專利名稱：分離的與HLA－Cw*16分子復(fù)合的肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及免疫遺傳學(xué)和肽化學(xué)。更具體地說，它涉及以各種方式使用的肽，包括作為免疫原和作為HLA-Cw*16分子的配體使用。更具體地說，它涉及所謂的“腫瘤排斥抗原”，該抗原來自基因MAGE-6編碼的腫瘤排斥抗原前體，且由MHC類HLA-Cw*16分子提供。背景和現(xiàn)有技術(shù)目前已經(jīng)以許多不同的方式對(duì)宿主生物能否識(shí)別癌細(xì)胞進(jìn)行了研究。對(duì)這一領(lǐng)域的了解使得對(duì)基礎(chǔ)免疫學(xué)和癌癥學(xué)都有了一些了解。
對(duì)小鼠腫瘤的早期研究揭示了當(dāng)移植進(jìn)同源動(dòng)物時(shí)這些表現(xiàn)分子導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的排斥。這些分子在受體動(dòng)物中被T細(xì)胞“識(shí)別”并激發(fā)溶解移植細(xì)胞的溶胞性T細(xì)胞反應(yīng)。用諸如甲基膽蒽的化學(xué)致癌劑體外誘導(dǎo)的腫瘤首先獲得了這一證據(jù)。發(fā)現(xiàn)腫瘤表達(dá)的且誘導(dǎo)T-細(xì)胞反應(yīng)的抗原對(duì)于各腫瘤是不同的。參見Prehn等，國家癌癥研究所雜志，18769-778(1957)；Klein等，癌癥研究，201561-1572(1960)；Gross，癌癥研究，3326-333(1943)，Basombrio，癌癥研究，302458-2462(1970)關(guān)于用化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)腫瘤和細(xì)胞表面抗原差異的一般教導(dǎo)。這類抗原最后稱為“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTAs”。當(dāng)以化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)時(shí)觀察到存在該抗原后，經(jīng)紫外照射體外誘導(dǎo)腫瘤時(shí)可獲得相似的結(jié)果。參見Kripke，國家癌癥研究所雜志，53333-1336(1974)。
盡管對(duì)于上文所述的腫瘤類型觀察到了T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但據(jù)認(rèn)為自發(fā)腫瘤一般無免疫原性。因此據(jù)信在攜帶腫瘤的受試者中不存在激發(fā)與腫瘤反應(yīng)的抗原。參見，Hewitt等，英國癌癥雜志，33241-259(1976)。
存在tum-抗原家族的細(xì)胞系是經(jīng)過誘變小鼠腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系獲得的免疫原性變異體，如Boon等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1521184-1193(1980)，其公開內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引用。詳細(xì)來說，經(jīng)過突變?cè)谕葱∈笾胁划a(chǎn)生免疫反應(yīng)且形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞(即，“tum+”細(xì)胞)獲得tum-抗原。當(dāng)誘變這些tum+細(xì)胞時(shí)，它們受同源小鼠排斥且不能形成腫瘤(因此稱為“tum-”)。參見Boon等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，74272(1977)，其公開內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引用。已顯示許多腫瘤類型表現(xiàn)出這一表型。參見，例如，F(xiàn)rost等，癌癥研究，43125(1983)。
似乎tum-變異體不能形成進(jìn)行性腫瘤，因?yàn)樗鼈兤饎?dòng)免疫排斥過程。支持這一假說的證據(jù)包括腫瘤的“tum-”變異體，即正常情況下不形成腫瘤的變異體在免疫系統(tǒng)受亞致死輻射損傷的小鼠中形成腫瘤的能力，Van Pel等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，765282-5285(1979)；以及腹膜內(nèi)注射的肥大細(xì)胞瘤P815的tum-細(xì)胞指數(shù)繁殖12-15天且然后在中等流入量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在下僅僅幾天即被清除的觀察結(jié)果(Uyttenhove等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1521175-1183(1980))。進(jìn)一步的證據(jù)包括即使在細(xì)胞攻擊后施用免疫抑制量的輻射時(shí)，小鼠仍能獲得使其抗隨后針對(duì)相同tum-變異體的攻擊的免疫記憶的觀察結(jié)果(Boon等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，74272-275(1977)；Van Pel等，出處同上；Uyttenhove等，出處同上)。
隨后的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)自發(fā)腫瘤進(jìn)行誘變時(shí)，產(chǎn)生發(fā)生反應(yīng)的免疫原性變異體。事實(shí)上，這些變異體能誘導(dǎo)針對(duì)原發(fā)性腫瘤的免疫保護(hù)反應(yīng)。參見Van Pel等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1571992-2001(1983)。因此，已表明可在作為同源排斥反應(yīng)靶的腫瘤中誘導(dǎo)提供所謂的“腫瘤排斥抗原”。當(dāng)將外源基因轉(zhuǎn)染進(jìn)自發(fā)腫瘤時(shí)已獲得了相似的結(jié)果。在這方面，參見Fearon等，癌癥研究，482975-1980(1988)。
