專利名稱：中國(guó)人2型糖尿病血清標(biāo)志物的檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2型糖尿病的一種血清標(biāo)志物，該血清標(biāo)志物為載脂蛋白apolipoprotein A-I，即載脂蛋白A的I亞型。本發(fā)明還涉及利用所鑒別的標(biāo)志物apolipoprotein A-I，以及其在病人體內(nèi)出現(xiàn)的表達(dá)水平的改變而設(shè)計(jì)的檢測(cè)試劑盒。更進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及該血清標(biāo)志物在糖尿病診斷中的作用，以及作為糖尿病治療藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。
背景技術(shù)：
眾所周知，2型糖尿病是一種多基因控制的復(fù)雜性狀疾病，有著明顯的遺傳傾向。目前認(rèn)為參與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、糖原合成途徑、脂肪酸的吸收和合成、脂細(xì)胞分化途徑的有關(guān)蛋白質(zhì)分子都可能與糖尿病的發(fā)生相關(guān)。研究糖尿病發(fā)病機(jī)理，闡明分子機(jī)制、鑒定血糖調(diào)節(jié)基因及其功能的研究對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療均有十分重要的意義。其中，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑是目前研究較多的一個(gè)領(lǐng)域，該途徑十分復(fù)雜，包括胰島素受體、胰島素受體底物等，并和Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑、CAP/Cb1信號(hào)傳導(dǎo)途徑等聯(lián)系在一起。胰島素受體屬于受體酪氨酸激酶，包括IGF-I和IRR。目前至少鑒定了9個(gè)胰島素受體激酶底物，其中包括4個(gè)胰島素受體底物IRS1、IRS2、IRS3和IRS4。胰島素受體底物(IRS)具有高度同源性，但是作用各異，相互補(bǔ)充。IRS-1基因敲除小鼠表現(xiàn)為出生前和出生后生長(zhǎng)遲緩，胰島素耐受，葡萄糖耐受受損等癥狀。IRS-2基因敲除小鼠表現(xiàn)為在肝臟等組織胰島素耐受以及包括腦組織等多個(gè)區(qū)域生長(zhǎng)缺陷，最終發(fā)展成2型糖尿病。
目前，糖尿病的診斷主要是依賴測(cè)定血糖水平，糖耐量能力和胰島素水平。由于80％以上的早期糖尿病病人沒有明顯的癥狀，往往導(dǎo)致延誤了糖尿病的預(yù)防和及時(shí)治療。因此，尋找簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確有效的新的糖尿病早期診斷的方法對(duì)于糖尿病的預(yù)防和治療都有極為重要的意義。
2型糖尿病是一種多基因遺傳病。伴隨著2型糖尿病病程的發(fā)生和發(fā)展，各種癥狀和并發(fā)癥逐一出現(xiàn)和產(chǎn)生。而實(shí)際上，遠(yuǎn)在各種癥狀為病人自身所察覺之前，與這些癥狀出現(xiàn)相關(guān)的蛋白的表達(dá)水平就已經(jīng)出現(xiàn)了變化。2型糖尿病的早期診斷就包括對(duì)這些相關(guān)蛋白的正確檢測(cè)，它能有效地幫助糖尿病的預(yù)防和治療，提高糖尿病人的生活質(zhì)量。因此，尋找和鑒定2型糖尿病的蛋白標(biāo)志物有著極大的實(shí)用價(jià)值。
蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的發(fā)展與基因組計(jì)劃的完成，使得“蛋白質(zhì)組學(xué)”這一全新的研究領(lǐng)域得以誕生和發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)是在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上研究蛋白質(zhì)的表達(dá)與功能的科學(xué)。它的出現(xiàn)為我們進(jìn)一步了解整個(gè)生物體系提供了一種可靠的方法。用于檢測(cè)蛋白表達(dá)的二維電泳技術(shù)(2DE，two-dimensional polyacrylmide gel electrophoresis)和用于蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜技術(shù)(MS，mass spectrometry)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生了至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化是機(jī)體在出現(xiàn)病變之后產(chǎn)生的反應(yīng)的一部分。