專利名稱：量子點納米熒光探針聯(lián)合生物芯片尋找中藥靶點的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料、化工、藥學(xué)和生物的交叉領(lǐng)域，涉及一種通過納米技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合尋找中藥作用靶點的方法，尤其是通過量子點納米粒子的熒光在生物芯片上尋找中藥有效成分作用的靶蛋白的方法。
背景技術(shù)：
中藥在我國有著悠久的歷史，她凝聚了幾千年中華民族的傳統(tǒng)文化，為中華民族乃至全世界人民的健康和文明作出了巨大貢獻。千百年流傳下來的《黃帝內(nèi)經(jīng)》、《千方經(jīng)》、《本草綱目》等醫(yī)藥文獻所記載的各種中草藥及其配方在醫(yī)藥科技高度發(fā)達的今天仍然具有十分珍貴的參考價值。
然而，我國的中藥正面臨國際社會的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，中藥在國際市場競爭力比較弱，國際市場占有率僅約4％，這與我國中醫(yī)藥幾千年的悠久歷史很不相稱。限制中藥走向國際市場的重要因素之一便是中藥治療疾病的機理不清楚，很多中藥有效成分的作用靶點至今仍一無所知。中藥提取物往往是一個復(fù)雜的混合物，而且受產(chǎn)地和季節(jié)的影響，這些都導(dǎo)致其成為一種不夠精確的科學(xué)。要明確中藥治療疾病的分子機理，就必需須將先進的科學(xué)技術(shù)和手段引入我國傳統(tǒng)中藥，使中藥現(xiàn)代化。
多年來人們研究表明，大多數(shù)藥物是通過干涉細胞中的酶或受體的功能來實現(xiàn)其藥效的。酶或受體都是蛋白質(zhì)，在它們的表面有很多可被小分子占住的空位，當(dāng)小分子如同鎖的鑰匙一樣結(jié)合在酶或受體上的空位時，這些小分子即稱配體。當(dāng)一種藥物與配體具有相同或相似的形狀，則這種藥物便可以結(jié)合到酶或受體上，結(jié)合藥物的酶或受體將向細胞發(fā)送一個信號，使細胞發(fā)生一系列的生理反應(yīng)。結(jié)合藥物的酶或受體即為該藥物作用的直接靶點(靶蛋白)。當(dāng)藥物能結(jié)合的靶點是多個時，這種藥物可能就有副作用。上述藥物發(fā)生作用的過程同樣適用于中藥有效成分。研究中藥有效成分作用靶點，可闡明藥物作用的機理以及生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，進而可為中藥新藥篩選提供依據(jù)。
中藥提取物中具有藥效的有效成分的復(fù)雜性使中藥藥理研究比只有單一成分的合成藥物要復(fù)雜得多。要研究中藥復(fù)雜的混合物成分中每一種有效成分作用于細胞的靶點，其工作量是龐大的，甚至是不可能實現(xiàn)的。有幸的是，生物芯片技術(shù)和納米技術(shù)使該領(lǐng)域的難題出現(xiàn)了可以解決的曙光。
生物芯片具有高通量分析的特點，在揭示藥物作用的分子機理方面可顯示巨大的優(yōu)越性。如蛋白質(zhì)芯片，它是將蛋白質(zhì)探針高密度地固定在芯片上，這些蛋白質(zhì)可高度特異性地與靶分子結(jié)合。當(dāng)藥物直接與芯片上的蛋白質(zhì)發(fā)生作用，即可達到高通量而且快速地分析藥物作用的靶點，這是分析藥物作用靶點最直接的方法。對于中藥復(fù)雜的體系，可以在芯片上固定大量與中藥成分作用相關(guān)的蛋白質(zhì)(包括受體、抗體，等)，然后與中藥成分進行孵育，從而初步確定中藥成分作用靶點。但利用生物芯片研究藥物作用機制時，當(dāng)前使用較多的是基因芯片，如國內(nèi)有人采用小鼠8192點基因芯片研究了中藥復(fù)方對MRL/lpr狼瘡小鼠腎臟基因表達及Th1/TH2細胞因子比例的調(diào)節(jié)作用，實驗采用有機熒光染料Cy3和Cy5來檢測雜交結(jié)果。實驗表明，這種中藥復(fù)方能調(diào)節(jié)腎組織多個系統(tǒng)的基因表達，可糾正Th1/Th2細胞因子的比例失衡。(李非，等.利用基因芯片探討中藥復(fù)方對MRL/lpr狼瘡小鼠腎臟基因表達及Th1/TH2細胞因子比例的調(diào)節(jié)作用.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志.2003，23(3)198-206)這種采用基因芯片研究藥物作用機制的方法在國內(nèi)外均有較多的文獻報道，但這種方法不能明確藥物直接作用的受體。