已識(shí)別了一類抗原，它存在于腫瘤細(xì)胞的表面，且被溶細(xì)胞的T細(xì)胞識(shí)別，導(dǎo)致溶解。這類抗原稱為“腫瘤排斥抗原”或下文稱為“TRAs”。TRAs可以或不能誘導(dǎo)抗體反應(yīng)。經(jīng)過體外溶細(xì)胞的T細(xì)胞鑒定研究，即以特定溶細(xì)胞的T細(xì)胞(下文稱為“CTL”)亞類鑒定抗原的研究已研究了這些抗原的誘導(dǎo)程度。當(dāng)識(shí)別存在的腫瘤排斥抗原時(shí)，該亞類增殖，且存在腫瘤排斥抗原的細(xì)胞溶解。鑒定研究已鑒定了特異性溶解表達(dá)腫瘤排斥抗原的細(xì)胞的CTL克隆。這類研究的例子可參見Levy等，癌癥研究進(jìn)展，241-59(1977)；Boon等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1521184-1193(1980)；Brunner等，免疫學(xué)雜志，1241627-1634(1980)；Maryanski等，歐洲免疫學(xué)雜志，1241627-1634(1980)；Maryanski等，歐洲免疫學(xué)雜志，12406-412(1982)；Palladino等，癌癥研究，475074-5079(1987)。這類分析對(duì)于CTLs識(shí)別的其它類抗原是必需的，包括次要組織相容性抗原，雄性特異性H-Y抗原，和稱為“tum-”抗原且在本文中討論的這類抗原。
上文所述的受試者的腫瘤例子稱為P815。參見DePlaen等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，852274-2278(1988)；Szikora等，EMBO雜志，91041-1050(1990)，和Sibille等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，17235-45(1990)，其公開內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引用。P815腫瘤是在DBA/2小鼠中用甲基膽蒽誘導(dǎo)且作為體外腫瘤及細(xì)胞系培養(yǎng)的肥大細(xì)胞瘤。P815細(xì)胞系經(jīng)誘變后已產(chǎn)生了許多tum-變異體，包括稱為P91A(DePlaen，出處同上)，35B(Szikora，出處同上)，和P198(Sibille，出處同上)的變異體。與腫瘤排斥抗原相反(且它是關(guān)鍵性區(qū)別)，腫瘤細(xì)胞僅在誘變后存在tum-抗原。腫瘤排斥抗原存在于未經(jīng)誘變的給定腫瘤的細(xì)胞上。因此，根據(jù)參考文獻(xiàn)，細(xì)胞系可以是tum+，例如稱為“P1”的細(xì)胞系，且可以被激發(fā)產(chǎn)生tum-變異體。由于tum-表型不同于親本細(xì)胞系，人們預(yù)期tum-細(xì)胞系與其tum+親本細(xì)胞系相比DNA有區(qū)別，且該區(qū)別可用于定位tum+細(xì)胞中感興趣的基因。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)諸如P91A，35B和P198的tum-變異體的基因與其正常等位基因的區(qū)別在于該基因編碼區(qū)的點(diǎn)突變。參見Szikora和Sibille，出處同上，和Lurquin等，細(xì)胞，58293-303(1989)。用本發(fā)明的TRAs證實(shí)事實(shí)并非如此。這些論文還證實(shí)來自tum-抗原的肽由Ld分子提供用于被CTLs識(shí)別。P91A由Ld提供，P35由Dd提供且P198由Kd提供。
轉(zhuǎn)讓給與本申請(qǐng)相同的受讓人的1992年5月22日申請(qǐng)的PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354教導(dǎo)了一個(gè)編碼人腫瘤排斥抗原前體的基因家族，稱為MAGE家族。一些這類基因也在Van der Bruggen等，科學(xué)，2541643(1991)中討論?，F(xiàn)在已清楚MAGE家族的各種基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，且可用作診斷這些腫瘤的標(biāo)記，以及用于本文討論的其它目的。也參見Traversari等，免疫遺傳學(xué)，35145(1992)；vander Bruggen等，科學(xué)，2541643(1991)和De Plaen等，免疫遺傳學(xué)，40360(1994)?，F(xiàn)在已相當(dāng)充分地證實(shí)了蛋白質(zhì)加工并出現(xiàn)在細(xì)胞表面的機(jī)制。本領(lǐng)域進(jìn)展的綜述可參見Barinaga，“獲得一些‘骨架’MHC如何結(jié)合肽”，科學(xué)257880(1992)；也參見Fremont等，科學(xué)，257919(1992)；Matsumura等，科學(xué)257927(1992)；Latron等，科學(xué)，257964(1992)。這些論文總的來說表明結(jié)合MHC/HLA分子的肽需要9個(gè)氨基酸長(一個(gè)“九肽”)，且表明了該九肽的第一個(gè)和第九個(gè)殘基的重要性。
對(duì)MAGE基因家族的研究現(xiàn)在已揭示了特定的九肽事實(shí)上存在于一些腫瘤細(xì)胞的表面且九肽的存在需要存在HLA-A1分子。MAGE-1腫瘤排斥抗原復(fù)合物(“TRA”或“九肽”)導(dǎo)致存在該復(fù)合物的細(xì)胞被溶細(xì)胞的T細(xì)胞(“CTLs”)溶解。
應(yīng)注意的是，例如，Melief等的申請(qǐng)系列號(hào)08/217,188，Traversari等的系列號(hào)08/217,187，和Townsend等的系列號(hào)08/217,186均提供了對(duì)其它來自MAGE的肽的研究。
在例如，1992年8月31日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)07/938,334中和在1993年7月7日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)073,103中提供的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)比較各種MAGE基因同源區(qū)與編碼相關(guān)九肽的MAGE-1基因區(qū)域時(shí)，有很大的同源性。事實(shí)上，這些觀察導(dǎo)致本文中所公開的并在權(quán)利要求中所要求的本發(fā)明的一個(gè)方面，它是一個(gè)九肽家族，其中均具有相同的N末端和C末端氨基酸。這些九肽描述為單獨(dú)或與載體肽偶聯(lián)用于各種目的，包括其用作免疫原。九肽具有構(gòu)成抗原表位的足夠大小，對(duì)其產(chǎn)生的抗體描述為單獨(dú)或作為更大多肽的一部分用于鑒定九肽。