這包括對(duì)蛋白質(zhì)合成速度的調(diào)控，在翻譯水平的基因表達(dá)調(diào)控，蛋白的翻譯中和翻譯后的共價(jià)修飾(如磷酸化，?；蛱腔?以及蛋白質(zhì)的降解速度。因而，對(duì)整體蛋白質(zhì)組的研究就反映了環(huán)境條件的變化，包括復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)多級(jí)調(diào)控的蛋白質(zhì)濃度的變化(如mRNA合成，翻譯，修飾，轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白水解過程和降解)?？梢哉f，蛋白質(zhì)組的比較研究有助于理解細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。所以，它是疾病標(biāo)志物鑒別，藥物靶標(biāo)確認(rèn)，藥物的行為機(jī)理研究和藥理學(xué)推理的有用工具。
將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于疾病生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)的檢測(cè)已經(jīng)取得了令人矚目的成績(jī)。在用CyA處理產(chǎn)生腎毒的大鼠腎臟中發(fā)現(xiàn)28kD蛋白calbindin-D持續(xù)減少(Benito et al.，1995；Steiner et al.)，并且同時(shí)伴隨著尿鈣排泄物和皮層脊髓管內(nèi)石灰化的增加(Aicher et al.)。另一個(gè)生物標(biāo)記蛋白的成功鑒別的例子來自膀胱鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)程的長(zhǎng)期研究(Celis et al.1998)。
在臨床診斷中，血清作為最易采集的樣品而備受關(guān)注。越來越多的研究者將目光集中到應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)手段在血清中尋找潛在的疾病標(biāo)志物。血清中存在著豐富的蛋白，攜帶了非?？少F的信息。但是，血清中存在的白蛋白占到所有蛋白的80％以上，這就干擾了其他低豐度蛋白的分離和鑒定。迄今為止，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)手段尋找糖尿病的血清標(biāo)志物的工作還十分少見。
本發(fā)明人收集臨床確診的散發(fā)性2型糖尿病人血清和正常人血清，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，通過雙向電泳比對(duì)膠圖得到在2型糖尿病中有差異表達(dá)情況的蛋白點(diǎn)，然后利用質(zhì)譜的方法確定蛋白種類，最后采用該蛋白的特異性抗體在病人和正常人血清中通過酶連免疫的方法對(duì)這種蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步驗(yàn)證確定。最終，本發(fā)明人確定了一種2型糖尿病的血清標(biāo)志物apolipoprotein A-I，并在此基礎(chǔ)上完成了此項(xiàng)發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明人提供了一個(gè)可用于檢測(cè)2型糖尿病生物標(biāo)志物的試劑盒。該試劑盒包含針對(duì)apolipoprotein A-I的抗體和正常的應(yīng)用酶連免疫吸附檢測(cè)血清中蛋白水平的試劑盒所含的常規(guī)組件。
在此，本發(fā)明人提供了一個(gè)2型糖尿病的血清標(biāo)志物。本發(fā)明涉及一種多肽分子，名為apolipoproteinA-I，即載脂蛋白A的I亞型。
本發(fā)明還涉及針對(duì)該多肽分子的抗體，包括能識(shí)別整體分子，該分子某一結(jié)構(gòu)域以及某一個(gè)或幾個(gè)特異的抗原決定簇的所有抗體。
更進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及apolipoprotein A-I在制備用于2型糖尿病診斷的診斷劑中的應(yīng)用，以及作為潛在的藥物靶點(diǎn)制備2型糖尿病的治療藥物中的應(yīng)用。