此外，目前芯片上雜交信號的檢測大多是通過分析標(biāo)記在探針上的Cy3和Cy5的熒光來實現(xiàn)的，尤其是基因芯片廣泛采用這種熒光信號檢測。然而，這種熒光染料有較大缺陷，如熒光量子產(chǎn)率低；光學(xué)穩(wěn)定性差；對檢測系統(tǒng)的光學(xué)部分要求嚴(yán)格；激發(fā)光譜與發(fā)射光譜有較大重疊，給檢測帶來困難；難以對不同熒光探針用同一激發(fā)光激發(fā)，等。
雖然蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已比較成功地用于高通量的藥物篩選(我國蛋白質(zhì)芯片技術(shù)成功應(yīng)用于高通量藥物篩選.http://www.ebiotrade.com/newsf/2005-4/2005421100624.htm)，但未見有將量子點納米技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)芯片技術(shù)來尋找中藥靶點的實驗報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種尋找中藥有效成分作用靶點的簡便方法。本發(fā)明公開了上述尋找中藥有效成分作用靶點的方法，尤其是公開了量子點與中藥有效成分連接以形成一種“量子點-中藥有效成分”納米熒光探針，并將這種探針用于生物芯片以尋找藥物作用靶點的方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明將量子點納米粒子與中藥有效成分進行連接，形成一種“量子點-中藥有效成分”熒光探針，然后將這種熒光探針直接與生物芯片共孵育，經(jīng)過洗滌后，根據(jù)生物芯片上的量子點受光激發(fā)而發(fā)出的熒光來確定藥物與芯片上固定的已知生物之間特異性的結(jié)合位點(即靶點)，進而通過計算機軟件分析這些結(jié)合位點的蛋白。
以下對本發(fā)明的制備方法和應(yīng)用進一步說明，具體如下本發(fā)明通過共價鍵、配位鍵、氫鍵、靜電吸附中的任意一種或任意幾種的組合作用將量子點與中藥有效成分進行連接。獲得的產(chǎn)物通過分離純化以除去游離的中藥有效成分，然后將獲得的探針與生物芯片進行孵育。
或者采用硅烷偶連劑分子將量子點與中藥有效成分進行連接，然后將獲得的探針與生物芯片進行孵育。所述的硅烷偶連劑包括CH2＝CHSi(OC2H5)3，CH2＝CHSi(OCH3)2，CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3，CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3，HSC3H6Si(OCH3)3，H2NC3H6Si(OC2H5)3，H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3，H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3，CH3Si(OC2H5)3，(CH3)3SiNHSi(CH3)3，H2NC2H5Si(OC2H5)3中的任意一種；本發(fā)明所采用的量子點，其表面被含巰基、羧基、氨基、脛基、羥基、磺酸基中的一種或任意幾種組合基團的化合物所修飾。當(dāng)量子點修飾的化合物含羧基，同時中藥有效成分含氨基時，或者當(dāng)量子點修飾的化合物含氨基，同時中藥有效成分含羧基時，先采用1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3(3-dimethylamino propyl)-carbodiimide，EDC)活化羧基，然后通過羧基與氨基的反應(yīng)將量子點與中藥有效成分進行連接。將獲得的探針與生物芯片進行孵育。
上述連接過程是在水相、有機相或水與有機溶劑的混合液中進行的。
所述的蛋白質(zhì)芯片，其點樣區(qū)的蛋白質(zhì)是受體、抗體或特異性蛋白質(zhì)，尤其是指與待測藥物作用機理相關(guān)的受體、抗體或特異性蛋白質(zhì)。