人主要組織相容性復(fù)合物(MHC)系統(tǒng)是一個(gè)相關(guān)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的一個(gè)特征是人白細(xì)胞抗原，或“HLA”。人細(xì)胞可根據(jù)其HLA特征進(jìn)行“分類”。不是所有的細(xì)胞均存在所有類型的HLA分子。該系統(tǒng)的多樣性可參見，例如，Zemmour等，免疫遺傳學(xué)，37239-250(1993)。該參考文獻(xiàn)表明，到1992年為止，本領(lǐng)域已知確實(shí)有幾十個(gè)不同的HLA等位基因。其公開內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引用的Cianetti等，免疫遺傳學(xué)，2980-91(1989)特別公開了一種MHC等位基因，文中稱為HLA-C-克隆10。該等位基因后來被重新命名，如作為參考文獻(xiàn)引用的Bodmer等，組織抗原，441-18(1994)。該等位基因現(xiàn)在稱為HLA-Cw*1601。一個(gè)相關(guān)的等位基因，即，HLA-Cw*1602，也是已知的。參見也作為參考文獻(xiàn)引用的Bodmer等，出處同上；Vilches等，人類免疫學(xué)，41167-170(1994)。當(dāng)一起討論時(shí)，這兩個(gè)等位基因稱為“HLA-Cw*16”。作為參考文獻(xiàn)引用的Van derBruggen等，歐洲免疫學(xué)雜志，242134-2140(1994)教導(dǎo)了溶細(xì)胞的T細(xì)胞(“CTLs”)識(shí)別肽與HLA-Cw*1601分子的復(fù)合物。這些數(shù)據(jù)也在現(xiàn)在已批準(zhǔn)并作為參考文獻(xiàn)引用的，1993年6月17日申請(qǐng)的共同未決的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)08/79,110中和在作為參考文獻(xiàn)引用的1994年2月15日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)08/196,630中公開。這兩份申請(qǐng)均轉(zhuǎn)讓給了本申請(qǐng)的受讓人。這兩份申請(qǐng)公開了稱為“BAGE”的腫瘤排斥抗原前體被加工成HLA-Cw*1601分子提供的肽。具體地說，該申請(qǐng)公開了一個(gè)優(yōu)選的九肽Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu(SEQ ID NO1)它與HLA-Cw*1601復(fù)合，從而刺激細(xì)胞系CTL82/82。
作為參考文獻(xiàn)引用的美國專利號(hào)5,342,774公開了一個(gè)相關(guān)的核酸分子家族，它編碼稱為MAGE腫瘤排斥抗原前體的腫瘤排斥抗原前體。這些“TRAPs”編號(hào)為MAGE-1，MAGE-2等。一般來說，它們主要在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，正常的睪丸細(xì)胞大多數(shù)例外，它們被加工成由諸如HLA-A1，HLA-A2等各種HLA分子提供的肽。參見，例如，作為參考文獻(xiàn)引用的美國專利號(hào)5,405,940。
不是所有的腫瘤細(xì)胞均表達(dá)全部MAGE TRAPs。因此，盡管本領(lǐng)域需要關(guān)于確實(shí)能刺激T細(xì)胞的肽與HLA分子的特定復(fù)合物的可用信息，但并不總是很有把握。人們需要細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)所需的MHC分子和所需的TRAP分子，且具有將大型TRAP分子加工成更小的腫瘤排斥抗原或“TRA”。即使當(dāng)特定的肽與MHC分子結(jié)合形成復(fù)合物，這本身并不保證該復(fù)合物會(huì)刺激CTL增生。換句話說，盡管肽和MHC的結(jié)合足以鑒定細(xì)胞上的MHC表型，但該結(jié)合只是必須的，不足以激發(fā)CTL增生。
然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了MAGE-6基因編碼的TRAP被加工成與HLA-Cw*16型MHC分子結(jié)合且由此也激發(fā)CTLs增生的TRAs。因此，本發(fā)明特別是涉及這些肽及其各種用途，并將在下面的說明書中進(jìn)行解釋。附圖的簡要描述

圖1提供的數(shù)據(jù)顯示了溶細(xì)胞的T細(xì)胞系CTL82/21溶解細(xì)胞系MZ2-MEL.43和MZ2-MEL.3.0，但不溶解細(xì)胞系MZ2-MEL.3.1，也不溶解天然殺傷細(xì)胞系K562。
圖2描述了測(cè)定轉(zhuǎn)染的，共同轉(zhuǎn)染的，和未轉(zhuǎn)染的各種細(xì)胞系是否刺激CTL82/21的TNF釋放的試驗(yàn)結(jié)果。
圖3顯示了使用來自SEQ ID NO2的肽的溶解試驗(yàn)的結(jié)果。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)施例1以前的工作，例如，作為參考文獻(xiàn)引用的Van den Eynde等，國際癌癥雜志，44634-640(1989)已顯示人黑色素瘤細(xì)胞存在被溶細(xì)胞的T細(xì)胞系(下文稱為“CTLs”)識(shí)別的多種抗原。4個(gè)這類抗原被Van den Eynde等，出處同上，稱為MZ2-B，D，E和F。一個(gè)這種CTL被稱為MZ2-CTL 82/21，且將它用于下面的實(shí)驗(yàn)。