定義疾病血清標(biāo)志物(biomarker)是指在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中，由于疾病所引起的生理上的變化，如糖代謝或脂代謝的異常，而造成的某些分子，特別是蛋白分子的表達(dá)異常。這些出現(xiàn)表達(dá)異常的蛋白分子往往可以作為這些疾病診斷標(biāo)志物，應(yīng)用于臨床。能在血清中出現(xiàn)并被檢測(cè)的就被稱為血清標(biāo)志物。通過對(duì)這些標(biāo)志物的研究，還可以進(jìn)一步聯(lián)系疾病的發(fā)生機(jī)理，研究和涉及疾病治療的新途徑。
肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprint)MALDI-TOF分析可產(chǎn)生肽質(zhì)量指紋圖譜。通過與序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論肽譜和斷裂譜比較，可以鑒定所檢測(cè)樣品的確切身份。
載脂蛋白(apolipoprotein，Apo)是一類能與血漿脂質(zhì)(主要是指膽固醇、甘油三酯和磷脂)結(jié)合的蛋白質(zhì)，為構(gòu)成血漿脂蛋白的主要成份。在體內(nèi)載脂蛋白具有許多重要的生理功能，如作為配基與脂蛋白受體結(jié)合、激活多種脂蛋白代謝酶等?，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到載脂蛋白不僅對(duì)血漿脂蛋白的代謝起著決定性的作用，而且對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展亦有很大的影響。
蛋白質(zhì)組(proteome)是指一個(gè)細(xì)胞和組織基因組所表達(dá)的全部蛋白。由于同一基因組在不同細(xì)胞和不同組織中的表達(dá)情況各不相同，即使是同一個(gè)細(xì)胞或組織，在不同的發(fā)育階段和不同的生理，病理?xiàng)l件下，或是不同環(huán)境因子的影響下，蛋白質(zhì)的表達(dá)和存在狀態(tài)都不相同。因此，蛋白質(zhì)組是一個(gè)在時(shí)間和空間上動(dòng)態(tài)變化的概念。蛋白質(zhì)組學(xué)是應(yīng)用各種方法和手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新的學(xué)科。通過從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成，表達(dá)水平，修飾狀況以及蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用，從而了解蛋白質(zhì)的功能及其在生命過程中的作用。目前比較成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)是以雙向電泳為代表的分離技術(shù)和以質(zhì)譜為核心的鑒定技術(shù)
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，通過比對(duì)2型糖尿病病人和正常人血清中蛋白的表達(dá)情況，確定載脂蛋白AI為一種與2型糖尿病相關(guān)的差異表達(dá)的蛋白。載脂蛋白AI(Apolipoprotein A-I，APO-AI)是一種主要在肝臟和小腸中合成的分泌型蛋白，其大小為267個(gè)氨基酸(根據(jù)NCBI網(wǎng)上蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的報(bào)道)，屬于載脂蛋白A/E家族。APO-AI是血漿高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)的主要成分。該蛋白影響膽固醇脂從組織向肝臟的流動(dòng)和排出。同時(shí)，它也是卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterolacyltransferase，LCAT)的輔助因子之一，幫助了血漿中大部分膽固醇脂糜的形成。在第11號(hào)染色體上，該基因與其他兩種載脂蛋白基因緊密相聯(lián)，該基因的缺陷會(huì)引起許多疾病。經(jīng)NCBI檢索獲悉APO-AI的缺陷是2型高密度脂蛋白缺陷癥(high density lipoprotein deficiency type 2，HDLD2)，也即家族性低脂蛋白血癥(familial hypoalphalipoproteinemia，F(xiàn)HA)的主要原因之一。它表現(xiàn)為常染色體的顯性遺傳。同時(shí)，APO-AI的缺陷是臨床上I型高密度脂蛋白缺陷癥(high density lipoproteindeficiency type 1，HDLD 1)，也即丹吉爾病(Tangier disease，TGD)所表現(xiàn)出的HDL水平偏低的主要原因。HDLD 1是一種以高密度脂蛋白缺乏，膽固醇脂的聚集，肝脾腫大，以及早發(fā)性的冠心病為主要特征的隱性紊亂癥。在HDLD 1患者體內(nèi)，APO-AI從HDL中的缺失很可能是將APO-AI前體轉(zhuǎn)化入正常代謝鏈的失敗，包括轉(zhuǎn)化為正常生物酶能力的缺失或是特異性的結(jié)構(gòu)的損傷(如在丹吉爾癥中)。由此可見，APO-AI與體內(nèi)的脂代謝密切相關(guān)，而2型糖尿病的許多常見的并發(fā)癥都是以脂代謝異常為特征的。綜上，我們提出作為一種血清中可檢測(cè)的分泌蛋白，APO-AI可作為2型糖尿病的血清標(biāo)志物，用于制備一種新型的檢測(cè)和診斷試劑盒。
