專利名稱：一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的試紙，特別涉及一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，還涉及其制備方法。
背景技術(shù)：
鼻疽是由鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallie)引起的一種致死性和傳播性均很強的細菌性疾病。鼻疽菌曾命名為鼻疽費氏桿菌(Pfeifferellamallei，1918)、鼻疽惡病桿菌(Malleonydes mallei，1933)、鼻疽放線菌(Adtinoei mallei，1933)、鼻疽呂氏桿菌(Loefferella mallei，1935)、鼻疽不動桿菌(Acinetobacter mallei，1964)和鼻疽假單胞菌(Pseudomonas，mallei1966)，1993年命名為鼻疽伯克霍爾德氏菌。
由于鼻疽菌容易獲得，致病性強，致死率高，如未及時治療，病死率高達100％。被公認為經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑，已被列入《國際禁止生物武器公約》核查清單。第一次世界大戰(zhàn)期間，德國間諜在東部戰(zhàn)場蓄意用鼻疽菌感染了大批俄羅斯的馬和牛，使戰(zhàn)后俄羅斯人鼻疽的發(fā)病數(shù)增加；第二次世界大戰(zhàn)期間，日本人在中國的哈爾濱研究可能使用的生物武器，蓄意將馬、平民和戰(zhàn)俘感染上鼻疽；二戰(zhàn)后美國和前蘇聯(lián)一直將鼻疽菌作為潛在的生物武器研究。“9.11”以后，美國國家反恐預(yù)案將鼻疽菌列為可能用于生物恐怖襲擊的烈性病原微生物。因此，鼻疽菌的快速檢測是反生物恐怖的重要內(nèi)容(Bossi P，Guihot A，Bricaire F.Emerging or re-emerging infections that can be used for bioterrorismPresse Med.2005 Jan 29；34(2Pt 2)149-155)。
鼻疽菌檢測的經(jīng)典方法鼻疽的臨床表現(xiàn)復(fù)雜易變，不易診斷，必須借助實驗室的試驗結(jié)果做判斷，包括細菌學(xué)檢查和血清學(xué)試驗。
臨床采集患者鼻腔分泌物、痰、皮膚潰瘍分泌物或膿腫穿刺物，直接涂片鏡檢，同時接種4％甘油肉湯瓊脂，按照分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、玻片血清凝集和動物感染試驗程序檢驗。
鼻疽菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，3～5μm長，0.5～1μm寬，散在分布，無鞭毛，無芽孢，無莢膜。鼻疽菌為需氧菌，在4％甘油瓊脂上生長良好。根據(jù)生化反應(yīng)和動力試驗可將鼻疽菌與類鼻疽菌和綠膿假單胞菌區(qū)別開。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是鼻疽菌快速檢測方法中最常用的技術(shù)，最初根據(jù)鼻疽菌23S rRNA基因設(shè)計引物CVMP2315′AAA CCG ACA CAG GTG G 3′；M2325′CAC CGA AAC TAG CA 3′，用于鼻疽菌的鑒定(Adolf Bauernfeind，CarstenRoller Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia malleiand Burkholderia pseudomallei.J.Clin.Microbiol，1998，362737-2741)；應(yīng)用鼻疽菌23S rRNA基因設(shè)計引物，也可獲得明確的鼻疽菌鑒定結(jié)果(Gee JE，Sacchi CT，Glass MB，De BK.Use of 16S rRNA gene sequencing for rapididentification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and B.mallei.J Clin Microbiol.2003，41(10)4647-4654)；近年來將實時定量PCR(real-time PCR)技術(shù)用于臨床標(biāo)本中鼻疽菌的檢測，可檢出1～10cfu/ml鼻疽菌(Tomaso H，Scholz HC，Al Dahouk S，Eickhoff M Development of a5’-nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapididentification of Burkholderia mallei in clinical samples.Clin Chem.2006，52(2)307-310；Novak RT，Glass MB，Gee JE，Gal D，Mayo MJ.Developmentand evaluation of a real-time PCR assay targeting the type III secretionsystem of Burkholderia pseudomallei J Clin Microbiol.200644(1)85-90)。
免疫膠體金技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的快速檢測技術(shù)，該技術(shù)與其它方法比較，優(yōu)勢在于檢測過程中標(biāo)本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用。
目前尚無見到免疫層析試紙檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。