一個(gè)熟知的黑色素瘤細(xì)胞系是MZ2-MEL，它來自腹部轉(zhuǎn)移瘤。然后對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行限制稀釋以產(chǎn)生亞細(xì)胞系MZ2-MEL.3.0。隨后培養(yǎng)該亞細(xì)胞系超過150代以產(chǎn)生亞細(xì)胞系MZ2-MEL.3.1。經(jīng)過對(duì)MZ2-MEL.3.0進(jìn)行誘變并然后限制稀釋來制備另一亞細(xì)胞系MZ2-MEL.43。參見Herin等，國際癌癥雜志，39390-396(1987)；Van den Eynde出處同上。然后將這三個(gè)細(xì)胞系MZ2-MEL.3.0，MZ2-MEL.3.1，和MZ2-MEL.43與殺傷細(xì)胞系K562一起用于51Cr釋放試驗(yàn)，該試驗(yàn)使用上述CTL82/21并按Traversari等，免疫遺傳學(xué)，35145-152(1992)和Boon等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1521184-1193(1980)進(jìn)行。
顯示于圖1的結(jié)果特別表明MZ2-MEL.3.1喪失CTL82/21靶向的抗原，但該抗原在MZ2-MEL.3.0和MZ2-MEL.43上均有發(fā)現(xiàn)。根據(jù)Van der Bruggen等，歐洲免疫學(xué)雜志，242134-2140(1994)的分析揭示該細(xì)胞系喪失編碼HLA-A29，HLA-B44和HLA-Cw*1601的基因，這將其與MZ2-MEL.3.0和MZ2-MEL.3.1區(qū)分開來。這得出的結(jié)論是這三個(gè)所列的MHC分子之一負(fù)責(zé)提供與MHC分子組合并導(dǎo)致被CTL82/21識(shí)別的肽。實(shí)施例2以前已經(jīng)分離了編碼HLA-Cw*1601的cDNA序列，可參見作為參考文獻(xiàn)引用的van der Bruggen等，歐洲免疫學(xué)雜志，242134-2140(1994)。已知不能表達(dá)HLA-Cw*1601的細(xì)胞系是已知并可獲得的，即，MZ2-MEL.2.2.5。也已知該細(xì)胞系不能表達(dá)MAGE-1(MZ2-MEL.2.2.5是表達(dá)MAGE-1的MZ2-MEL.2.2的一個(gè)亞細(xì)胞系)。MZ2 MEL-2.2.5表達(dá)MAGE-2，3，6和12。因此，它是用于測(cè)定HLA-Cw*1601與肽組合是否能激發(fā)被溶細(xì)胞的T細(xì)胞CTL82/21溶解的合適細(xì)胞系。
根據(jù)van der Bruggen等，歐洲免疫學(xué)雜志，242134-2140(1994)將HLA-Cw*1601 cDNA插入質(zhì)粒pcDSRα。經(jīng)過EcoRI位點(diǎn)將MAGE-1 cDNA插入質(zhì)粒pcDNAI。因此構(gòu)建了兩個(gè)不同的質(zhì)粒。根據(jù)van der Bruggen等，科學(xué)，2541634(1991)的磷酸鈣方法將這兩個(gè)質(zhì)粒與賦予G418抗性的質(zhì)粒(即，pSVtkneo8)一起共同轉(zhuǎn)染進(jìn)MZ2-MEL.2.2.5。
首先選擇轉(zhuǎn)染子對(duì)G418的抗性，然后，經(jīng)過按Traversari等，免疫遺傳學(xué)，35145-152(1992)測(cè)定它們是否刺激TNF生產(chǎn)，用CTL81/21來試驗(yàn)MAGE-1和HLA-Cw*1601的表達(dá)。簡單來說，將1500CTLs加入補(bǔ)充了10％人血清和25U/ml重組人IL-2的100ulIscove’s培養(yǎng)基中。將該混合物與轉(zhuǎn)染的MZ-MEL.2.2.5細(xì)胞組合，培養(yǎng)24小時(shí)，然后，收集上清。在Hansen等，免疫學(xué)方法雜志，119203-21-(1989)；Traversari等，免疫遺傳學(xué)，35145-152(1992)所述的MTT比色試驗(yàn)中，按Espevik等，免疫學(xué)方法雜志，9599-105(1986)所述經(jīng)過試驗(yàn)對(duì)WEHI-164克隆13細(xì)胞的細(xì)胞毒性來測(cè)定TNF含量。
圖2中的前三條線段顯示了這些結(jié)果，使用細(xì)胞系MZ2-MEL.43和MZ-MEL.3.1作為對(duì)照。MZ2-2.2.5的轉(zhuǎn)染清楚地導(dǎo)致刺激CTL82/21。然而，從該研究還不清楚MAGE-1是否對(duì)刺激是必須的。實(shí)施例3為了證實(shí)實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，以Brichard等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，178489-495(1993)；Coulie等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，18035-42(1994)；Seed等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，843365-3369(1987)的DEAE-葡聚糖氯奎方法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，并以試驗(yàn)MZ2-MEL.2.2.5細(xì)胞相同的方式進(jìn)行試驗(yàn)。除MAGE-1外，還使用編碼其它TRAP的cDNA，包括MAGE-2，3，4和12，BAGE，Melan-A，酪氨酸酶，和GAGE-1，2，3，4，5和6。如上文所述，MZ2-MEL.2.2.5天然表達(dá)MAGE-2，3，6和12，且被轉(zhuǎn)染以表達(dá)MAGE-1。這兩組實(shí)驗(yàn)之間的一個(gè)區(qū)別是在MZ2-MEL.2.2.5細(xì)胞系中存在MAGE-6。實(shí)施例4在實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)之后，從MZ2-MEL.43制備cDNA文庫并使用標(biāo)準(zhǔn)方法插入pCDSRα。使用上文實(shí)施例2的方法學(xué)將該文庫與在pCDSRα中含HLA-Cw*1601的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染進(jìn)COS細(xì)胞，然后也按上文所述試驗(yàn)TNF釋放。獲得了兩個(gè)陽性克隆。使用熟知的方法將陽性克隆的質(zhì)粒DNA電穿孔進(jìn)細(xì)菌(大腸桿菌DH5α)。
