專利名稱：一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒引起的急性病毒性感染，該病傳染性強(qiáng)，四季都可流行，病毒分離與血清學(xué)試驗(yàn)是目前流行性腮腺炎病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的主要手段。但由于病毒分離時間長，要求條件高，分離率低；血清學(xué)方法敏感度低，不適用于早期診斷等原因，使這兩種方法在使用中受到很大的限制。普通PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于病毒基因的特異性檢測，它具有靈敏、特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，但存在反應(yīng)結(jié)果判定需要電泳，且反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽性等缺點(diǎn)。
近幾年發(fā)展起來的熒光定量PCR技術(shù)，它利用了PCR對脫氧核糖核酸(DNA)的高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性以及定量特點(diǎn)，不僅克服了常規(guī)PCR定性檢測的不足，而且具有直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)。
熒光定量PCR技術(shù)原理熒光定量PCR是利用熒光染料在激發(fā)光的作用下所釋放的熒光光能的變化來動態(tài)直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。因熒光信號變量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，通過足夠靈敏的自動化熒光定量PCR儀就可以通過對熒光信號的采集與分析來實(shí)現(xiàn)對初始模板的定量。
常用的熒光標(biāo)記方法可簡單分為兩大類1、非特異檢測-雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；2、擴(kuò)增序列專一檢測-主要指熒光探針和引物探針，熒光標(biāo)記的探針共有三類(1)分子信標(biāo)探針；(2)雜交雙探針；(3)Taqman雙標(biāo)記探針。廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)。當(dāng)探針完整的時候，5′端報告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(就是說5′端熒光基團(tuán)的發(fā)射波長正好是3′端熒光基團(tuán)的吸收波長，因而能量被吸收傳遞到3′端熒光基團(tuán)而發(fā)出其它熒光)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會切割探針，釋放5′端報告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5′端報告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。從儀器檢測出熒光值出峰的最低循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)與檢測病毒核酸量對數(shù)值呈線性負(fù)相關(guān)。根據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)中的Ct值就能算出原始的模板量。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是根據(jù)上述原理，設(shè)計(jì)適合腮腺炎病毒的特異性引物和特異性探針，發(fā)明目的在于提供一種腮腺炎病毒的基因快速檢測試劑盒和檢測方法。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，包括腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品、熒光擴(kuò)增檢測試劑及DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶，所述熒光擴(kuò)增檢測試劑主要包括一步法RT-PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，所述腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品部分序列為5’-CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAACCACCTGCTTTCAAGATACCGGTGATGCTAGTG-3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列5’-CTCAAGGACTRTYTGCYTCSTA-3’，下游引物序列5’-CTCTRGCATCACCGGTATCTTGAA-3’，所述特異性探針序列為5’-FAM-ACCACAACCACCTGC-NFQ-MGB-3’，其中FAM為報告熒光基團(tuán)，NFQ為非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，可以降低PCR反應(yīng)熒光本底信號的強(qiáng)度，MGB為修飾基團(tuán)，可以將探針退火溫度提高10℃左右。
所述熒光擴(kuò)增檢測試劑主要成分如下一步法RT-PCR緩沖液終濃度為1×特異性擴(kuò)增上游引物0.6～1.0μM特異性擴(kuò)增下游引物0.6～1.0μM特異性探針0.2～0.5μM脫氧三磷酸核苷混合物 400～800μM余量為DEPC水。
以上濃度均為各物質(zhì)在反應(yīng)體系中的終濃度。脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫、高壓消毒的MiliQ級純水。
所述一步法RT-PCR緩沖液終濃度為1×，即表示緩沖液中各組分在反應(yīng)液中終濃度與1×RT-PCR buffer中各組分濃度相同，各組分終濃度如下KCl 50mM，Tris-HCl 10mM，TritonX-100 0.1％，MgCl21.5mM。本發(fā)明中選用體積為反應(yīng)液總體積20％的5×RT-PCR buffer。
所述熒光擴(kuò)增檢測試劑中還添加有終濃度為0.8活力單位/μL的RNA酶抑制劑RNasin。RNasin核酸酶抑制劑是由Promega研究和開發(fā)的，具有廣譜的RNA酶抑制活力，用于清除RNA酶污染。RNasin核酸酶抑制劑是1個50kD大小的蛋白，它和RNA酶以非共價鍵按1∶1結(jié)合，而抑制RNA酶活力，結(jié)合常數(shù)為10～14。RNasin核酸酶抑制劑的活力單位定義為抑制5ngRNase A水解2`，3`-單磷酸環(huán)化胞苷的50％的活力所用的抑制劑的量。