本發(fā)明所提供的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊、與所述金標(biāo)墊緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的一條檢測線和一條質(zhì)控線，所述檢測線為鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗體，所述質(zhì)控線為能與所述鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體特異結(jié)合的抗抗體。
所述鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗體優(yōu)選為兔抗體，所述質(zhì)控線優(yōu)選為抗兔抗抗體。
檢測樣品時可將檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的樣品墊直接浸于樣品中；為了使用更加方便，所述吸水墊的下面還緊密連接有背板，背板的材料可以是多種多樣的，如塑料、聚氯乙烯板(PVC板)等。再將該帶有背板的試紙裝入試劑盒中，該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體，將鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體溶液噴到纖維膜上，包被NC膜的一個區(qū)域，得到檢測線；將抗兔IgG的抗抗體溶液噴到纖維膜上，包被NC膜的另一區(qū)域，得到質(zhì)控線；37℃干燥2.5-5.5小時，然后將其粘貼在吸水紙墊上。
2)制備含有鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體標(biāo)記免疫膠體金探針溶液；取5ml，加入0.5-0.65g蔗糖充分溶解，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，-20℃～-50℃放置10-11小時后，凍干機抽干，將其粘貼在步驟1)得到的纖維膜的靠近所述檢測線的一端。
3)將在步驟2)中得到的金標(biāo)墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙。
為了使用更加方便，所述吸水墊的下面還粘貼背板。
本發(fā)明所述鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體標(biāo)記膠體金探針可由下述方法制備1)將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸，攪動下準確加入1.6ml的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，直到液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液，冷卻后用水恢復(fù)至原體積；2)用K2CO3或HCl調(diào)pH值為9.2-9.5，按30μg/ml加入鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體。攪拌20-25分鐘，然后加入10％BSA 5ml，攪拌20-25分鐘，加1ml 10％PEG20000，攪拌20-25分鐘，2800-2900rpm離心10-15分鐘，吸出上清，10000-12000rpm離心25-35分鐘，棄上清；沉淀用四硼酸鈉洗滌一次后用四硼酸鈉保存液收集，得到膠體金標(biāo)探針。
所述調(diào)節(jié)pH值的K2CO3的濃度可為0.15-0.25M，優(yōu)選為0.2M；所述調(diào)節(jié)pH值的HCl的濃度可為0.05-0.2M，優(yōu)選為0.1M。
免疫膠體金技術(shù)檢測鼻疽菌抗原的基本原理是用鼻疽菌特異性抗體包被硝酸纖維素(NC)膜，用以捕捉標(biāo)本中的鼻疽菌或鼻疽菌抗原，然后用標(biāo)記了特異性抗體的免疫膠體金探針檢測。標(biāo)本中的鼻疽菌或鼻疽菌抗原經(jīng)過5分鐘左右的紙層析后，即出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線。
鼻疽伯克霍爾德氏菌多糖抗原是鼻疽菌的特異性抗原。因此，用鼻疽伯克霍爾德氏菌有毒株制備含豐富多糖抗原的全菌體抗原免疫動物，可以得到鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗體。本發(fā)明的免疫層析試紙采用雙抗體夾心法，將抗鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗體包被在硝酸纖維素膜上，用于捕捉標(biāo)本中的鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原，然后用特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針進行檢測。
本發(fā)明研制的鼻疽菌抗原快速檢測試劑(膠體金法)實驗室考核結(jié)果顯示，可檢測標(biāo)本中鼻疽菌106cfu/ml，并且不與相關(guān)細菌發(fā)生交叉。
本發(fā)明的優(yōu)勢在于檢測過程中標(biāo)本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，很適合突發(fā)事件現(xiàn)場和基層使用。


圖1為鼻疽伯克霍爾德氏菌免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維膜3、金標(biāo)墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上包被有檢測線5和質(zhì)控線6。
