專利名稱：適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法，屬農(nóng)藥快速檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)外研究的快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附分析法、酶片法(速測(cè)卡法)、農(nóng)藥殘留分光光度計(jì)法和生物傳感器法等。這些方法大多是通過檢測(cè)酶催化反應(yīng)得到的電化學(xué)活性物質(zhì)或有色物質(zhì)的多少，來反映樣品中的農(nóng)藥殘留的高低。然而，由于食品樣品的組分多樣性，這種方法容易受樣品中其他電化學(xué)活性物質(zhì)或光學(xué)物質(zhì)的干擾，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性。
利用生化反應(yīng)過程中普遍伴隨的熱量變化，采用量熱的方式來進(jìn)行分析，具有通用性強(qiáng)、適用于大多數(shù)生化樣品、在測(cè)量時(shí)不受其他電化學(xué)活性物質(zhì)或光學(xué)物質(zhì)的干擾等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于生化反應(yīng)產(chǎn)生的熱量往往比較小，難以測(cè)量。因此，目前國(guó)內(nèi)外在檢測(cè)農(nóng)藥方面，很少采用量熱式的方法。
本申請(qǐng)人曾基于量熱原理，于2002年11月獲得了一項(xiàng)名為“一種探測(cè)農(nóng)藥殘留用的量熱式生物傳感器”的實(shí)用新型專利(CN2519909)。該專利裝置主要由參考酶柱、檢測(cè)酶柱、流動(dòng)單元和檢測(cè)單元組成，通過檢測(cè)兩酶柱出口液體的溫度差和標(biāo)定，獲知樣液中的農(nóng)藥殘留高低。但也由于利用的膽堿酯酶催化的生化反應(yīng)放出熱量過小，增加了檢測(cè)難度，降低了檢測(cè)準(zhǔn)確度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留方法中，由于食品樣品的組分多樣性，容易受樣品中其他電化學(xué)活性物質(zhì)或光學(xué)物質(zhì)的干擾，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性的缺點(diǎn)，提供一種生化反應(yīng)產(chǎn)生的熱量大，易測(cè)量的適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法，其特點(diǎn)是，所述的生物敏感元件由從動(dòng)植物體中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1、酶液的提取動(dòng)物組織按1∶3的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎；或植物組織干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行攪拌提取；離心分離得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎、離心分離得酚氧化酶粗酶液；2、酶的部分純化用30％和80％飽和度的硫酸銨溶液依次對(duì)B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液進(jìn)行分級(jí)沉淀，之后用超濾除去小分子鹽；
3、酶的固定化將部分純化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，與處理好的OH型陰離子交換樹脂一起攪拌固定，4-5小時(shí)后，用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于中性緩沖液中待用。
本方法制作的生物敏感元件由從動(dòng)植物體中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成。前者能專一性地被有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制，后者能催化前者催化產(chǎn)生的水解產(chǎn)物——酚類物質(zhì)的氧化。其原理示意圖為 其中Q1和Q2分別為反應(yīng)(1)和(2)兩個(gè)過程中放出的熱量。利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)B-酯酶的抑制作用，采用與未受抑制的同種酶體系的反應(yīng)放熱對(duì)比的方法，測(cè)得熱量之差(ΔQ)。通過標(biāo)定，這個(gè)熱量差就反映食品中農(nóng)藥殘留的濃度。本發(fā)明的有益效果是由于由本方法制作的生物敏感元件利用酶聯(lián)級(jí)反應(yīng)(反應(yīng)1和2)將ΔQ由原來的ΔQ1提高到了Δ(Q1+Q2)，大大提高了量熱式農(nóng)藥檢測(cè)的靈敏度。


圖1為酶催化反應(yīng)的熱流曲線。
圖中A固定化B-酯酶，未經(jīng)敵敵畏(1mg/L)溶液抑制，催化的生化反應(yīng)的熱流曲線；B本發(fā)明制備的固定化生物敏感元件(含B-酯酶和酚氧化酶)，未經(jīng)敵敵畏(1mg/L)溶液抑制，催化的生化反應(yīng)的熱流曲線；A’固定化B-酯酶，經(jīng)敵敵畏(1mg/L)溶液抑制后，催化的生化反應(yīng)的熱流曲線；B’本發(fā)明制備的固定化生物敏感元件(含B-酯酶和酚氧化酶)，經(jīng)敵敵畏(1mg/L)溶液抑制后，催化的生化反應(yīng)的熱流曲線。
