專利名稱：戶塵螨的培養(yǎng)收集及其過敏原診斷和治療制劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于變態(tài)反應藥物制備領域，尤其是涉及戶塵螨(Dermatophagoides pterronyssinus簡稱Der p)的培養(yǎng)、收集方法以及戶塵螨過敏原的提取方法，本發(fā)明也公開了戶塵螨提取液中Der p1含量的測定以及建立戶塵螨過敏患者標準血清庫的建立等。
背景技術：
過敏性疾病已成為影響人們身體健康的重要問題。其中塵螨為最重要的室內過敏原，其是一種普遍存在的生物，肉眼一般看不見，主要存在于居室內，如地毯、枕頭、床墊、沙發(fā)、窗簾。塵螨生存能力強，主要以人體皮屑為食物，消除塵螨過敏原也因此非常困難。在全世界范圍內，居室內最優(yōu)勢的螨是戶塵螨和粉塵螨，主要致敏蛋白組分是第一組分(Der p1)。目前，在美國有約5000萬人患塵螨過敏病，為第六大慢性病，發(fā)病率20-40％；在全世界范圍內也呈逐年上升趨勢，我國4.8億人患病，發(fā)病率37％(80年代統計)。
過敏原制劑可用于過敏性疾病的體內、體外特異性診斷及脫敏治療，是診斷和治療過敏性疾病的基礎，其質量的優(yōu)劣直接影響億萬過敏性疾病患者的健康。1998年，WHO對脫敏治療的療效和安全性給予充分肯定，指出脫敏治療是唯一影響過敏性疾病自然進程的治療方法，能有效阻止過敏性鼻炎發(fā)展為過敏性哮喘。標準化過敏原制劑的研制和使用是過敏性疾病診斷和治療的必然趨勢。
目前，國外的過敏原粗制劑為過敏原原料經提取、透析和無菌過濾后制成的粗提液，包含全部過敏原組分，其具有如下缺點1)以W/V為單位，主要致敏成分含量不穩(wěn)定，不能真實反應過敏原的生物效價和有效成分；2)批間有效成分變異可達1000倍，影響診斷和治療的精確性和安全性；3)無質控標準，不利于藥品監(jiān)督管理，各國家、地區(qū)的產品之間的研究資料無法比較。同時，作為一個附加值較高的科技產品，標準化過敏原制劑擁有巨大的市場，前景看好。國外高質量產品的進入，將對我國民族過敏原生產工業(yè)帶來巨大沖擊1、增加國家醫(yī)療支出和人民負擔，2、由于地區(qū)差異和地理環(huán)境不同，多數國外過敏原產品不適于我國過敏人群，過分依賴國外試劑，將使治療和診斷局限，3、存在生物安全性的問題。
本發(fā)明人經過多年的研究形成了本發(fā)明。國內外對于塵螨的培養(yǎng)方法有多種有的使用蝦皮或魚粉；有的使用人皮屑；還有人使用奶粉。這些方法均含有大量的致敏物質。對于過敏患者有高度的危險性，并且容易形成假陽性反應。本發(fā)明的培養(yǎng)方法避免了上述缺點，降低了過敏患者皮試和脫敏治療時的風險，大大提高了臨床醫(yī)療的安全性。本發(fā)明在避免上述假陽性反應的同時也降低了戶塵螨點刺試驗的假陽性(即大大提高了對戶塵螨過敏診斷的特異性)。國內外收集塵螨的方法有避光法、爬盤法和飽和鹽水法。上述方法收集的塵螨純度不高，本發(fā)明的飽和鹽水結合過篩網方法，大大提高了塵螨收集的純度。另外，本發(fā)明應用蛋白質提取及分析技術，確定了最佳的戶塵螨過敏原提取過程；制備了多克隆抗體，然后采用交叉免疫電泳檢測過敏原總組成成分；建立了戶塵螨過敏患者特異性IgE抗體庫；根據主要致敏組份(第一組分)的等電點和分子量，采用分子篩和離子交換技術進行初步分離，得到相對純化的主要過敏原組份，采用高壓液相色譜-質譜聯用儀器，得到了純化的主要過敏原組份；用質譜分析技術驗證了主要致敏蛋白的氨基酸序列，用放射免疫吸附抑制實驗及戶塵螨過敏患者特異性IgE抗體庫驗證了純化的主要過敏原組分免疫活性；用主要過敏原組分制備單克隆抗體以控制戶塵螨過敏原制劑質量；另外，發(fā)明人利用自行制備的多抗和單抗控制戶塵螨過敏原制劑質量，建立了標準化戶塵螨過敏原制劑的內部參考品和內部參考標準。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種戶塵螨的培養(yǎng)和收集方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種戶塵螨過敏原的提取方法。