鑒定陽性克隆后，提取質(zhì)粒DNA，并將大約1/3與HLA-Cw*1601構(gòu)建體一起轉(zhuǎn)染進(jìn)COS-7細(xì)胞。克隆GEP 3/317 2/B7獲得被CTL82/21識(shí)別的特征。測(cè)序時(shí)，該克隆被鑒定為MAGE-6，如作為參考文獻(xiàn)引用的DePlaen等，免疫遺傳學(xué)，40360-369(1994)中所述。SEQ ID NO2提供了該序列。實(shí)施例5MAGE-6被鑒定為TRAP，它被加工成所提供的肽，為測(cè)定有關(guān)的具體肽進(jìn)行了研究。
為此，使用了PCR引物GACCAGAGTC ATCATGCCTCT(SEQ IN NO3)和TCCTCCACTG ATCTTTACC (SEQ ID NO4)它們分別是有意義和反義引物，相應(yīng)于SEQ ID NO2 MAGE-6 cDNA的核苷酸147-167和1029-1047。
對(duì)克隆GEP 3/317 2/B7進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在94℃處理4分鐘后，進(jìn)行20輪PCR循環(huán)(1個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，60℃2分鐘和72℃2分鐘)，隨后在72℃進(jìn)行15分鐘。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法將PCR產(chǎn)物插入質(zhì)粒pCR3，并轉(zhuǎn)染進(jìn)COS-7。所得的轉(zhuǎn)染子不編碼該抗原。
當(dāng)經(jīng)過序列分析比較截短形式與“基礎(chǔ)克隆”，即GEP 3/317 2B/7時(shí)，注意到PCR產(chǎn)物由ORF的核苷酸147至1047組成，而基礎(chǔ)克隆由核苷酸160-1104組成，表明該抗原肽必須具有核苷酸1047-1104上的C-末端。
根據(jù)該假說，構(gòu)建了一系列肽，并在試驗(yàn)前凍干。凍干的肽溶于1體積的DMSO中，然后溶于加有10mM乙酸的9體積水中。由此稀釋的肽貯存于-20℃。
經(jīng)過Boon等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1521184-1193(1980)的51Cr釋放方法試驗(yàn)肽刺激CTLs溶解的能力。具體地說，37℃下51Cr標(biāo)記HLA-Cw*1601陽性類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系，即LB678-EBV 1小時(shí)并充分洗滌。然后，在各種濃度的肽存在下，在96孔微量平板中，室溫下培養(yǎng)1000個(gè)靶細(xì)胞15分鐘。然后加入CTLs，4小時(shí)后在37℃下測(cè)量51Cr釋放。
用肽Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu(SEQ ID NO5)首先出現(xiàn)溶解，該肽相應(yīng)于MAGE-6的氨基酸126-137。也試驗(yàn)了更短的肽，發(fā)現(xiàn)由SEQ ID NO5氨基酸2-10組成的九肽在30nM的肽濃度下實(shí)現(xiàn)一半的最大溶解。參見圖3。
該九肽相應(yīng)于在MAGE-3中所發(fā)現(xiàn)的序列，除了一個(gè)例外，即，該九肽的Arg在MAGE-3中是His。合成并試驗(yàn)了相應(yīng)于MAGE-3序列的九肽，但發(fā)現(xiàn)不刺激溶解。同樣，當(dāng)試驗(yàn)由SEQ ID NO5的氨基酸1-9，和SEQ ID NO5的氨基酸3-10組成的肽時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們都不刺激溶解。
因此，與HLA-Cw*1601結(jié)合的肽可限定為Ile是相對(duì)于Tyr的N-末端的肽，這兩個(gè)殘基被7個(gè)氨基酸分開。這些間隔氨基酸的第5個(gè)必須是Arg，Ile不一定是該肽的N-末端，Tyr也不一定是C-末端，因?yàn)槿缟衔乃觯琒EQ ID NO4的肽也結(jié)合HLA-Cw*1601并激發(fā)被溶細(xì)胞的T細(xì)胞溶解。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是具有通式NH2-Xaa Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2TyrXaa-COOH(SEQ ID NO6)的分離的肽，其中N末端Xaa和C末端Xaa是總共從0到3個(gè)氨基酸，并且可以是任意氨基酸。特別優(yōu)選的是諸如SEQ ID NO5的分子，其中N-末端Xaa是一個(gè)氨基酸，C-末端Xaa是兩個(gè)氨基酸。還優(yōu)選的是不存在NH2-Xaa和Xaa-COOH的分子，如由SEQ ID NO5的氨基酸2-10限定的肽。這些肽是與諸如HLA-Cw*1601和HLA-Cw*1602的HLA-Cw*16型MHC分子結(jié)合的肽，且優(yōu)選因此特異性地激發(fā)被CTLs溶解。因此，經(jīng)過使用這些肽，包括帶有可檢測(cè)的信號(hào)標(biāo)記的肽可鑒定存在HLA-Cw*16的細(xì)胞。如果該肽以足夠復(fù)合細(xì)胞表面的HLA-Cw*16分子的量存在，那么該肽也可用于激發(fā)存在HLA-Cw*1601的細(xì)胞的溶解。經(jīng)過例如，將細(xì)胞與肽接觸，或用編碼HLA-Cw*16和MAGE-6的一種核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞可做到這點(diǎn)。其中任一或兩種核酸分子可以是gDNA或cDNA。
關(guān)于HLA-C分子的結(jié)合基序已做了一些工作，盡管并沒有取得象HLA-A分子一樣的進(jìn)展。參見，例如，F(xiàn)alk等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)9012005-12009(1993)，和Ramensee等，免疫遺傳學(xué)41178-228(1995)，兩篇文獻(xiàn)均作為參考文獻(xiàn)引用。這些參考文獻(xiàn)，特別是Falk的文獻(xiàn)表明，對(duì)于結(jié)合HLA-C分子的九聚體，位置3，5和6是重要的。因此，參考SEQ ID NO6，特別優(yōu)選的是沒有NH2-Xaa和Xaa-COOH的分子，其中，產(chǎn)生下面通式Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr(SEQ ID NO7)，其中在(Xaa)4內(nèi)，第二個(gè)氨基酸是Gly，和/或第4個(gè)氨基酸是Pro。特別優(yōu)選的是(Xaa)4中第二個(gè)Xaa是Gly，且(Xaa)4中第4個(gè)氨基酸是Pro的九肽。所有其它殘基可以是任意其它氨基酸。