實(shí)施例1 雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用分析糖尿病人和正常人血清中的差異表達(dá)蛋白1、中國(guó)漢族人群2型糖尿病患者及正常對(duì)照標(biāo)本的收集本發(fā)明所用2型糖尿病組和正常組人群外周血樣(10ml)主要來自北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科門診。糖尿病病例可為散發(fā)，也可為糖尿病家系的成員(但此時(shí)每一家系中通常只有一個(gè)患者入選，同一家系中沒有任何血緣關(guān)系的成員可以選擇一個(gè)以上)；正常對(duì)照來自正常人群，要求其家庭三代以內(nèi)沒有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，對(duì)照組與患病組年齡及性別相匹配。
2型糖尿病的診斷嚴(yán)格按照WHO于1985年頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。即空腹血葡萄糖濃度≥7.8mmol/L或餐后2小時(shí)血糖≥11.1mmol/L為糖尿病。OGTT的判斷標(biāo)準(zhǔn)為服糖后2小時(shí)血葡萄糖濃度＜7.8mmol/L為正常，≥11.1mmol/L為糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之間為糖耐量低減(impaired glucose tolerance，IGT)。
入選的每個(gè)成員記錄一般情況，包括性別、出生年月、籍貫、身高、體重、心率、呼吸、血壓等項(xiàng)目，調(diào)查并在必要時(shí)行特殊檢查，以排除合并有高血壓、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。除上述項(xiàng)目外，對(duì)糖尿病患者還記錄發(fā)病年齡、既往最高體重、血脂、糖化血紅蛋白及糖尿病并發(fā)癥等項(xiàng)目，對(duì)正常對(duì)照組還測(cè)量空腹血糖并排除有糖尿病家族史者。
采集血樣前確保所有成員都了解采血目的，即有知情權(quán)，并在“知情同意書”上簽字。將收集的資料嚴(yán)格保密，不對(duì)外公布供血成員的姓名、年齡、疾病等所有資料。
2.血清樣品的處理，去除血清中的白蛋白和Ig-G將收集到的血清樣品過柱，去除血清中的白蛋白和Ig-G。首先，用10mM Tris-HCl pH 7.4(血清bind buffer)溶液平衡柱料。將柱料中的溶液成分甩干后，在eppendorf管中稱取0.02克的干柱料。然后，將25ul的血清以1∶3的比例，用10mM Tris-HCl pH 7.4溶液稀釋，加入到盛有柱料的eppendorf管中，搖床上振蕩40分鐘。接著，離心收集上清。同時(shí)，用10mM Tris-HCl pH 7.4溶液平衡Protein A，離心后稱取0.04克的干柱料Protein A，與上述血清混合，搖床上振蕩結(jié)合40min。再次離心收集上清，即可測(cè)定蛋白濃度，準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)的雙向電泳。
3.血清樣品進(jìn)行第一向的等電聚焦(IEF)預(yù)先將所需長(zhǎng)度和數(shù)量的strip holder用軟毛牙刷和專用洗液徹底清洗并晾干。準(zhǔn)備泡脹液取出1ml分裝的泡脹液，在其中加入與選定strip的pH梯度相同的IPG Buffer 5ul(終濃度0.5％)和DTT 3mg，混勻。接著，按所選擇的strip長(zhǎng)度、pH梯度范圍和樣品的具體情況選擇上樣量；按所選擇的strip長(zhǎng)度確定樣品與泡脹液的總量，將上樣液小心均勻滴加至strip holder中，將二者充分混勻，注意盡量不要產(chǎn)生氣泡。然后，取出一條所需長(zhǎng)度和pH范圍的IPG strip，從酸性端(即尖端)剝離膠面的保護(hù)膜，用鑷子或用手持住strip兩端，慢慢放入strip holder中，并前后上下移動(dòng)幾次，以確保上樣液在holder中分布均勻，在整個(gè)過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。