所述的量子點是指半導(dǎo)體納米材料，尤其是指ZnS，CdS，HgS，ZnSe，CdSe，HgSe，CdTe，ZnTe，ZnO，PbSe，HgTe，CaAs，InP，InAs，InCaAs，CdS/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，CdTe/HgTe，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe，MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，SeTe，BaS，BaSe，BaTe，CdS∶Mn，ZnS∶Mn，CdS∶Cu，ZnS∶Cu，CdS∶Tb，ZnS∶Tb中的任意一種或任意幾種納米粒子的組合；以及由上述任意一種量子點為核、二氧化硅為殼的核-殼型納米復(fù)合粒子。
所述的中藥有效成分，是指從動物、植物或礦物中提取的任意單一化合物或任意兩種或多種化合物的混合物。這些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心腦血管藥理作用、抗愛滋病、抗衰老、治療糖尿病、治療前列腺疾病、抗老年癡呆、抗菌、治療消化道疾病、抗風(fēng)濕或類風(fēng)濕疾病、治療骨質(zhì)疏松或更年期綜合癥作用中的任意一種或任意幾種作用。
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明以量子點納米粒子替代傳統(tǒng)的熒光染料(如Cy3和Cy5)來標(biāo)記中藥有效成分，進而與生物芯片共孵育，以獲得藥物作用的直接靶點。量子點是指半導(dǎo)體納米微晶，尺度為十幾納米、幾納米或更小。與Cy3和Cy5等傳統(tǒng)的熒光染料相比，量子點具有很高的量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性，發(fā)射光譜狹窄，激發(fā)波長寬，可以使用同一波長的激發(fā)光同時進行多通道檢測。理論上，可將成千上萬種具有不同熒光顏色和熒光信號強度的量子點分別標(biāo)記成千上萬個不同的中藥有效成分，并在同一張生物芯片上同時進行孵育。將量子點代替?zhèn)鹘y(tǒng)熒光分子與生物芯片技術(shù)相結(jié)合，則不僅能顯著提高雜交信號的穩(wěn)定性，增強雜交信號的強度，而且還可以達到雙高通量檢測的效果。本發(fā)明對于闡明中藥有效成分作用靶點和對中藥新藥進行篩選具有重要的實際意義。
本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進步，量子點納米粒子優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)克服了傳統(tǒng)有機熒光染料的不足，將量子點與中藥有效成分進行連接，并與蛋白質(zhì)芯片共孵育，可直接獲得中藥有效成分作用的靶點，在研究中藥藥理和篩選中藥新藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
實施例1向50ml濃度約為10nM的CdSe(590)(自制)(590是指CdSe的發(fā)射光譜的峰位位于590nm)納米粒子水溶液中加入300μl含27％(v/v)無水乙醇(購于上海東懿化學(xué)試劑公司)的正硅酸乙酯(購于中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑公司)的混合液以及20μl氨水，反應(yīng)2-3天后，獲得仍然澄清透明的溶液，取部分樣品冷凍干燥后經(jīng)過X-射線衍射(XRD)和X-射線能譜(XPS)分析，結(jié)果表明CdSe表面已包被二氧化硅，即形成了CdSe/SiO2。(在制備CdSe/SiO2時應(yīng)控制正硅酸乙酯、無水乙醇以及氨水的用量，否則會引起粒子聚集。)將CdSe/SiO2加入到無水乙醇與硅烷偶連劑H2NC2H5Si(OC2H5)3(購于中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑公司)溶液中(反應(yīng)體系中，CdSe/KH550＝10∶1.5，無水乙醇/水＝10)，于60□反應(yīng)2h，得到表面連接硅烷偶連劑的CdSe/SiO2納米粒子。然后加入適量戊二醛，并于室溫下攪拌反應(yīng)3-4h，然后加入天花粉蛋白(CdSe與天花粉蛋白的摩爾比約為1∶10)，于4℃反應(yīng)過夜。分離游離的蛋白，即獲得由共價結(jié)合的方法得到的“CdSe/SiO2-蛋白”的納米復(fù)合粒子。紅外光譜和紫外吸收光譜檢測表明，反應(yīng)獲得的樣品的紅外光譜和紫外吸收光譜均有蛋白的特征峰，但峰均比較弱，表明CdSe/SiO2表面已連接了一定量的蛋白藥物。該反應(yīng)條件控制較苛刻，否則會引起粒子明顯聚集。