與本發(fā)明的這一方面相聯(lián)系，應(yīng)注意SEQ ID NO2中所述的MAGE-6 cDNA的核苷酸1047至1104至少編碼有關(guān)腫瘤排斥抗原的C-末端。測(cè)定SEQ ID NO5抗原肽的位置開始于SEQ ID NO2的核苷酸1033。因此，本發(fā)明的另一方面是由SEQ ID NO2的核苷酸1033到1104組成的分離的核酸分子。該序列可單獨(dú)用作，例如，測(cè)定MAGE-6表達(dá)的探針，或可用于與啟動(dòng)子有效連接的表達(dá)載體以表達(dá)相關(guān)腫瘤排斥抗原。用該核酸分子單獨(dú)或與編碼HLA-Cw*16的核酸分子結(jié)合轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也是本發(fā)明的一個(gè)特征。
TRA的鑒定和其復(fù)合MHC分子的鑒定使得可以形成一種治療方法，用于治療具有以表達(dá)HLA-Cw*16分子為特征的疾病的受試者，如當(dāng)提供TRA時(shí)的SEQ ID NO5，或作為TRA與HLA的復(fù)合物，如HLA-Cw*16，可與諸如佐劑的物質(zhì)結(jié)合以產(chǎn)生疫苗用于治療以表達(dá)TRAP分子為特征的疾病。另外，可從在其表面存在TRA/HLA復(fù)合物的細(xì)胞，如非增生性癌細(xì)胞，非增生性轉(zhuǎn)染子等制備疫苗。在細(xì)胞被用作疫苗的所有情況下，它們可以是用證實(shí)CTL反應(yīng)所必須的一種或兩種成分的編碼序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或是表達(dá)兩種分子的未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。而且，使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可將MAGE-6分子，其相關(guān)TRAs，如本文所公開的那些以及TRA和HLA的復(fù)合物用于生產(chǎn)抗體。
本文使用的“疾病”是指表達(dá)腫瘤排斥抗原前體的任何病理狀態(tài)。這類疾病的例子是癌癥，特別是黑色素瘤。
根據(jù)本說明書的治療方案以受試者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)為前提，導(dǎo)致存在TRA的細(xì)胞，如存在HLA-Cw*16的細(xì)胞溶解。一個(gè)這種方案是給具有所述異常細(xì)胞表型的受試者施用對(duì)該復(fù)合物具有特異性的CTLs。體外產(chǎn)生該CTLs在技術(shù)人員所掌握的技術(shù)范圍內(nèi)。具體地說，將諸如血細(xì)胞的細(xì)胞樣品與存在該復(fù)合物并能激發(fā)特定CTL增生的細(xì)胞接觸。該靶細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)染子，如上文所述類型的COS細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)染子在其表面存在所需的復(fù)合物，且當(dāng)與感興趣的CTL結(jié)合時(shí)，刺激其增生。COS細(xì)胞，如本文所用的那些細(xì)胞可廣泛獲得，與其它合適的宿主細(xì)胞一樣。
為了更詳細(xì)地描述稱為過繼轉(zhuǎn)移的治療方法(Greenberg，免疫學(xué)雜志，136(5)1917(1986)；Reddel等，科學(xué)257238(7-10-92)；Lynch等，歐洲免疫學(xué)雜志，211403-1410(1991)；Kast等，細(xì)胞，59603-614(11-17-89))，存在所需復(fù)合物的細(xì)胞與CTLs結(jié)合導(dǎo)致對(duì)其特異性的CTLs增生。然后將增生的CTLs施用給具有其特征在于某些異常細(xì)胞存在特定復(fù)合物的細(xì)胞異常的受試者。然后CTLs溶解異常細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)所需的治療目的。
上述療法假定至少一些受試者的異常細(xì)胞存在相關(guān)的HLA/TRA復(fù)合物。這很容易測(cè)定，因?yàn)楸绢I(lǐng)域?qū)τ阼b定存在特定HLA分子的細(xì)胞以及如何鑒定表達(dá)有關(guān)序列(在本例中是MAGE-6序列)的DNA的細(xì)胞是非常熟悉的。一旦經(jīng)過上述篩選方法鑒定了存在相關(guān)復(fù)合物的細(xì)胞，它們可與來自病人的樣品結(jié)合，其中，該樣品含有CTLs。如果存在該復(fù)合物的細(xì)胞被混合的CTL樣品溶解，那么可假定存在BAGE產(chǎn)生的腫瘤排斥抗原，且該受試者是上述治療方案的合適的候選人。
過繼轉(zhuǎn)移不是根據(jù)本發(fā)明可用的療法的唯一形式。使用許多方法也可在體內(nèi)激發(fā)CTLs。一種方法，即，使用表達(dá)該復(fù)合物的非增生性細(xì)胞已在上文進(jìn)行了描述。用于該方法的細(xì)胞可以是正常情況下表達(dá)該復(fù)合物的那些細(xì)胞，如輻射過的黑色素瘤細(xì)胞或用一種或兩種對(duì)提供該復(fù)合物所必需的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。Chen等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，88110-114(1991年1月)例證了該方法，顯示了在治療方案中使用表達(dá)HPVE7肽的轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？墒褂酶鞣N細(xì)胞類型。同樣，可使用攜帶一種或兩種感興趣的基因的載體。特別優(yōu)選病毒和細(xì)菌載體。在這些系統(tǒng)中感興趣的基因被，例如，牛痘病毒或細(xì)菌BCG攜帶且事實(shí)上用該材料“感染”宿主細(xì)胞。所得的細(xì)胞存在感興趣的復(fù)合物并被自體CTLs識(shí)別，然后增生。經(jīng)過將腫瘤排斥抗原或其前體與佐劑結(jié)合以幫助摻入存在感興趣的HLA分子的提供HLA-Cw*16的細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)相似的效果。TRAP被加工以產(chǎn)生HLA分子的肽配偶體，而TRA的存在不需進(jìn)一步加工。
