專利名稱：：動(dòng)物攝食習(xí)性的測(cè)定方法動(dòng)物攝食習(xí)性的測(cè)定方法發(fā)明領(lǐng)域避難所區(qū)域可包4舌未處理目標(biāo)作物部分(即結(jié)構(gòu)性避難所(structuredrefUge))或害蟲(chóng)的其它合適作物部分和雜草宿主部分(即替代性宿主避難所(alternativehostreflige)或天然避難所(naturalrefuge))。在評(píng)價(jià)可為能夠在多種宿主植物上發(fā)育的害蟲(chóng)所利用的避難所時(shí)，需要若干評(píng)價(jià)方法，來(lái)"i平價(jià)存在于不同潛在宿主上的部分昆蟲(chóng)種群。本發(fā)明還提供一種測(cè)定采食期的昆蟲(chóng)是否攝食過(guò)煙草植物的方法。該方法包括測(cè)定成蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸特征中C16:0和C18:3的相對(duì)含量。0014]本發(fā)明還提供一種測(cè)定采食期的昆蟲(chóng)是否攝食過(guò)大豆植物的方法。該方法包括測(cè)定成蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸特征中C16:0、C18:l、C18:2和C18:3的相對(duì)含量。圖3柱狀圖表示才艮據(jù)實(shí)施例1測(cè)定，煙草植物飼養(yǎng)的蛾的脂肪酸特征。在一些實(shí)施方案中，一種脂肪酸的存在可確定動(dòng)物是否攝食過(guò)目標(biāo)植物。在另一些實(shí)施方案中，兩種或更多種脂肪酸的組合可確定動(dòng)物是否攝食過(guò)月標(biāo)植物。在又一些實(shí)施方案中，脂肪酸特征可確定動(dòng)物是否攝食過(guò)目標(biāo)植物。脂肪酸特征可以是一種或多種脂肪酸相對(duì)于所測(cè)總脂肪酸的任何比率。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所設(shè)計(jì)的本發(fā)明方法為測(cè)定動(dòng)物的攝食特性提供了一種高通量方法。該方法一般包括從大量動(dòng)物中采集組織樣品，將樣品加到多孔板的各孔中。然后篩選多孔板中各樣品存在的目標(biāo)植物的至少一種指示物，或者測(cè)定上述組織樣品的脂肪酸特征。0051本文所述用于跟蹤動(dòng)物攝食習(xí)性或攝食史的方法和構(gòu)思具有多種用途。在具體實(shí)施方案中，本文所述篩選方法可以用來(lái)確定相對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的天然避難所區(qū)域的害蟲(chóng)。這種方法包括從轉(zhuǎn)基因作物附近誘捕害蟲(chóng)；篩選誘;t甫害蟲(chóng)存在的至少一種目標(biāo)植物的一種或多種指示物；測(cè)定攝食轉(zhuǎn)基因作物以外植物的害蟲(chóng)種群百分比。或者另外，該方法可以包括從誘捕害蟲(chóng)采集至少一種組織；測(cè)定組織的脂肪酸特征；將組織的脂肪酸特征與已知在其生命周期內(nèi)攝食過(guò)目標(biāo)植物的害蟲(chóng)的脂肪酸特征進(jìn)行比較后，測(cè)定攝食轉(zhuǎn)基因作物以外植物的害蟲(chóng)種群百分比?！虼?，參與確定害蟲(chóng)避難所區(qū)域的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)商、科學(xué)家和管理當(dāng)局可以利用與害蟲(chóng)攝食習(xí)性和攝食史有關(guān)的資料，確定這些害蟲(chóng)的天然避難所區(qū)域是否足以部分或全部代替農(nóng)民在自己農(nóng)田中種植用于目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物的結(jié)構(gòu)性避難所的需要，從而在明顯延遲或防止抗性害蟲(chóng)種群發(fā)生的同時(shí)使作物產(chǎn)量最大化。實(shí)施例0052下面的實(shí)施例本質(zhì)上僅是示例性的，不應(yīng)解釋為具有限制性意義。通過(guò)測(cè)定m/z176面積與m/z180面積的比率，對(duì)樣品的可替寧進(jìn)行定量測(cè)定，其中m/z180為氘化可替寧標(biāo)準(zhǔn)。使用每個(gè)樣品中的可替寧標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定保留時(shí)間。