放好strip后，在上面覆蓋一層cover fluid，以避免上樣液的蒸發(fā)和尿素析出。蓋好holder上蓋，將holder置于IPGphor的電極板上，借助直尺保持holder方向與電極平行，并確保holder的兩個(gè)電極都與電極板接觸。最后，根據(jù)strip的長(zhǎng)度和pH范圍設(shè)定IEF電泳參數(shù)，進(jìn)行等電聚焦。在電泳進(jìn)行中隨時(shí)監(jiān)測(cè)電壓的情況，若電壓達(dá)不到規(guī)定要求，則要適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間，以達(dá)到所要求的伏小時(shí)數(shù)。電泳結(jié)束后，將strip取出，進(jìn)行平衡或置于塑料管內(nèi)-80℃保存。
IEF電泳結(jié)束后，將strip取出，膠面朝上置于干燥濾紙上。另取一張稍稍潤(rùn)濕的厚濾紙，覆蓋在strip上，輕按幾下，吸去上面吸附的油滴。同時(shí)，取所需體積的平衡液，每10ml加入100mg DTT，使其充分溶解。將strip條放入盛有所需體積平衡液的管中，支持膜面貼管壁，在搖床中振搖15min。然后，取出strip條，用蒸餾水沖洗幾次。接著，取所需體積的平衡液，每10ml加入250mg碘代乙酰胺，使其充分溶解。將strip條放入盛有所需體積平衡液的管中，支持膜面貼管壁，在搖床中振搖15min。將strip取出，膠面朝上置于干燥濾紙上，吸去支持膜上的水分，將strip側(cè)面在濾紙上蘸一下，吸去膠面的水分。這時(shí)就可以準(zhǔn)備進(jìn)行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。
4.血清樣品進(jìn)行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)聚丙烯酰胺凝膠的配制將模具傾斜放置，將所需玻璃板放入其中，其余位置用擋板填充，各對(duì)玻璃板之間用塑料隔片隔開，最后再放入幾片隔片以充分占據(jù)模具內(nèi)的空間，蓋上外蓋，將螺絲擰緊。配制足夠量的膠液。預(yù)備好足量的替換液。在灌膠口上插入漏斗，將膠液倒入至接近所需高度，迅速倒入替換液，使替換液沒過V型槽。用移液槍在玻璃板上端加入一薄層水飽和的正丁醇。待膠聚合完全(約1小時(shí)后)，將模具拆開，小心取出玻璃板，去除粘在玻璃板外壁的凝膠，棄去上端的正丁醇，用蒸餾水沖洗多次，用濾紙吸干多余的水，即可進(jìn)行電泳。
進(jìn)行第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳將電泳槽后端的撥動(dòng)開關(guān)撥至循環(huán)位置，將約10升電泳緩沖液注入電泳槽內(nèi)。將玻璃板上端加滿融化的封膠液，將平衡好的IPG膠條放入，使其與膠上端充分接觸。待封膠液完全凝固，將玻璃板和擋板放入電泳槽中，放入時(shí)最好先將玻璃板用電泳液潤(rùn)滑一下。接下來設(shè)置電泳參數(shù)，一般采用恒功率電泳，即將電壓與電流都設(shè)為最大，只控制功率的大小。然后合上上蓋，開始電泳，一般約需5-7小時(shí)。待電泳結(jié)束后，用取膠器將玻璃板取出，小心打開玻璃板，取出凝膠，進(jìn)行染色。
5.膠圖的染色和分析膠圖染色-銀染小心取下電泳凝膠，固定30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。固定液為40％乙醇10％冰醋酸。然后致敏30分鐘，溶液為75ml乙醇，17g乙酸鈉，28.2g三水乙酸鈉，0.5g硫代硫酸鈉加水到終體積250ml。接著，水洗凝膠3次，每次10分鐘。取0.625g AgNO3，100ul 37％甲醛加水到終體積250ml混合均勻。在染液中進(jìn)行銀染20分鐘。然后水洗兩次，每次1分鐘注意把握時(shí)間，水洗時(shí)間長(zhǎng)顯色速度慢，點(diǎn)的顏色偏黃色。顯色液為6.25g Na2CO3，50ul 37％甲醛加水到終體積250ml。顯色時(shí)注意觀察，根據(jù)顯色的情況確定顯色時(shí)間。最后，在終止液中終止反應(yīng)10分鐘。終止液為3.65g EDTA.Na2.2H2O或者1g甘氨酸加水到終體積250ml。
膠圖分析掃描膠圖，根據(jù)染色的深淺和蛋白點(diǎn)的大小處理分析蛋白表達(dá)量的大小。比對(duì)2型糖尿病病人和正常對(duì)照組得到的蛋白點(diǎn)的差異，確定有表達(dá)量差異變化的蛋白點(diǎn)。在此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白點(diǎn)在糖尿病人和正常人的電泳膠圖中出現(xiàn)了表達(dá)量的顯著變化，在糖尿病人血清中表達(dá)量升高，為糖尿病人血清中表達(dá)量的4倍以上。