具體實(shí)施例方式
一種適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法，其特點(diǎn)是該生物敏感元件由從動(dòng)植物體中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1、酶液的提取本實(shí)施例中動(dòng)物組織采用動(dòng)物的肝臟按1∶3的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎；或植物組織采用小麥干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行攪拌提?。浑x心分離得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎、離心分離得酚氧化酶粗酶液；2、酶的部分純化用30％和80％飽和度的硫酸銨溶液依次對(duì)B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液進(jìn)行分級(jí)沉淀，之后用超濾除去小分子鹽；
3、酶的固定化將部分純化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，與處理好的OH型陰離子交換樹脂一起攪拌固定，4-5小時(shí)后，用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于中性緩沖液中待用。
具體試驗(yàn)實(shí)例以1mg/L(相當(dāng)于1ppm)的敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣液，分別通過固定化B-酯酶和本發(fā)明制備的固定化生物敏感元件；用micro-DSCIII微量量熱儀，測(cè)量通過后的這兩類酶體系催化反應(yīng)的放熱量，并與無樣液通過的酶體系的反應(yīng)放熱比較，得到以下曲線。其具體操作條件如下反應(yīng)溫度40℃； 反應(yīng)pH6.4磷酸緩沖液；流速0.3ml/min；底物50μl的80mmol/Lα-乙酸萘酯溶液；由圖1所示曲線積分可知，lmg/L的敵敵畏引起B(yǎng)-酯酶催化反應(yīng)的熱量變化(即曲線A的積分面積-曲線A’的積分面積)僅為0.003mJ(mW*s)，而它引起本發(fā)明制備的固定化生物敏感元件催化反應(yīng)的熱量變化(即曲線B的積分面積-曲線B’的積分面積)卻為0.1mJ(mW*s)。與單獨(dú)使用B-酯酶相比，由相同農(nóng)藥濃度引起的熱量變化提高了33倍左右，這大大降低了測(cè)熱的難度。這是因?yàn)?，?dāng)樣液中存在農(nóng)藥時(shí)，B-酯酶的活性受到抑制，酚的產(chǎn)量降低，放熱量Q1減少；反應(yīng)式(2)的反應(yīng)放熱量Q2也隨著酚濃度的降低而減少，從而使得與使用單級(jí)B-酯酶相比，由相同農(nóng)藥濃度引起的熱量變化大幅度升高。
權(quán)利要求
1.一種適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法，其特點(diǎn)是該生物敏感元件由從動(dòng)植物體中提取的B-酯酶和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1)酶液的提取動(dòng)物組織按1∶3的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎；或植物組織干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行攪拌提??；離心分離得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的緩沖液，進(jìn)行組織破碎、離心分離得酚氧化酶粗酶液；2)酶的部分純化用30％和80％飽和度的硫酸銨溶液依次對(duì)B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液進(jìn)行分級(jí)沉淀，之后用超濾除去小分子鹽；3)酶的固定化將部分純化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，與處理好的OH型陰離子交換樹脂一起攪拌固定，4-5小時(shí)后，用蒸餾水洗去未固定上的酶液，將洗凈的固定化酶存于中性緩沖液中待用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)的生物敏感元件及其制作方法，其特點(diǎn)是該生物敏感元件由從動(dòng)植物體中提取的B－酯酶和從蔬菜中提取的酚氧化酶組成，制作方法步驟為1)酶液的提??；2)酶的部分純化；3)酶的固定化。由本方法制作的生物敏感元件利用酶聯(lián)級(jí)反應(yīng)大大提高了量熱式農(nóng)藥檢測(cè)的靈敏度，適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1987439SQ20061014724
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日
發(fā)明者徐斐, 姜覓, 胥義, 華澤釗, 馬天畫 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)