本發(fā)明的再一個目的為提供一種測定戶塵螨提取液中Der p1含量的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現的1.戶塵螨的培養(yǎng)和收集在20-25℃，70-75％相對濕度，用透氣帶蓋的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)戶塵螨。飼料為酵母粉30％，豆粉35.2％，玉米粉3.2％，糖35.2％，豬油3.7％，維生素和鹽配方(/100g飼料)Vit A 904.579 IU，VitD 201.729 IU，Vit B12.001mg，Vit B27.525mg，Vit B61.189mg，Vit B120.945mg，Vit C60.519mg，Vit K310.490mg，Vit D30.755mg，煙酸9.888mg，生物素0.040mg，葉酸0.312mg，泛酸鈣8.875mg，肌醇12.104mg，NaCl103.477mg，FeSO463.701mg，ZnSO44.711mg，MnSO41.705mg，Vit E10.11mg。不含魚粉、蝦皮、人皮屑等動物蛋白。收集方法利用飽和食鹽水漂浮法及50-200目篩網收集或利用避光法收集，凍干收集的戶塵螨，得到戶塵螨過敏原標準化制劑的原料。
2.戶塵螨過敏原的提取方法將凍干的戶塵螨經過丙酮脫脂，用Coca’s液溶解，1∶10至1∶20比例(W/V)提取。提取的時候先4℃超聲2-3次，每次2-3分鐘，然后再4℃提取4-24小時，4℃，10000rpm離心15分鐘，取上清液經過濾紙和0.2μm濾器過濾得到戶塵螨提取液原液。
3.戶塵螨提取液中Der p1含量的測定(雙夾心單克隆抗體法)將經過HPLC純化的抗Der P1單克隆抗體溶解在PBS溶液中。用NaHCO3緩沖液按比例稀釋Der P1單克隆抗體至2μg/ml。包被聚乙烯板，孵育過夜。用含Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液(PBS-T)洗板。
加入含BSA的PBS-T，室溫孵育。PBS-T洗板。
加入稀釋的過敏原標準品或樣品。室溫孵育。
使用過敏原標準品(ST-DP1)等比稀釋制備Der P1標準曲線。在酶標板的A1和B1孔加入PBS-T，然后再加入Der P1標準品。混勻，然后轉移若干液體進入下一個PBS-T，形成多個稀釋梯度。A11、B11、A12、B12孔應該僅含有PBS-T作為空白對照。
塵土或過敏原樣品常規(guī)稀釋。用PBS-T洗板，然后加入稀釋的生物素化抗Der P1的單克隆抗體。室溫孵育。
用PBS-T洗板，然后加入稀釋的鏈霉素卵蛋白-過氧化酶(SigMA公司S5512)。然后再使用PBS-T按比例稀釋。室溫孵育半小時。
用PBS-T洗板，然后加入用枸櫞酸磷酸緩沖液溶解的ABTS顯色，顯色時還要加入按比例稀釋的H2O2。當405nm光密度值在2.0-4.0時讀板。
4.建立戶塵螨過敏患者標準血清庫戶塵螨中度過敏患者的標準有過敏性鼻炎或/和過敏性哮喘癥狀，瑞典法馬西亞公司immunoCAP的RAST試驗(過敏原放射性吸附試驗)檢測戶塵螨(d1)過敏等級為3-4級。RAST檢測(RAST FEIA)的基本原理為將包被有變應原的固相載體與陽性血清反應，如血清中含有針對此種變應原的特異性IgE，則可形成抗原抗體復合物，孵育和沖洗后，加酶標抗IgE抗體，再進行孵育，即形成抗原-IgE-抗IgE復合物，沖洗后加底物，此復合物與底物作用產生熒光物質。特異性IgE的含量越高，熒光吸收值越高。
戶塵螨中度過敏患者的采集根據戶塵螨中度過敏患者的標準，在簽署知情同意書后，收集20-30個戶塵螨中度過敏患者血清，每例采集20ml血清，等量混合稀釋后，用含0.5％牛血清白蛋白及0.05％疊氮鈉溶液稀釋至吸光值在10-30KU/L，2ml塑料離心管分裝，凍干保存血清，即為戶塵螨過敏患者標準血清庫。
5.戶塵螨提取液過敏原總生物活性測定通過RAST抑制試驗檢測提取液的過敏原總活性，采用凍干復溶法確保過敏原總活性的相對恒定，過敏原總生物活性的單位用過敏原單位(AU)表示。
采用Pharmacia的CAP系統，進行戶塵螨過敏原放射性吸附抑制試驗(RAST inhibition，簡稱RAST抑制試驗)。RAST抑制試驗是在上述RAST FEIA基礎上加以改變而形成的。即先將一系列不同量的某種變應原與相應的陽性血清即過敏患者血清反應，再進行上述RAST步驟，由于變應原抑制了陽性血清中一定數量的特異性IgE，致使熒光吸收值下降。變應原含量越高，對特異性IgE的抑制作用越強，熒光吸收值越低。