可替寧數(shù)據(jù)用十億分之幾表示，檢出限大約十億分之一。棉酚分析將衍生劑(lml)加到裝有研磨蛾的各孔中。板用石蠟?zāi)じ采w，把蓋壓在石蠟?zāi)ど蠈⒏骺酌芊?。使板渦旋l分鐘，然后打開(kāi)蓋去掉密封膜后，板用箔紙覆蓋。將板在烤箱或加熱孔板夾中于80-90°C加熱1小時(shí)。從加熱系統(tǒng)中取出后冷卻，再次將板用石蠟?zāi)じ采w，加蓋密封各孔。將板在2500-3000rpm下離心5分鐘。[00701采用DVBSPE從衍生劑中提取棉酚。柱子依次用丙酮(0.5ml)和甲醇(0.5ml)洗滌，制備DVBSPE96孔板。然后，柱子用含有等量水和DMF混合物的溶液(0.5ml)保持濕潤(rùn)。[0071為了避免交叉污染，從裝有蛾和衍生劑的96孔板小心地打開(kāi)蓋子并掀起石蠟?zāi)?。然后，將?0.5ml)加到各孔中。將各個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到DVBSPE96孔板的相應(yīng)孔中，使之過(guò)柱。再將另外的DMF(0.5ml)加到裝有蛾殘余物的最初的96孔板中，將板用石蠟?zāi)じ采w，然后加蓋，渦旋1分鐘，按3000rpm離心5分鐘。離心后，把水(0.5ml)加到各孔中，將樣品轉(zhuǎn)移到DVBSPE96孔板的相應(yīng)孔中。0072樣品過(guò)柱后，柱子依次用20:80水:曱醇(0.5ml)和5:95丙酮曱醇(0.5ml)洗滌。隨后，用丙酮(50(^1)把棉酚從柱子中洗脫到2ml或1.5ml96孔板中。從樣品中除去丙酮，樣品用溫和的氮?dú)饬鞲稍?。將樣品保存?2(TC直到用電噴霧離子化/質(zhì)譜/質(zhì)i普(ESI/MS/MS)進(jìn)行分析。棉酚的HPLC/ESI/MS/MS測(cè)定[0073向各樣品中加入丙酮(200|111),并將樣品混勻。然后，將包含5嗎/ml氘化衍生化雙苯胺-棉酚(20^il)的溶液加到各個(gè)樣品中作為內(nèi)標(biāo)。樣品加蓋后渦旋，然后轉(zhuǎn)移到0.5ml96孔板中用于分析。[0074HPLC使用短柱(ZorbaxEclipseXBD-C18，購(gòu)自AgilentTechnologies,Inc.)雙溶劑流動(dòng)相。溶劑A為10%水的曱醇溶液，溶劑B為2:1乙腈:丙酮。流速為0.25ml/分鐘，梯度見(jiàn)表1。表l:HPLC溶劑梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>[0075質(zhì)i普4義為Waters公司的MicromassQuattroUltimaLC/MS/MS檢測(cè)器，包括電噴霧負(fù)離子化三重四極桿質(zhì)譜儀(triplequadrupolemassspectrometerwithnegativeelectrosprayionization)。因?yàn)镠PLC無(wú)法提供正確的雙苯胺-棉酚電噴霧負(fù)離子化的電離基質(zhì)，所以過(guò)HPLC柱后按0.05ml/分鐘的流速，引入0.6%NH4OH的曱醇溶液。用混合T形接口(mixingT-connection)，完成NH4OH的MeOH溶液與HPLC洗脫液過(guò)柱后的混合。在MS/MS方式中，用第一個(gè)四極桿來(lái)篩選667.3表示雙苯胺-棉酚負(fù)離子的質(zhì)荷比。在第二個(gè)四極桿中，667.3質(zhì)荷比在碰撞室內(nèi)破碎。用第三個(gè)四極桿來(lái)篩選碎片離子一苯胺基-棉酚，其質(zhì)荷比為574.2，這是因?yàn)槭チ艘粋€(gè)苯胺。檢出第二碎片離子提供了改進(jìn)的特異性，并增加了信噪比。[0076通過(guò)574.2m/z的峰面積與內(nèi)標(biāo)氘化雙苯胺-棉酚峰面積的比率確定棉酚的半量子化。然后將這些比率與標(biāo)準(zhǔn)、空白和實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的對(duì)照蛾的結(jié)果相比較以確定棉酚是否存在。結(jié)果[0077如上所述，對(duì)伺養(yǎng)在煙草、棉花、大豆和花生植物的煙夜蛾幼蟲(chóng)的脂肪酸特征、可替寧的存在和棉酚的存在進(jìn)行了分析。[0078為了確立各植物宿主的脂肪酸特征，對(duì)總離子流色譜圖積分，獲得各種脂肪酸(C16:0、C16:l、C18:0、C18:2和C18:3)的面積，合計(jì)得到總量。一種脂肪酸占總脂肪酸的百分比見(jiàn)下表2至表5。所有4種宿主植物的比較顯示，每一種都有可用來(lái)與其它宿主區(qū)別的獨(dú)特的脂肪酸特征。