實施例2將丹酚酸B(江西本草天工科技有限公司)溶于pH7的PBS緩沖液中，加入1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(購于中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑公司)，室溫反應(yīng)1h，然后加入表面修飾巰基乙胺的量子點CdSe/ZnS(590)(自制)納米粒子水溶液，室溫反應(yīng)過夜，通過氨基與羧基的共價反應(yīng)將量子點與藥物連接。反應(yīng)液中，CdSe/ZnS約為50nM，CdSe/ZnS、丹酚酸B和EDC的摩爾比約為1∶100∶120。通過凝膠柱分離除去游離的丹酚酸B和EDC，即獲得“CdSe/ZnS-丹酚酸B”的連接產(chǎn)物。該產(chǎn)物在488nm波長的光激發(fā)下發(fā)射與CdSe/ZnS相同的熒光，即紅色熒光。毛細管電泳實驗表明，“CdSe/ZnS-丹酚酸B”的電泳速度比CdSe/ZnS的電泳速度約慢1min，表明丹酚酸B已經(jīng)連接在CdSe/ZnS上。
實施例3“量子點-丹酚酸B”納米探針與蛋白質(zhì)芯片共孵育本工作選用試劑盒中的蛋白質(zhì)芯片(數(shù)康生物技術(shù)有限公司)，這種芯片雖然不是針對本實驗特別設(shè)計的，但其表面固定多種特異性抗原，它們在正常細胞和腫瘤細胞表面尤其是腫瘤細胞表面表達水平較高。實驗按試劑盒方法操作，“量子點-丹參酸乙”納米探針溶液與芯片在37℃下孵育30-40min后，洗滌，激光共聚焦掃描分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芯片上有少量熒光點，說明丹酚酸B有可能作用于多種腫瘤細胞表面抗原。
權(quán)利要求
1.一種量子點納米熒光探針聯(lián)合生物芯片尋找中藥靶點的方法，其特征在于采用以下步驟將量子點與中藥有效成分進行連接，形成一種“量子點-中藥有效成分”熒光探針，然后將這種熒光探針直接與生物芯片共孵育，經(jīng)過洗滌后，根據(jù)生物芯片上的量子點受光激發(fā)而發(fā)出的熒光來確定藥物與芯片上固定的已知生物之間特異性的結(jié)合位點，進而通過計算機軟件分析這些結(jié)合位點的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過共價鍵、配位鍵、氫鍵、靜電吸附中的任意一種或任意幾種的組合作用將量子點與中藥有效成分進行連接；獲得的產(chǎn)物通過分離純化以除去游離的中藥有效成分，即得到“量子點-中藥有效成分”納米熒光探針，然后將這種探針與生物芯片進行孵育。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用硅烷偶連劑分子將量子點與中藥有效成分進行連接，然后將獲得的探針與生物芯片進行孵育；所述的硅烷偶連劑包括CH2＝CHSi(OC2H5)3，CH2＝CHSi(OCH3)2，CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3，CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3，HSC3H6Si(OCH3)3，H2NC3H6Si(OC2H5)3，H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3，H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3，CH3Si(OC2H5)3，(CH3)3SiNHSi(CH3)3，H2NC2H5Si(OC2H5)3中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，“量子點-中藥有效成分”納米熒光探針的制備，其特征在于所述的量子點，其表面被含巰基、羧基、氨基、脛基中的一種或任意幾種組合基團的化合物所修飾；當(dāng)量子點修飾的化合物含羧基，同時中藥有效成分含氨基時，或者當(dāng)量子點修飾的化合物含氨基，同時中藥有效成分含羧基時，先采用1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽活化羧基，然后通過羧基與氨基的反應(yīng)將量子點與中藥有效成分進行連接；將獲得的探針與生物芯片進行孵育。