本發(fā)明的其它方面對(duì)技術(shù)人員來說是顯而易見的，且在此不必重復(fù)。
已采用的術(shù)語和表達(dá)用作描述術(shù)語而不是限定，且并不打算用這些術(shù)語和表達(dá)來排除所示和所述特征的任何等價(jià)物或其部分，因?yàn)閼?yīng)認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明范圍內(nèi)作出各種修飾是可能的。(1)一般信息(i)申請(qǐng)人van der Bruggen，Pierre；DePlaenEtienne；Boon-Falleur，Thierry(ii)發(fā)明名稱分離的與HLA-Cw*16分子復(fù)合的的肽及其用途(iii)序列數(shù)9(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約城(D)州紐約州(F)郵編10022(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型3.5英寸軟盤，360kb存儲(chǔ)量(B)計(jì)算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)最近申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(vi)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/713,354(B)申請(qǐng)日1996年9月13日(C)分類435(viii)律師/代理人信息；(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號(hào)30，946(C)參考/文摘號(hào)LUD 5460-PCT(ix)電信信息(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884(2)序列鑒定號(hào)1的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu5(2)序列鑒定號(hào)2的信息(i)序列特征(A)長度1375個(gè)核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO2GCCGGCCCAG GCTCGGTGAG GAGGCAAGGT TCTGAGGGGA CAGGCTGACC TGGAGGACCA 60GAGGCCCCCG GAGGAGCACT GAAGGAGAAG ATCTGCCAGT GGGTCTCCAT TGCCCAGCTC 120CTGCCCACAC TCCCGCCTGT TGCCCTGACC AGAGTCATCA TGCCTCTTGA GCAGAGGAGT 180CAGCACTGCA AGCCTGAAGA AGGCCTTGAG GCCCGAGGAG AGGCCCTGGG CCTGGTGGGT 240GCGCAGGCTC CTGCTACTGA GGAGCAGGAG GCTGCCTCCT CCTCTTCTAC TCTAGTTGAA 300GTCACCCTGG GGGAGGTGCC TGCTGCCGAG TCACCAGATC CTCCCCAGAG TCCTCAGGGA 360GCCTCCAGCC TCCCCACTAC CATGAACTAC CCTCTCTGGA GCCAATCCTA TGAGGACTCC 420AGCAACCAAG AAGAGGAGGG GCCAAGCACC TTCCCTGACC TGGAGTCTGA GTTCCAAGCA 480GCACTCAGTA GGAAGGTGGC CAAGTTGGTT CATTTTCTGC TCCTCAAGTA TCGAGCCAGG 540GAGCCGGTCA CAAAGGCAGA AATGCTGGGG AGTGTCGTCG GAAATTGGCA GTACTTCTTT 600CCTGTGATCT TCAGCAAAGC TTCCGATTCC TTGCAGCTGG TCTTTGGCAT CGAGCTGATG 660GAAGTGGACC CCATCGGCCA CGTGTACATC TTTGCCACCT GCCTGGGCCT CTCCTACGAT 720GGCCTGCTGG GTGACAATCA GATCATGCCC AAGACAGGCT TCCTGATAAT CATCCTGGCC 780ATAATCGCAA AAGAGGGCGA CTGTGCCCCT GAGGAGAAAA TCTGGGAGGA GCTGAGTGTG 840TTAGAGGTGT TTGAGGGGAG GGAAGACAGT ATCTTCGGGG ATCCCAAGAA GCTGCTCACC 900CAATATTTCG TGCAGGAAAA CTACCTGGAG TACCGGCAGG TCCCCGGCAG TGATCCTGCA 960TGCTATGAGT TCCTGTGGGG TCCAAGGGCC CTCATTGAAA CCAGCTATGT GAAAGTCCTG 1020CACCATATGG TAAAGATCAG TGGAGGACCT CGCATTTCCT ACCCACTCCT GCATGAGTGG 1080GCTTTGAGAG AGGGGGAAGA GTGAGTCTGA GCACGAGTTG CAGCCAGGGC CAGTGGGAGG 1140CGGTTTGGGC CAGTGCACCT TCCGGGGCCC CATCCCTTAG TTTCCACTGC CTCCTGTGAC 1200GTGAGGCCCA TTCTTCACTC TTTGAAGCGA GCAGTCAGCA TTCTTAGTAG TGGGTTTCTG 1260TTCTGTTGGA TGACTTTGAG ATTATTCTTT GTTTCCTGTT GGAGTTGTTC AAATGTTCCT 1320TTTAACGGAT GGTTGAATGA GCGTCAGCAT CCAGGTTTAT GAATGACAGT AGTCA 