表2:花生植物飼養(yǎng)蛾的脂肪酸比率<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[0079采用軟獨(dú)立建模分類法(SoftIndependentModelingforClassAnalogy,SIMCA),開(kāi)發(fā)出基于4種作物每一種的飼養(yǎng)蛾脂肪酸特征的監(jiān)督分類(supervisedclassification)。SIMCA模型開(kāi)發(fā)為4種作物的每一種產(chǎn)生單獨(dú)的主成分分析(PrincipalComponentAnalysis,PCA)模型或者分類模型。新的未知樣品用各PCA模型進(jìn)行分類，通過(guò)未知樣品距PCA組模型的最小距離確定其組成員關(guān)系。參見(jiàn)圖1-4。以S/S。對(duì)Ho作圖顯示，橫坐標(biāo)上樣品至模型距離相對(duì)于平均模型距離(S/S。)，及各樣品在縱坐標(biāo)上的水平(leverage)。按5%顯著水平的水平線和垂直線表示組限(classlimit)?？蓪蓷l橫線內(nèi)接近原點(diǎn)的未知樣品劃分為組模型成員。兩條沖黃線以外的樣品不屬于組模型。圖1-4顯示可根據(jù)幼蟲(chóng)變態(tài)前飼喂的宿主植物，應(yīng)用脂肪酸特征數(shù)據(jù)，對(duì)蛾樣品進(jìn)行分類。表6顯示模型之間的距離。模型間距離越大，組間差異越大。一般而言，模型差異>3表示有顯著差異的組模型。數(shù)值范圍為200-45,000的，組it型顯著不同，并可4艮據(jù)其組，對(duì)新樣品進(jìn)行分類。表6:棉花、煙草、大豆和花生植物之間的模型距離<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>0080棉酚的有效性試驗(yàn)在不同的兩天內(nèi)分兩批單獨(dú)進(jìn)行。大多數(shù)昆蟲(chóng)飼養(yǎng)在棉花上。第一天進(jìn)行第一批試驗(yàn)，包括苘麻、大豆和豌豆喂養(yǎng)的昆蟲(chóng)用于比較。預(yù)期該批將被證明為棉酚陰性。第二天，包括人工飼料喂養(yǎng)的昆蟲(chóng)作為陰性對(duì)照。這兩天內(nèi)，還進(jìn)行空白和標(biāo)準(zhǔn)試-驗(yàn)作為額外的試驗(yàn)對(duì)照。[0081圖5中的結(jié)果用電噴霧/質(zhì)譜儀記錄的信噪比表示，是電噴霧/質(zhì)譜儀給出最一致的結(jié)果。也可使用質(zhì)譜儀的其它響應(yīng)參數(shù)，例如峰面積。提供以下每個(gè)處理組的最小、平均和最大信噪比人工飼料、苘麻、大豆、豌豆或棉花飼養(yǎng)昆蟲(chóng)(單獨(dú)表示兩天中棉花飼喂的昆蟲(chóng))。選擇信噪比的截止值12作為確定棉酚存在與否的數(shù)值(若大于該值，則樣品為陽(yáng)性；若小于或等于該值，則為陰性)。采用這些標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)中棉花伺養(yǎng)昆蟲(chóng)總被鑒定為棉酚陽(yáng)性。對(duì)于棉花飼養(yǎng)蛾，信噪比通?！?00,幾乎總>30，并從未<14。兩天的最小值分別14和18,每天所測(cè)得的棉花銅喂昆蟲(chóng)的總數(shù)〉50。信噪比標(biāo)準(zhǔn)(signaltonoisecriteria)取決于總的方法，因此在實(shí)驗(yàn)室之間有所不同。因此，進(jìn)行有效性研究以設(shè)定使假陰性最小的標(biāo)準(zhǔn)十分重要。[00821使用信噪比標(biāo)準(zhǔn)，棉酚HPLC-MS測(cè)定法有效性研究的結(jié)果見(jiàn)表7。發(fā)現(xiàn)所有棉花喂養(yǎng)蛾都是棉酚陽(yáng)性的。其它不含棉酚植物的飼養(yǎng)蛾具有一定的假陽(yáng)性比率。表7還表示非棉酚植物飼養(yǎng)的蛾存在一定的假陽(yáng)性比率。也就是說(shuō)，有些蛾可能被鑒定為在棉花上飼養(yǎng)，但是它們卻不是在棉花上飼養(yǎng)的。例如，所測(cè)28只苘麻飼養(yǎng)蛾中有4只被鑒定為在棉花上飼養(yǎng)。[0083檢測(cè)棉酚所設(shè)置的信噪比為12:1,試驗(yàn)成功鑒定出所有得自棉花的昆蟲(chóng)(棉酚陽(yáng)性)，但是假陽(yáng)性比率約為15°/。。也就是說(shuō)，一定數(shù)量未在棉花上飼養(yǎng)的昆蟲(chóng)被保守地鑒定來(lái)自棉花。表7:有效性研究結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權(quán)利要求1.