具體實施例方式
主要材料氯金酸(HAuCl4)(購自Sigma公司，1g/瓶包裝)；硝酸纖維膜(NC膜)、樣品墊和吸水濾紙(購自Millipore公司)。
實施例中所用到的菌種均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所菌種庫提供鼻疽伯克霍爾德氏菌(保藏號350018)，引自農(nóng)林部中監(jiān)所；類鼻疽4株(越南株、廣東株、廣西株、海南株各1株)、綠膿假單胞菌3株。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的制備1、鼻疽伯克霍爾德氏菌特異性抗體的制備1)鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原的制備鼻疽菌(保藏號350018)接種含4％甘油普通瓊脂平板上，37℃孵箱培養(yǎng)，觀察平板上菌落形態(tài)，挑取典型的單個菌落，轉(zhuǎn)種4％甘油普通瓊脂斜面，37℃孵箱中培養(yǎng)24-28小時。用5％甲醛鹽水洗下粘稠菌苔于鹽水瓶中，放置37℃過夜。無菌試驗觀察7-8天，證明無活菌后，將菌液10,000g-12,000g離心10-15分鐘，收集沉淀，用無菌生理鹽水配制成2倍比濁濃度(約109cfu菌/ml)，即為鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原。
2)鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體的制備選用體重2kg健康雌性大耳白家兔(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)，皮下多點注射免疫福氏完全佐劑鼻疽菌菌體抗原2×108cfu菌/1ml/只，分別于初次免疫后的第20日、第30日、第40日追加免疫水劑1針，追加劑量和途徑與初次相同，末次免疫后10天試血，玻片凝集試驗檢測血清效價達到1∶1280以上采血。
采用常規(guī)的飽和硫酸銨鹽析法對血液中的鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體進行純化，經(jīng)瓊脂雙向擴散法鑒定獲得的抗體具有較好的特異性和親和性。
2、制備免疫膠體金探針1)制備膠體金溶液采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動下準確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。
2)確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度用0.2M K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH9.2，準備5支潔凈試管，分別加入1ml膠體金溶液。將經(jīng)純化的鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體稀釋為1mg/ml，分別向4支試管中加入20μl、25μl、30μl、35μl，另一支為對照，混勻后于室溫下放置5分鐘，加入10％NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變時所含最少抗體量，即為穩(wěn)定1ml膠體金所需抗體的最適濃度，以此為基礎(chǔ)增加20％抗體量，即為膠體金偶聯(lián)抗體飽和濃度。結(jié)果表明維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為25μl，即25μg/ml，選擇偶聯(lián)抗體濃度為30μg/ml。
3)金標(biāo)墊2的制備按上述方法配制含有濃度為30μg/mL的鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體的免疫膠體金探針溶液50ml。攪拌20-25分鐘，然后加入10％BSA 5ml，攪拌20-25分鐘，加1ml 10％PEG20000，攪拌20-25分鐘，2800-2900rpm離心10-15分鐘，吸出上清，10000-12000rpm離心25-35分鐘，棄上清；沉淀用四硼酸鈉洗滌一次后用四硼酸鈉保存液收集沉淀5ml。取金標(biāo)探針5ml加入0.5-0.65g蔗糖，充分溶解均勻加在玻璃纖維膜上，-20℃～-50℃放置10-11小時小時，凍干機抽干，得到金標(biāo)墊2。
3、檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的制備如圖1所示，檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙由吸水墊4、硝酸纖維膜3、金標(biāo)墊2和玻璃纖維膜樣品墊1四部分組成；硝酸纖維膜3上包被有檢測線5和質(zhì)控線6。制備方法包括以下步驟1)NC膜3的包被鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體和羊抗兔IgG的包被用0.01M pH7.2PB稀釋鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體至終濃度為2mg/ml，用于包被檢測線。用0.01M pH 7.2的PBS稀釋羊抗兔IgG至終濃度為4mg/ml，用于包被質(zhì)控線。用BIODOT公司XYZ3000噴膜機分別噴于300mm長、25mm寬硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測線5和質(zhì)控線6，37℃干燥2.5-5.5h。