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述連接過程是在水相、有機相或水與有機溶劑的混合液中進行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4中任一所述的方法，其特征在于所述連接過程是在水相、有機相或水與有機溶劑的混合液中進行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物芯片是蛋白質(zhì)芯片，其點樣區(qū)的蛋白質(zhì)是受體、抗體或特異性蛋白質(zhì)，尤其是指與待測藥物作用機理相關(guān)的受體、抗體或特異性蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述的量子點是半導(dǎo)體納米材料，包括ZnS，CdS，HgS，ZnSe，CdSe，HgSe，CdTe，ZnTe，ZnO，PbSe，HgTe，CaAs，InP，InAs，InCaAs，CdS/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，CdTe/HgTe，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe，MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，SeTe，BaS，BaSe，BaTe，CdS:Mn，ZnS:Mn，CdS:Cu，ZnS:Cu，CdS:Tb，ZnS:Tb中的任意一種或任意幾種納米粒子的組合；以及由上述任意一種量子點為核，二氧化硅為殼的核-殼型納米復(fù)合粒子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述的中藥有效成分，是指從動物、植物或礦物中提取的任意單一化合物或任意兩種或多種化合物的混合物，這些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心腦血管藥理作用、抗愛滋病、抗衰老、治療糖尿病、治療前列腺疾病、抗老年癡呆、抗菌、治療消化道疾病、抗風(fēng)濕或類風(fēng)濕疾病、治療骨質(zhì)疏松或更年期綜合癥作用中的任意一種或任意幾種作用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的中藥有效成分，是指從動物、植物或礦物中提取的任意單一化合物或任意兩種或多種化合物的混合物，這些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心腦血管藥理作用、抗愛滋病、抗衰老、治療糖尿病、治療前列腺疾病、抗老年癡呆、抗菌、治療消化道疾病、抗風(fēng)濕或類風(fēng)濕疾病、治療骨質(zhì)疏松或更年期綜合癥作用中的任意一種或任意幾種作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種量子點納米技術(shù)結(jié)合生物芯片技術(shù)尋找中藥有效成分作用靶點的方法，屬于材料、化工、藥學(xué)和生物的交叉領(lǐng)域。本發(fā)明將量子點與中藥有效成分進行連接，形成一種“量子點－中藥有效成分”熒光探針，然后將這種熒光探針直接與生物芯片共孵育，經(jīng)過洗滌后，根據(jù)生物芯片上量子點受光激發(fā)而發(fā)出的熒光來確定藥物與芯片上固定的已知蛋白質(zhì)之間特異性的結(jié)合位點(即靶點)，進而通過計算機軟件分析這些結(jié)合位點的蛋白。本發(fā)明可簡便、快速地尋找中藥有效成分對細胞產(chǎn)生藥效的靶蛋白，可為研究中藥藥理和高通量地篩選中藥新藥提供高效的技術(shù)手段。
文檔編號G01N33/50GK101034060SQ20061002456
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者儲茂泉 申請人:同濟大學(xué)