一種測(cè)定采食期的動(dòng)物是否攝食過(guò)目標(biāo)植物的方法，該方法包括篩選動(dòng)物存在的目標(biāo)植物的至少一種指示物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物堿、植物蛋白、遺傳標(biāo)記、礦物質(zhì)、次生代謝物、其衍生物和它們的組合。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述指示物選自煙堿、降煙堿、可替寧、降可替寧和棉酚。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述動(dòng)物是害蟲(chóng)。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述動(dòng)物是昆蟲(chóng)。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)植物是作物。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)植物是選自以下的作物棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、煙草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿和小麥。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述動(dòng)物是谷實(shí)夜蛾或煙夜蛾。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述指示物是黃酮類，選自花色素苷、黃烷醇、二氫黃酮、黃酮醇、黃酮和異黃酮。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述指示物是生育酚，選自RRR-生育酚、(3-生育酚、Y-生育酚、5-生育酚、生育三烯酚、oc-生育三烯酚、，生育三烯酚和5-三烯甘油酯。11.權(quán)利要求l的方法，其中該方法還包括從動(dòng)物中采集組織樣品；從組織樣品中提取脂肪酸；分析提取的脂肪酸以確定動(dòng)物的脂肪酸特征；和將該動(dòng)物的脂肪酸特征與已知在其生命周期中攝食過(guò)目標(biāo)植物的動(dòng)物的脂肪酸特征相比較。12.權(quán)利要求11的方法，其中該方法還包括使提取的脂肪酸進(jìn)行酯交換以產(chǎn)生脂肪酸甲酯的混合物；和分離并檢測(cè)脂肪酸甲酯的混合物以確定動(dòng)物的脂肪酸特征。13.權(quán)利要求11的方法，其中所述方法按高通量形式實(shí)施，包括從大量動(dòng)物中采集組織樣品；將組織樣品放入多孔板的各孔中；和篩選各組織樣品存在的目標(biāo)植物的一種或多種指示物。一14.權(quán)利要求13的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物堿、植物蛋白、遺傳標(biāo)記、礦物質(zhì)、其衍生物和它們的組合。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述指示物選自煙堿、降煙堿、可替寧、降可替寧和棉酚。16.—種測(cè)定動(dòng)物是否纟聶食過(guò)至少一種目標(biāo)4直物的方法，該方法包括從動(dòng)物中采集至少一種組織；測(cè)定組織的脂肪酸特征；和將該組織的脂肪酸特征與已知在其生命周期內(nèi)攝食過(guò)目標(biāo)植物的動(dòng)物的脂肪酸特征相比較。17.權(quán)利要求16的方法，其中該方法還包括將組織與溶劑接觸以便從組織中提取脂肪酸；使脂肪酸進(jìn)行酯交換以制備脂肪酸曱酯的混合物；和分析脂肪酸曱酯的混合物以測(cè)定組織的脂肪酸特征。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述目標(biāo)植物是選自以下的作物棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、煙草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿和小麥。19.權(quán)利要求16的方法，其中該方法還包括分析組織中存在的目標(biāo)植物的至少一種指示物。20.權(quán)利要求19的方法，其中該方法包括測(cè)定組織的脂肪酸特征后，分析組織中存在的目標(biāo)植物的至少一種指示物。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物堿、植物蛋白、遺傳標(biāo)記、礦物質(zhì)、次生代謝物、其衍生物和它們的組合。