏結(jié)偶聯(lián)遷移，在約50%的所述遷移時(shí)間中通過蠕動(dòng)遷移。31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，通過落射熒光視頻顯微術(shù)觀察熒光染色的DNA分子來監(jiān)測DNA遷移動(dòng)力學(xué)。32.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)組分選自聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)及其共聚物。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述基質(zhì)包含約3%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為3-5MDa的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)和約1%(w/v)-2%(w/v)重均摩爾質(zhì)量約為200-300kDa的聚(N，N二甲基丙烯酰胺)。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述遷移的特征是通過所述基質(zhì)的DNA電泳遷移率與DNA分子大小的雙對數(shù)曲線的線性區(qū)域，所述分子大小以堿基和堿基對之一表示。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述DNA分子大小范圍是約200個(gè)堿基到約800個(gè)堿基，所述曲線的線性區(qū)域的斜率約為-0.40至-0.60。全文摘要本發(fā)明提供了用于微通道分離的基質(zhì)聚合物和動(dòng)態(tài)涂層聚合物，其組合物，以及相關(guān)方法、體系和設(shè)備。文檔編號(hào)G01N27/00GK101351260SQ200680050022公開日2009年1月21日申請日期2006年11月1日優(yōu)先權(quán)日2005年11月1日發(fā)明者A·E·巴容,C·P·弗雷拉克,C·W·凱恩申請人:西北大學(xué)