專利名稱：：酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的制備的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑
技術領域：
。具體涉及一種酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的制備。
背景技術：
：1971年Engvall和Perlmann首次報道建立了酶聯(lián)免疫吸附檢測法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)，由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，已被廣泛應用于抗原、抗體、細胞因子以及生化物質(zhì)等的檢測。該方法的基本原理是把抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫學活性。將抗體或抗原與酶通過化學方法交聯(lián)成酶結合物，酶結合物既有抗體或抗原的免疫學活性又有酶的催化活性。檢測時，先把受檢標本與固相載體上的抗原或抗體反應，洗滌，去掉未反應的物質(zhì)，然后加入酶結合物進行反應，洗滌，再加入底物溶液及顯色劑反應，生成有色產(chǎn)物，最后加終止液終止反應。有色產(chǎn)物的吸光度(OD值)與受檢標本中的抗原或抗體量直接相關，從而可以根據(jù)OD值進行定性或定量分析。ELISA試劑的具體檢測方法很多，各種方法都不可缺少酶結合物。酶結合物在ELISA試劑中非常關鍵，其靈敏度、顯色背景和穩(wěn)定性對試劑質(zhì)量至關重要。高靈敏度、低顯色背景和良好的穩(wěn)定性是高品質(zhì)ELISA試劑所要達到的基本要求。酶結合物的靈敏度在很大程度上是由其自身的性質(zhì)決定的，但酶結合物所用稀釋液(酶稀釋液)對其靈敏度有一定的影響，酶稀釋液的良好與否還對酶結合物的穩(wěn)定性和顯色背景有非常明顯影響。因此，制備性能良好的酶稀釋液是ELISA試劑生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。常見的酶稀釋液一般使用緩沖系統(tǒng)(如PBS)、小牛血清(或牛血清白蛋白等)、防腐劑及表面活性劑等制備而成。但用該稀釋液制備的工作濃度酶結合物穩(wěn)定性較差，有效期很短。為了保持酶結合物的穩(wěn)定，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶結合物是以濃縮液的形式儲存的，當使用時用酶稀釋液作一定倍數(shù)稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，一般在28'C保存不超過一周。這樣，用戶使用比較麻煩，而且往往由于稀釋誤差造成實驗結果不準確。如何提高酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶結合物的穩(wěn)定性，又能方便檢驗人員的使用，是眾多診斷試劑制造商長期以來努力解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，通過改進酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶稀釋液來提高酶結合物的穩(wěn)定性，同時降低顯色背景，提高檢測靈敏度。本發(fā)明通過改變酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中的酶稀釋液的成分來提高酶結合物的穩(wěn)定性，使酶結合物能夠以工作濃度提供給用戶，方便用戶使用，同時降低顯色背景，提高檢測靈敏度。本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物的制備方法。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)酶稀釋液的組成成分，選擇了一種合適的酶保護劑一苦杏仁酸，加入到酶稀釋液中，顯著提高了酶結合物的穩(wěn)定性。將原來常用的防腐劑硫柳汞鈉換成了Proclin300(或者Proclin950)，后者的防腐性能明顯優(yōu)于前者，降低了酶稀釋液被微生物污染的風險，可以防止酶結合物因微生物污染而導致顯色異常降低或背景異常升高。將原來的表面活性劑吐溫20(Tween20)換成了曲拉通X-100(TritonX-100)，明顯降低了顯色背景。在酶稀釋液中加入了小牛血清，小牛血清是良好的蛋白保護劑，同時也減少了非特異性吸附。加入酚紅溶液，用以指示酶稀釋液的PH值在正常范圍。制備酶結合物時，將濃縮酶結合物以所需的比例(如1:1001:5000)加入到上述酶稀釋液中即可。新配方的酶稀釋液顯著提高了酶結合物的穩(wěn)定性，酶結合物能夠以工作濃度提供給用戶，在試劑盒保存條件下(28°C)—年內(nèi)保持穩(wěn)定。用戶可以直接使用不必臨時稀釋，同時降低了顯色背景，提高了檢測靈敏度。