6.膠圖中差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析鑒定膠內(nèi)消化小心割取有表達(dá)量差異的蛋白膠點(diǎn)，置于潔凈Eppendorf管中，同時(shí)準(zhǔn)備陰陽(yáng)性對(duì)照。用50μl Milli-Q H2O洗兩次，每次5分鐘，棄去上層清液。用銀染脫色液洗兩次，每次30分鐘，棄去上層清液，直到顏色消失。為30mM鐵氰酸鉀，銀染脫色液B為100mM硫代硫酸鈉。將5×的銀染脫色液A 50ml與5×的銀染脫色液B 50ml混合后補(bǔ)水到500ml，混勻備用。然后，用50μl ACN脫水20分鐘，使膠變成不透明；棄去上層清液，在真空濃縮離心機(jī)中干燥膠條。接下來，加入適量的含10mM DTT的25mM NH4HCO3，以沒過膠條為準(zhǔn)，置于56℃水浴1小時(shí)。取出膠條，使其溫度緩降到室溫。棄去上層液，加入適量的含55mM IAM的25mM NH4HCO3浸沒膠條，置于黑暗處45分鐘。再次棄去上層液，依次用25mMNH4HCO3、50％ACN、ACN洗一次，每次10分鐘，棄去上層液。重復(fù)這步操作一次。再接下來，在真空濃縮離心機(jī)中干燥膠條。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需用量，取適量的Trypsin按使用說明書溶解為Trypsin原液。再根據(jù)消化樣品的數(shù)量，Trypsin原液(0.1mg/mL)按1∶40(質(zhì)量比)(trypsin蛋白量)加入，用25mM NH4HCO3稀釋為Trypsin工作液。每管加入適量(以沒過膠粒為準(zhǔn))Trypsin工作液，放置20分鐘，使Trypsin完全滲入膠內(nèi)。接著，加入25mM NH4HCO310-20μl，使溶液完全浸沒膠；置于37℃水浴酶解4-6小時(shí)。向管中加入3倍消化液體積67％ACN，使終濃度達(dá)到50％ACN，2.5％TFA，水浴30分鐘-1小時(shí)，每10分鐘振蕩一次。最后，將樣品在真空濃縮離心機(jī)中濃縮至5-10μl，-20℃或-80℃下保存。
MALDI-TOF質(zhì)譜分析吸取0.5ul基質(zhì)溶液點(diǎn)在MALDI樣品靶上，在其未干之前立即加入0.5ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)品到基質(zhì)中。室溫下使溶劑揮發(fā)至少15分鐘，然后將樣品靶轉(zhuǎn)入質(zhì)譜儀的真空室中。接著，先用超過離子化域值較多的激光強(qiáng)度獲得初步質(zhì)譜，然后降低激光強(qiáng)度同時(shí)調(diào)整電壓等一系列參數(shù)使質(zhì)譜結(jié)果優(yōu)化，并用標(biāo)準(zhǔn)品校正質(zhì)譜儀。重復(fù)以上操作，獲取未知樣品的質(zhì)譜圖，并進(jìn)一步用質(zhì)譜圖中的胰酶峰(2163.05，2273.15)做內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜圖。由此，根據(jù)質(zhì)譜得到的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprint)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，本發(fā)明人確定，在雙向電泳中出現(xiàn)的差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)為apolipoprotein A-I，即載脂蛋白A的I亞型。
實(shí)施例2 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法在2型糖尿病病人和正常人血清中檢測(cè)該蛋白的表達(dá)水平1)血清包被 將PBS稀釋(1∶1000至1∶10000)的血清加入酶標(biāo)孔中100μl/孔，4℃包被過夜2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白包被 將PBS梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白加入酶標(biāo)孔中100μl/孔4℃包被過夜3)封閉 將脫脂奶粉溶于PBS配成5％的封閉液，倒掉包被液，按200μl/孔加入封閉液，37℃，2h。倒掉封閉液，如不馬上使用可在超凈臺(tái)中吹干，用膠帶封好，4℃保存。
4)將稀釋好的抗apolipoprotein A-I抗體(純化的IgG、血清、腹水等)加入酶標(biāo)孔，100μl/孔，4℃過夜，或37℃，3-4h。
5)倒掉一抗，用PBST(即含0.1％ Tween 20的PBS)洗孔3次，加入用PBS-T配制的HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(按廠家推薦稀釋)，37℃，1-2h。