RAST抑制試驗是對戶塵螨過敏原總體生物活性(即抗原性)的分析，它不能反映過敏原中單一組分的抗原性。在戶塵螨的有關試驗中，血清池一般由10個以上病人的血清等量組成。
RAST抑制試驗可采用放免法、酶標法、熒光酶標法的各檢測系統進行測定。由于CAP系統具有較高的靈敏度和特異度，操作簡便，故本發(fā)明采用瑞典法馬西亞公司的UniCAP體外過敏原檢測系統進行。
6.戶塵螨過敏原組分的測定采用SDS-PAGE檢測戶塵螨提取液的蛋白質成分，Western Blotting檢測戶塵螨的主要過敏原成分，其中，一抗為標準血清庫中的標準血清，結果表明至少含有24KD和14KD兩種蛋白質組分。
7.戶塵螨過敏原點刺液的制備在得到合格的戶塵螨提取液后，按1∶1的比例加入等量的甘油，0.4％的苯酚，采用凍干復溶法確保提取液中Der p1的含量在100-200μg/ml，然后分裝在點刺液小瓶內即制得戶塵螨點刺液。
8.戶塵螨過敏原脫敏制劑的制備在得到合格的戶塵螨提取液后，按不同的稀釋比例加入Coca’s液和0.4％的苯酚，制備成一系列不同濃度的戶塵螨脫敏制劑。每瓶戶塵螨脫敏制劑的總容量可不一樣，以達到方便病人和節(jié)約的目的。戶塵螨脫敏制劑中，Der p 1的最高濃度含量為20μg/ml。
9.戶塵螨過敏原點刺液急性毒性試驗在加甘油前進行戶塵螨過敏原點刺液的急性毒性試驗，取5只6周-8周，體重在17-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔內注射0.5ml戶塵螨過敏原點刺液原液，觀察1周，根據是否有小鼠死亡來判斷過敏原點刺液的毒性。


圖1酶標板示意圖，其中的A11、B11、A12、B12孔僅含有1％BSA PBS-T作為空白對照。A1至A10、B1至B10孔為Der p1標準品的標準曲線測定復孔，其含量從250至0.5ng/ml等比稀釋。
實施例1戶塵螨過敏原提取液中Der p1含量的測定經過HPLC純化的抗Der P1單克隆抗體5H8是以2mg/ml儲備液的濃度溶解在PBS溶液中。用50mM pH9.6的NaHCO3緩沖液，按1∶1000比例稀釋抗Der P1單克隆抗體5H8(即10μl/10ml)Der P1單克隆抗體至2μg/ml。包被聚乙烯板，4℃孵育過夜。用含0.05％Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液(PBS-T)洗板3次。
加入含1％BSA的PBS-T 100μl/孔，室溫孵育半小時。PBST洗板3次。
加入100μl/孔稀釋的過敏原標準品或樣品。室溫孵育1小時。
使用過敏原標準品(ST-DP1)等比稀釋制備Der P1標準曲線。Der P1標準品的稀釋范圍為0.5-250ng/ml。在酶標板的A1和B1孔加入180μl 1％BSA的PBS-T，然后再加入20μl Der P1標準品?；靹?，然后轉移100μl液體進入下一個含有100μl 1％BSA的PBS-T，形成10個稀釋梯度。A11、B11、A12、B12孔應該僅含有1％BSA PBS-T作為空白對照。
塵土或過敏原樣品常規(guī)2倍稀釋，從1∶10到1∶80。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl稀釋的生物素化抗Der P1的單克隆抗體4C1(BI-4C1)。此抗體溶液含有50％甘油，應該使用1％BSA PBS-T按1∶1000比例稀釋(即10μl/10ml)。室溫孵育1小時。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl稀釋的鏈霉素卵蛋白-過氧化酶(Sig MA公司S5512，使用1ml雙蒸水復溶0.25mg粉末)。然后再使用1％BSA PBS-T按1∶1000比例稀釋(即10μl/10ml)。室溫孵育半小時。
用PBS-T洗板3次，然后加入100μl用70m MpH7.4枸櫞酸磷酸緩沖液溶解的1m MAB T S顯色，顯色時還要加入按1∶1000比例稀釋的30％H2O2(即10μl/10ml AB T S)。當405nm光密度值在2.0-4.0時讀板。