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物的制備方法包括下列步(1)配制0.05-0.2MPBS或0.01-0.2MTris-HCl緩沖液，pH值為6.57.4;(2)在該緩沖系統(tǒng)中加入苦杏仁酸，終濃度為0.2g/L~1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(3)加入Proclin300或Proclin950，終濃度為0.2g/L~1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(4)加入TritonX-100，終濃度為0.1ml/L~1.0ml/L，攪拌，使充分(5)加入酚紅1%無水乙醇溶液，終濃度為2ml/L10ml/L,攪拌，使充分溶解；(6)加入小牛血清，終濃度為200ml/L~400mlg/L，攪拌，使充分溶解；(7)最后用4MNaOH或4MHC1調(diào)pH值為6.57.4得到酶稀釋液；(8)將濃縮酶結合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。上述酶結合物為辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)與抗原或抗體通過化學交聯(lián)而成的復合物。本發(fā)明的有益效果(1)提高了酶結合物的穩(wěn)定性，在28TM呆存12個月保持穩(wěn)定。(2)酶結合物能夠以工作濃度提供給用戶，用戶可以直接使用不必臨時稀釋，方便操作、減少差錯。(3)降低了顯色背景，提高了檢測靈敏度。本發(fā)明酶結合物與傳統(tǒng)酶結合物比較數(shù)據(jù)以雙抗體夾心ELISA法檢測HBsAg為例，在已包被抗體的微孔板中加入經(jīng)系列稀釋的抗原，按照常規(guī)反應過程進行試驗，分別對比傳統(tǒng)酶結合物和本發(fā)明酶結合物，加顯色劑顯色，用2M硫酸溶液終止反應后，在酶標儀上比色，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例1:配制1L抗HBs-HRP酶結合物溶液(1)先加入約500ml蒸餾水，再依次加入下列試劑，待前一種溶解后再加入后一種；NaC18g;Na2HP0412H202.9g;KH2PO40.2g;KC10.2g;苦杏仁酸，0.3g;Proclin300，0.5ml;TritonX-100，0.3ml;酚紅(1%無水乙醇溶液)，5ml;小牛血清，200ml;待充分溶解后補足蒸餾水至1L，用4MNaOH或4MHCl調(diào)PH值為7.2。(2)將濃縮酶結合物以1:1000比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻。實施例2:用抗HBs-HRP酶結合物溶液(1:1000)檢測血清或血漿標本中的HBsAg。(1)在已包被抗HBs的微孔板中依次加入標本50ul，同時做兩孔陰性對照、一孔陽性對照、一孔空白對照，然后每孔(除空白對照孔外)加入本發(fā)明實施例1制備的抗HBs-HRP酶結合物溶液50ul，置37'C保溫30分鐘。(2)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次。(3)各孔加底物溶液50ul，顯色劑50ul，置37'C保溫15分鐘。(4)各孔加終止液50ul，終止反應。(5)將反應板置酶標比色計450nm波長處用空白孔校零，讀取各孔OD值。(6)計算，CutOff值-陰性對照平均OD值X2.1，陰性對照平均OD值小于0.05按0.05計算，大于等于0.05按實際OD值計算。(7)結果判斷標本OD值大于或等于CutOff值為陽性，小于CutOff值為陰性。權利要求1、一種酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)配制0.05-0.2MPBS或0.01-0.2MTris-HCl緩沖液，pH值為6.5～7.4；(2)在該緩沖系統(tǒng)中加入苦杏仁酸，終濃度為0.2g/L1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(3)加入Proclin300或Proclin950，終濃度為0.2g/L～1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(4)加入TritonX-100，終濃度為0.1ml/L～1.0ml/L，攪拌，使充分溶解；(5)加入酚紅1％無水乙醇溶液，終濃度為2ml/L～10ml/L，攪拌，使充分溶解；(6)加入小牛血清，終濃度為200ml/L～400mlg/L，攪拌，使充分溶解；(7)最后用4MNaOH或4MHCl調(diào)pH值為6.5～7.4得到酶稀釋液；(8)將濃縮酶結合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。2、如權利要求1一種酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的制備方法，其特征在于其中所述的酶結合物可以是辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶與抗原或抗體通過化學交聯(lián)而成的復合物。全文摘要本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的制備方法。本發(fā)明改進了酶稀釋液的配制成分，在酶稀釋液中加入了苦杏仁酸作為酶保護劑，改變了防腐劑及表面活性劑，將濃縮酶結合物按所需濃度加入到上述酶稀釋液中制備成酶結合物溶液。有效地增加了酶結合物的穩(wěn)定性，同時也降低了反應背景，提高了檢測的靈敏度。使酶結合物可以稀釋成工作液濃度提供給用戶，既方便了檢測人員的使用，又提高了檢測結果的準確性。文檔編號G01N33/535GK101101295SQ20061002862公開日2008年1月9日申請日期2006年7月5日優(yōu)先權日2006年7月5日發(fā)明者周興華申請人:上海華泰生物工程實業(yè)有限公司