所述熒光擴(kuò)增檢測試劑中還添加有終濃度5mM的二巰基蘇糖醇-所述脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP物質(zhì)的量1∶1∶1∶1的混合物。
所述DNA聚合酶用量為0.5～5酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。
所述逆轉(zhuǎn)錄酶用量為6～300酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①M(fèi)-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；②AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
具體的，所述熒光擴(kuò)增檢測試劑組成如下一步法RT-PCR buffer 終濃度為1×二巰基蘇糖醇5mMRNA酶抑制RNasin 0.8活力單位/μL
特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針 0.28μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM余量為DEPC水。
一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測方法，所述的檢測方法以腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用待測病人的含漱液為分析樣本，所述方法步驟如下(1)取含漱液提取病毒RNA；(2)熒光PCR擴(kuò)增檢測取熒光擴(kuò)增檢測試劑與反應(yīng)所需的DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶配成反應(yīng)液，加入標(biāo)準(zhǔn)品與分析樣本的RNA分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測；(3)結(jié)果分析選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3～15個循環(huán)的熒光信號；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)；熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，判斷為陽性；所述腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品部分序列為5’-CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAACCACCTGCTTTCAAGATACCGGTGATGCTAGTG-3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列5’-CTC AAG GAC TRT YTG CYT CST A-3’，下游引物序列5’-CTC TRG CAT CAC CGG TAT CTT GAA-3’，所述特異性探針序列為5’-FAM-ACCACAACCACCTGC-NFQ-MGB-3’，其中FAM為報告熒光基團(tuán)，NFQ為非熒光淬滅基團(tuán)，MGB為修飾基團(tuán)。
具體的，所述的方法取定量熒光擴(kuò)增檢測試劑配制反應(yīng)液，反應(yīng)體系每25μL組成如下5×RT-PCR buffer 5μL二巰基蘇糖醇 5mMRNA酶抑制劑RNasin0.8單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針 0.28μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μMAmpli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力單位/反應(yīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 50酶活力單位/反應(yīng)分析樣本病毒RNA 5μLDEPC水補(bǔ)足至25μL；PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2min，以95℃15s，60℃退火1min擴(kuò)增40個循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測。退火溫度適宜范圍為60～50℃，退火時間適宜范圍為30sec～1min。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在1、早期診斷PCR可直接檢測病原體核酸，在腮腺炎發(fā)病早期，就可以檢測出是否含有腮腺炎病毒特異性基因，為及早隔離、確診和治療提供方便。
2、取樣簡單方便可取潛伏期或發(fā)病早期腮腺炎患者呼吸道樣本進(jìn)行檢測。
3、與傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增技術(shù)相比，本發(fā)明提供的檢測方法省時省力，可在2～3小時內(nèi)完成檢測。
4、靈敏度高，由于采用了特異性基因擴(kuò)增和特異性基因探針雜交結(jié)合的雙重技術(shù)，診斷的靈敏度更高。
5、采用計(jì)算機(jī)實(shí)時監(jiān)測技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中即可判斷是否含有病毒基因，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷方便準(zhǔn)確。
6、可實(shí)現(xiàn)病毒核酸的定量分析，利用已知拷貝數(shù)、含有腮腺炎病毒基因重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對原始標(biāo)本中的病毒含量進(jìn)行定量分析。


圖1為腮腺炎病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖，從左至右擴(kuò)增的病毒拷貝數(shù)依次為107、106、105、104、103、102、10；圖2為腮腺炎病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為熒光定量RT-PCR對腮腺炎病毒核酸檢測的重現(xiàn)性，從左至右擴(kuò)增的病毒拷貝數(shù)依次為106、105、104；圖4為TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR對腮腺炎病毒臨床標(biāo)本的檢測，圖中A為腮腺炎病毒陽性內(nèi)對照核酸，B為腮腺炎病毒陽性外對照核酸。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1TaqMan-MGB檢測方法步驟如下(1)提取RNA取含漱液200ul用德國QIAGEN公司的Reansy Mini Kit提取病毒RNA(1μg/μL)。