1375(2)序列鑒定號(hào)3的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO3GACCAGAGTC ATCATGCCTC T 21(2)序列鑒定號(hào)4的信息(i)序列特征(A)長度19個(gè)核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO4TCCTCCACTG ATCTTTACC19(2)序列鑒定號(hào)5的信息(i)序列特征(A)長度12個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO5Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu5 10(2)序列鑒定號(hào)6的信息(i)序列特征(A)長度15個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ix)特征(D)其它信息每個(gè)Xaa可以是任意氨基酸。一個(gè)、兩個(gè)或所有N-末端和C-末端可以沒有Xaa。
(xi)序列描述SEQ ID NO6xaa xaa Xaa Ile xaa xaa xaa xaa Arg xaa xaa Tyr xaa xaa xaa5 10 15(2)序列鑒定號(hào)7的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ix)特征(D)其它信息每個(gè)Xaa可以是任意氨基酸。
(xi)序列描述SEQ ID NO7Ila Xaa Gly xaa Pro Arg Xaa Xaa Tyr5(2)序列鑒定號(hào)8的信息(i)序列特征
(A)長度9個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr5(2)序列鑒定號(hào)9的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(xi)序列描述SEQ ID NO9Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr5 10
權(quán)利要求
1.由氨基酸序列Xaa Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr Xaa組成的分離的肽，其中第1個(gè)Xaa是0-3個(gè)氨基酸長，第4個(gè)Xaa是0-2個(gè)氨基酸長，且第1個(gè)和第4個(gè)Xaa總共不超過3個(gè)氨基酸長，各Xaa是任意氨基酸，且所述肽與HLA-Cw16分子結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，由氨基酸序列Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr組成。
3.權(quán)利要求1的分離的肽，具有通式Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr，其中(Xaa)4中第2個(gè)Xaa是Gly。
4.權(quán)利要求1的分離的肽，具有通式Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr，其中(Xaa)4中第4個(gè)Xaa是Pro。
5.權(quán)利要求1的分離的肽，具有通式Ile Xaa Gly Xaa ProArg(Xaa)2Tyr。
6.權(quán)利要求2的分離的肽，其中所述的肽是Ile Ser Gly GlyPro Arg Ile Ser Tyr。
7.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述的肽是Lys Ile Ser GlyGly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu。
8.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述的肽是Lys Ile Ser GlyGly Pro Arg Ile Ser Tyr。
9.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述的HLA-Cw16分子是HLA-Cw*1601。
10.激發(fā)對(duì)肽與HLA-Cw16分子復(fù)合物具有特異性的溶細(xì)胞的T細(xì)胞增生的方法，包括在有利于T細(xì)胞識(shí)別所述的復(fù)合物且隨后增生的條件下將含有T細(xì)胞的樣品與在其表面存在HLA-Cw16分子和權(quán)利要求1的肽的復(fù)合物的細(xì)胞接觸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的細(xì)胞是天然存在的人細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述的細(xì)胞是用編碼HLA-Cw16分子的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述的細(xì)胞是用編碼至少部分MAGE-6腫瘤排斥抗原前體的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述的部分至少編碼通式Xaa Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr Xaa的肽，其中第1個(gè)Xaa是0-3個(gè)氨基酸長，第4個(gè)Xaa是0-2個(gè)氨基酸長，各Xaa是任意氨基酸，且第1個(gè)和第4個(gè)Xaa總共不超過3個(gè)氨基酸長。
15.由MAGE-6的cDNA的核苷酸1033至1104組成的分離的核酸分子。
16.包含有效連接到啟動(dòng)子上的權(quán)利要求15的分離的核酸分子的表達(dá)載體。
17.用權(quán)利要求16的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定與HLA－Cw
文檔編號(hào)C07H21/00GK1241945SQ97197915
公開日2000年1月19日 申請(qǐng)日期1997年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月27日
發(fā)明者皮埃爾·范德布魯根, 艾蒂安·德普萊恩, 蒂埃里·布恩法勒爾 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所