2)檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的制備將吸水紙墊4用雙面膠粘貼于上述包被有鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體和羊抗兔IgG的NC膜3靠近質(zhì)控線的一端；將在步驟2中制備的金標(biāo)墊2用雙面膠粘貼于NC膜3靠近檢測線的一端；再在金標(biāo)墊2的上用雙面膠粘貼玻璃纖維膜樣品墊1；最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，加干燥劑后密封保存。
4、檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將步驟3制備的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的下面再緊密連接一塑料背板，再將該帶有背板的試紙裝入試劑盒中，加干燥劑后密封保存。該試劑盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有點樣口，對應(yīng)于對照帶和測試帶的部位設(shè)有觀測窗。
5、檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的使用方法和原理測定時將試紙條樣品墊1浸入液體標(biāo)本中，樣品墊1即吸取液體向上端移動，流經(jīng)金標(biāo)墊2時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向硝酸纖維膜3滲移。若標(biāo)本中有待測特異抗原，其可與免疫金復(fù)合物的抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至檢測線5即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至質(zhì)控線6與固相二抗結(jié)合，而顯出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
實施例2、鼻疽菌的檢測及與其它相關(guān)細菌的交叉試驗1、鼻疽菌的檢測1)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心提供、鼻疽菌350018株，鼻疽菌350019株，濃度均為1×106cfu/ml，菌懸液作為樣品檢測液備用。
2)經(jīng)實施例1制備的包被鼻疽菌特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙檢測均為陽性結(jié)果。
2、其他相關(guān)細菌的交叉試驗1)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所微生物檢驗研究中心提供、類鼻疽菌350102株，綠膿假單胞菌430023株，濃度均為1×108cfu/ml，菌懸液作為樣品檢測液備用。
2)經(jīng)實施例1制備的包被鼻疽菌特異性抗體和羊抗兔IgG的免疫層析試紙檢測均為陰性結(jié)果。
實施例3、實驗室考核1、樣品制備將不同細菌分別接種各自適宜的培養(yǎng)基，并在不同的條件下培養(yǎng)，長出菌苔后用無菌生理鹽水洗下，比濁法配制鼻疽菌菌懸液1×106cfu/ml、1×107cfu/ml和1×108cfu/ml，其它細菌菌懸液1×108cfu/ml，作為檢測液備用。
2、實驗方法取鼻疽菌抗原快速檢測試劑，分別于樣品墊上加入上述樣品檢測液3滴(約150μl)，2分鐘后開始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。結(jié)果報告質(zhì)控線處出現(xiàn)1條沉淀線為陰性，即無鼻疽菌抗原檢出；檢測線和質(zhì)控線處出現(xiàn)2條沉淀線為陽性，即有鼻疽菌抗原檢出。
實施例二不同水環(huán)境濃度下采樣檢測裝置富集速率的恒定性在不同的水環(huán)境濃度下，采樣檢測裝置放在其中3天后，分析其中富集極性內(nèi)分泌干擾物的量。具體方法設(shè)置一系列濃度剃度，含極性內(nèi)分泌干擾物濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000ng/L的水，采用與實例1相同的水箱系統(tǒng)，將采樣檢測裝置(3個)放置該流動水箱系統(tǒng)中3天后取出，同時每天取水樣監(jiān)測水中極性內(nèi)分泌干擾物的量；采樣檢測裝置和水以實例1中所描述的方法進行預(yù)處理和檢測其中所含有極性內(nèi)分泌干擾物的量。公式Cw＝Ms/Rzt，通過該公式可計算采樣檢測裝置的富集速率Rz，結(jié)果如表1所示。
從表1中可知，隨著水體濃度自10ng/L到1000ng/L，采樣檢測裝置對污染物BPA、E1、E2、EE2在不同濃度下的富集速率平均值分別為0.04、0.04、0.037、0.051L/d，在7個濃度范圍內(nèi)，其富集速率的相對標(biāo)準偏差為13-28％，可認為該采樣檢測裝置對四種極性內(nèi)分泌干擾物的采樣富集速率基本上不隨外界水環(huán)境濃度而發(fā)生變化，保持恒定，是個常數(shù)。
實施例三采樣檢測裝置應(yīng)用于河流中極性內(nèi)分泌干擾物的監(jiān)測選一特定河流，沿水流方向布設(shè)三個點位，將本發(fā)明的采樣檢測裝置懸浮放在水中，每個站位放置3個，過1周后取回，同時在每個點位利用玻璃瓶取3個水樣帶回實驗室分析。其分析方法如實例1中所述。測定所得的采樣檢測裝置中Ms量，可籍以通過公式Cw＝Ms/Rzt(利用實驗室模擬狀態(tài)下獲得的Rz值)，計算得水中極性內(nèi)分泌干擾物的濃度Cw。將通過采樣檢測裝置測得和采集水樣測定所得的污染物濃度列于表2，其中A*、B*、C*表示利用本發(fā)明裝置測定河流水中三個點位的極性內(nèi)分泌干擾物濃度值，而A、B、C則表示直接利用玻璃瓶取三個對應(yīng)的水樣回實驗室通過固相萃取小柱預(yù)處理后測定所得的水中極性內(nèi)分泌干擾物濃度數(shù)據(jù)，從中可見，本發(fā)明監(jiān)測獲得的數(shù)據(jù)與現(xiàn)場采水樣方法所測得的BPA、E1、E2、EE2濃度數(shù)據(jù)，從痕量有機污染物監(jiān)測方面而言，該兩組數(shù)據(jù)具有很強的可比性，其污染水平接近，表明該采樣檢測裝置可應(yīng)用于實際水環(huán)境中極性內(nèi)分泌干擾物的有效監(jiān)測。