(2)熒光PCR擴(kuò)增取定量熒光擴(kuò)增檢測試劑配制反應(yīng)液，反應(yīng)體系為每25μL，包括5×RT-PCR buffer 5μL二巰基蘇糖醇 5mMRNA酶抑制劑RNasin0.8單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針 0.28μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μMAmpli TaqR DNA聚合酶 2.5酶活力單位/反應(yīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 50酶活力單位/反應(yīng)分析樣本病毒RNA(1μg/μL)5μLDEPC水補(bǔ)足至25μL；PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2min，以95℃15s，60℃退火1min擴(kuò)增40個循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測。
按上述反應(yīng)液配方，加入標(biāo)準(zhǔn)品與分析樣本的RNA分別配制反應(yīng)液、進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光檢測；標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線見圖1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，選擇病毒拷貝數(shù)依次為106、105、104/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行定量RT-PCR檢測，每個樣本重復(fù)作五次，結(jié)果見圖3和表1，每個濃度5次反應(yīng)的Ct值變異系數(shù)均小于1％。腮腺炎病毒臨床標(biāo)本擴(kuò)增曲線見圖4；表1熒光定量RT-PCR檢測腮腺炎病毒的重現(xiàn)性結(jié)果
(3)結(jié)果分析選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3～15個循環(huán)的熒光信號；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)；熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，判斷為陽性；通過熒光定量RT-PCR對腮腺炎病毒核酸檢測的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)表明，每個標(biāo)準(zhǔn)核酸濃度5次重復(fù)反應(yīng)的Ct值變異系數(shù)均小于1％，說明該方法的重現(xiàn)好較好。
利用此TaqMan-MGB熒光定量PCR方法對浙江省部分地區(qū)疑似流行性腮腺炎疫情標(biāo)本35份進(jìn)行檢測，并與普通RT-PCR方法相比較，結(jié)果表明，熒光定量PCR檢測陽性27份，普通PCR檢測陽性18份，而病毒培養(yǎng)陽性7份。RT-PCR與病毒培養(yǎng)為陽性的標(biāo)本，熒光定量RT-PCR檢測也均為陽性，符合率很好。
序列表.WorkFileApplication Project-------------------<120>Title一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒及檢測方法<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate____-__-__Sequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringctcaaggact gtttgcctct tacaccacaa ccacctgctt tcaagatacc ggtgatgcta60gtg63<212>TypeRNA<211>Length63SequenceName腮腺炎病毒血凝素基因SequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringctcaaggact rtytgcytcs ta22<212>TypeRNA<211>Length22SequenceName上游引物SequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringctctrgcatc accggtatct tgaa24<212>TypeRNA<211>Length24SequenceName下游引物SequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringaccacaacca cctgc15
序列表.WorkFile<212>TypeRNA<211>Length15SequenceName特異性探針SequenceDescription。
權(quán)利要求
1.一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，包括腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品、熒光擴(kuò)增檢測試劑以及DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶，所述熒光擴(kuò)增檢測試劑主要包括一步法RT-PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，其特征在于所述腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品部分序列為5’-CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAACCACCTGCTTTCAAGATACCGGTGATGCTAGTG-3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列5’-CTCAAGGACTRTYTGCYTCSTA-3’，下游引物序列5’-CTCTRGCATCACCGGTATCTTGAA-3’，所述特異性探針序列為5’-FAM-ACCACAACCACCTGC-NFQ-MGB-3’，其中FAM為報告熒光基團(tuán)，NFQ為非熒光淬滅基團(tuán)，MGB為修飾基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測試劑主要成分如下一步法RT-PCR緩沖液終濃度為1×特異性擴(kuò)增上游引物0.6～1.0μM特異性擴(kuò)增下游引物0.6～1.0μM特異性探針0.2～0.5μM脫氧三磷酸核苷混合物 400～800μM余量為DEPC水。
3.如權(quán)利要求2所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測試劑中還添加有終濃度為0.8活力單位/μL的RNA酶抑制劑RNasin。