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述指示物選自煙堿、降煙堿、可替寧、降可替寧和棉酚。23.權(quán)利要求16的方法，其中該方法包括測(cè)定成蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸特征中C16:l和C18:l的相對(duì)含量，以確定采食期的昆蟲(chóng)是否攝食過(guò)棉花植物。24.權(quán)利要求23的方法，其中該方法還包括分析成蟲(chóng)的試驗(yàn)組織中存在的棉酚。25.權(quán)利要求16的方法，其中該方法包括測(cè)定成蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸特征中C16:0、C18:l和C18:2的相對(duì)含量，以確定采食期的昆蟲(chóng)是否攝食過(guò)花生植物。26.權(quán)利要求25的方法，其中該方法還包括分析成蟲(chóng)的試驗(yàn)組織中存在的蛋白特異性變應(yīng)原。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述蛋白特異性變應(yīng)原是白藜蘆醇。28.權(quán)利要求16的方法，其中該方法包括測(cè)定成蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸特征中C16:0和C18:3的相對(duì)含量，以確定采食期的昆蟲(chóng)是否攝食過(guò)煙草植物。29.權(quán)利要求28的方法，其中該方法還包括分析成蟲(chóng)的試驗(yàn)組織中存在的煙堿和/或煙堿衍生物。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述煙堿衍生物選自可替寧、降可替寧、降煙》咸和其它煙-威代謝物。31.權(quán)利要求16的方法，其中該方法包括測(cè)定成蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸特征中C16:0、C18:l、C18:2和C18:3的相對(duì)含量，以確定采食期的昆蟲(chóng)是否攝食過(guò)大豆植物。32.權(quán)利要求31的方法，其中該方法還包括分析成蟲(chóng)的試驗(yàn)組織中存在的至少一種異黃酮。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述至少一種異黃酮選自染料木素、黃豆香元和黃豆黃素o34.—種測(cè)定與轉(zhuǎn)基因作物相比的天然避難所區(qū)域的害蟲(chóng)的方法，該方法包^舌從轉(zhuǎn)基因作物附近誘捕害蟲(chóng)；篩選誘捕害蟲(chóng)存在的至少一種目標(biāo)植物的一種或多種指示物；和測(cè)定攝食轉(zhuǎn)基因作物以外植物的害蟲(chóng)種群百分比。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述指示物選自脂肪酸、生育酚、糖、黃酮類、生物堿、植物蛋白、遺傳標(biāo)記、礦物質(zhì)、其衍生物和它們的組合。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述指示物選自煙堿、降煙堿、可替寧、降可替寧和棉酚。37.權(quán)利要求34的方法，其中該方法還包括從采集到的害蟲(chóng)中采集至少一種組織；測(cè)定組織的脂肪酸特征；和將該組織的脂肪酸特征與已知在其生命周期內(nèi)攝食過(guò)目標(biāo)植物的害蟲(chóng)的脂肪酸特征進(jìn)行比較。38.權(quán)利要求34的方法，其中所述害蟲(chóng)是昆蟲(chóng)。全文摘要本發(fā)明提供一種測(cè)定動(dòng)物是否攝食過(guò)目標(biāo)植物的方法。該方法包括篩選動(dòng)物存在的目標(biāo)植物的至少一種指示物。文檔編號(hào)G01N33/50GK101351705SQ200680049961公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2006年11月1日優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日發(fā)明者G·P·赫德,J·T·格林普拉特,M·米爾科夫斯基,R·G·奧爾思,S·H·莫迪亞諾申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司