6)PBS-T洗孔3次，加入鄰苯二胺顯色液，100μl/孔，37℃，30min，加2M硫酸終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測(cè)定OD492(490)。
7)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白所得到的OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每一血清樣品的蛋白含量。
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>中國(guó)人2型糖尿病血清標(biāo)志物的檢測(cè)試劑盒<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>267<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser1 5 1015Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp2025 30
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp35 40 45Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys50 55 60Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr65 70 7580Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp85 90 95Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys100105 110
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe115 120 125Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu130 135 140Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu145 150 155160Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala165170175Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp180185 190
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn195200 205Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu210 215 220Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln225 230 235240Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala245 250255Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln260 26權(quán)利要求
1.一種多肽，其為具有Apolipoprotein A-1的完整氨基酸序列的全長(zhǎng)蛋白或其具有生物學(xué)活性的片段。
2.抗權(quán)利要求1的多肽的抗體，包括能識(shí)別整體分子，分子某一結(jié)構(gòu)域以及某一個(gè)或幾個(gè)特異的抗原決定簇的所有抗體。
3.權(quán)利要求1或2的多肽分子作為糖尿病診斷的血清標(biāo)志物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)2型糖尿病血清標(biāo)志物的試劑盒，更具體地，本發(fā)明涉及利用所鑒別的2型糖尿病的一個(gè)血清標(biāo)志物apolipoprotein A－I，以及其在2型糖尿病病人體內(nèi)出現(xiàn)的表達(dá)水平的改變?cè)O(shè)計(jì)的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明還涉及apolipoprotein A－I在制備2型糖尿病的診斷劑和治療藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1928556SQ20051009826
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日
發(fā)明者馮起平, 李云峰, 左瑾, 方福德 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所