4.如權(quán)利要求2所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測試劑中還添加有終濃度5mM的二巰基蘇糖醇。
5.如權(quán)利要求1所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP物質(zhì)的量1∶1∶1∶1的混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶用量為0.5～5酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。
7.如權(quán)利要求1所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄酶用量為6～300酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①M(fèi)-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；②AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
8.如權(quán)利要求1所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測試劑組成如下一步法RT-PCR buffer終濃度為1×二巰基蘇糖醇 5mMRNA酶抑制RNasin0.8活力單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針 0.28μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μM余量為DEPC水。
9.一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測方法，其特征在于所述的檢測方法以腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品為對照，采用待測病人的含漱液為分析樣本，所述方法步驟如下(1)取含漱液提取病毒RNA；(2)熒光PCR擴(kuò)增檢測取熒光擴(kuò)增檢測試劑與反應(yīng)所需的DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶配成反應(yīng)液，加入標(biāo)準(zhǔn)品與分析樣本的RNA分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光檢測；(3)結(jié)果分析選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3～15個循環(huán)的熒光信號；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)；熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，判斷為陽性；所述腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品部分序列為5’-CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAACCACCTGCTTTCAAGATACCGGTGATGCTAGTG-3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列5’-CTCAAGGACTRTYTGCYTCSTA-3’，下游引物序列5’-CTCTRGCATCACCGGTATCTTGAA-3’，所述特異性探針序列為5’-FAM-ACCACAACCACCTGC-NFQ-MGB-3’，其中FAM為報告熒光基團(tuán)，NFQ為非熒光淬滅基團(tuán)，MGB為修飾基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求9所述的腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測方法，其特征在于所述的方法取定量熒光擴(kuò)增檢測試劑配制反應(yīng)液，反應(yīng)體系每25μL組成如下一步法RT-PCR buffer 終濃度1×二巰基蘇糖醇 5mMRNA酶抑制劑RNasin0.8單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針 0.28μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各200μMAmpli TaqR DNA聚合酶2.5酶活力單位/反應(yīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 50酶活力單位/反應(yīng)分析樣本病毒RNA 5μLDEPC水補(bǔ)足至25μL；所述檢測方法步驟(2)PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2min，以95℃15s，60℃退火1min擴(kuò)增40個循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腮腺炎病毒熒光擴(kuò)增檢測試劑盒，包括腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品、熒光擴(kuò)增檢測試劑及DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶，所述熒光擴(kuò)增檢測試劑主要包括一步法RT－PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，所述腮腺炎病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品部分序列為5’－CTCAAGGACTGTTTGCCTCTTACACCACAAC CACCTGCTTTCAAGATACCGGTGATGCTAGTG－3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列5’－CTCAAGGACTR TYTGCYTCSTA－3’，下游引物序列5’－CTCTRGCAT CACCGGTATCTTGAA－3’，所述特異性探針序列為5’－FAM－ACCACAACCACCTGC－NFQ－MGB－3’，其中FAM為報告熒光基團(tuán)，NFQ為非熒光淬滅基團(tuán)，MGB為修飾基團(tuán)。所述檢測試劑盒可直接檢測病原體核酸，在腮腺炎發(fā)病早期，就可以檢測出是否含有腮腺炎病毒特異性基因，為及早隔離、確診和治療提供方便。
文檔編號G01N21/64GK1948507SQ200610051828
公開日2007年4月18日 申請日期2006年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者盧亦愚, 嚴(yán)菊英, 馮燕, 茅海燕, 徐昌平, 史雯 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心