權(quán)利要求
1.一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，包括樣品墊(1)、緊密連接于所述樣品墊一端的含有鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊(2)、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(3)和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊(4)；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線(5)和質(zhì)控線(6)，所述檢測線為鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體，所述質(zhì)控線為能與所述鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體特異結(jié)合的抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，其特征在于質(zhì)控線優(yōu)選為抗兔抗抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，其特征在于所述樣品墊、吸水墊、金標(biāo)墊均由吸水材料制成；所述吸水墊的下面還緊密連接有背板。
4.一種制備檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)制備鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體，將鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體溶液噴到纖維膜上，包被NC膜的一個區(qū)域，得到檢測線；抗兔抗抗體溶液噴到纖維膜上，包被NC膜的另一區(qū)域，得到質(zhì)控線；37℃干燥2.5-5.5小時，然后將其粘貼在吸水紙墊上。2)制備膠體金標(biāo)探針，采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動下準確加入1.6mL的1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，即得到膠體金溶液。用0.2M K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH9.2-9.5，按30μg/ml加入鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體，攪拌20-25分鐘，然后加入10％BSA 5ml，攪拌20-25分鐘，加1ml 10％PEG20000，攪拌20-25分鐘，2800-2900rpm離心10-15分鐘，吸出上清，10000-12000rpm離心25-35分鐘，棄上清；沉淀用四硼酸鈉洗滌一次后用四硼酸鈉保存液收集沉淀5ml。所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。3)制備含有鼻疽菌抗體標(biāo)記免疫膠體金探針溶液；取5ml，加入0.5-0.65g蔗糖充分溶解，將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入該免疫膠體金探針溶液，得到金標(biāo)墊，-20℃～-50℃放置10-11小時后，凍干機抽干，將其粘貼在步驟1)得到的纖維膜的靠近所述檢測線的一端。4)將在步驟2)中得到的金標(biāo)墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體的濃度為2mg/ml；抗兔IgG濃度為4mg/ml；所述吸水墊的下面還粘貼有背板；所述調(diào)節(jié)pH值的K2CO3的濃度為0.2M。。
6.含有權(quán)利要求1-3中任一所述的檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙及其制備方法。該檢測鼻疽伯克霍爾德氏菌的免疫層析試紙，包括樣品墊1、緊密連接于所述樣品墊一端的含有鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體標(biāo)記膠體金探針的金標(biāo)墊2、與所述金標(biāo)墊的另一端緊密連接的硝酸纖維膜(NC膜)3和緊密連接于所述硝酸纖維膜另一端的吸水墊4；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線5和質(zhì)控線6，所述檢測線為鼻疽伯克霍爾德氏菌抗體，所述質(zhì)控線為抗兔抗抗體。本發(fā)明用于臨床標(biāo)本、污染物和環(huán)境中鼻疽伯克霍爾德氏菌抗原的檢出，也可用于純培養(yǎng)鼻疽伯克霍爾德氏菌的鑒定。
文檔編號G01N33/532GK1834650SQ200610072299
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者端青, 朱虹, 何君, 檀華 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所