Der P1標準品含有2500ng/ml Der P1，并且已經經過與WHO/IUIS的戶塵螨參考標準品(NIBSC 82/518)的對比標準化。WHO/IUIS的戶塵螨參考標準品(NIBSC 82/518)含有的Der P1含量為12.5μg/ml。
實施例2戶塵螨過敏原提取液中過敏原總生物活性的測定1).戶塵螨過敏原血清池的建立根據戶塵螨中度過敏患者的標準，在簽署知情同意書后，收集30個戶塵螨中度過敏患者血清，每例采集20ml血清，等量混合稀釋后，用含0.5％牛血清白蛋白及0.05％疊氮鈉溶液稀釋至吸光值在10-30KU/L，2ml塑料離心管分裝，凍干保存血清，即為戶塵螨過敏患者標準血清庫。
2).試劑1×PBS

3).材料a).待檢變應原為Trizol提取的戶塵螨過敏原，與無水乙醇混合后置于-40℃冰箱保存，10000g×10min，取沉淀用1×PBS原體積復溶b).戶塵螨變應原CAP，粉塵螨變應原CAPc).抗IgE CAP與上述CAP完全相同，但纖維素顆粒結合的不是變應原，而是羊抗人IgE，供繪制標準曲線d).IgE標準品共有6個濃度，分別為0.35、0.7、3.5、17.5、50和100KUa/L。
e).酶標記的鼠抗人IgE(酶標二抗)，所用酶為β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)f).底物為4-甲基傘桂-β-半乳糖苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-galactoside)g).終止液為碳酸鈉溶液、沖洗液為PBS溶液4).儀器采用Pharmacia的全自動UniCAP 100 System，操作軟件為UniCAP100versionl.61/009。
5).操作方法a).戶塵螨浸液的稀釋原液濃度為8.9mg/ml，用1×PBS分別稀釋為0.0089mg/ml，0.089mg/ml，0.89mg/ml和8.9mg/ml，即10-3，10-2，10-1和原液。
b).陽性血清的抑制取Eppendoff管7支，每管均加入復溶后的陽性血清20μl分別加入戶塵螨浸液160μl，，在4℃的條件下孵育12小時c).同時取陰性血清20μl，加入1×PBS160μl，按上述同樣處理，作為陰性對照d).輸入測試樣本項目包括用于制作標準曲線的12個抗IgECAP和戶塵螨及粉塵螨sIgECAP。
e).加入血清樣本及IgE標準品(每種濃度皆為雙份)。
f).加入試劑酶標記的羊抗人IgE(酶標二抗)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，底物4-甲基傘桂-β-半乳糖苷(4-Methylunbelliferryl-β-galactosidase)，終止液，沖洗液及其附屬液。
g).計算機自動測試各測試樣本的熒光吸光度值。
h).將IgE標準品的吸光度和相應的濃度在半對數紙上繪制成標準曲線。
i).根據測得的血清熒光吸光度值在標準曲線上讀出相應的sIgE含量，上述兩個步驟由計算機完成。
j).按CAP System提供的RAST的方法對陽性血清，抑制后的陽性血清，陰性血清進行戶塵螨sIgE測定，記錄其吸光值。
k).同時用IgE標準品制備標準曲線6.數據處理a).用陽性血清(陽性血清OD值是陽性血清20μl+PBS60μl混合液的OD值)和抑制后的陽性血清吸光度值分別減去陰性對照的吸光度值b).用a).所得值除以未用變應原抑制的血清吸光度值即最大吸光度值
c).用100％減去b).所得比值即為過敏原放射性吸附抑制的百分率(簡稱RAST抑制試驗百分率)d).以血清樣本處理時所用的變應原量的對數作自變量，RAST抑制試驗百分率為因變量，在半對數紙上作直線回歸，并對RAST抑制曲線進行t檢驗分析。
RAST抑制試驗百分率要達到50％以上。
實施例3戶塵螨過敏原點刺液急性毒性試驗在加甘油前后分別進行戶塵螨過敏原點刺液的急性毒性試驗，取5只6周-8周，體重在17-22克的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔內注射0.5ml戶塵螨過敏原點刺液原液，觀察1周，根據是否有小鼠死亡來判斷過敏原點刺液的毒性。戶塵螨過敏原點刺液急性毒性試驗表明如果合格的戶塵螨點刺液在加入甘油后進行急性毒性試驗則所有的小鼠均死亡；其原因可能為甘油導致小鼠腹腔內出現高滲環(huán)境，導致小鼠血容量降低、脫水，產生低血容量休克而死亡。這些小鼠腹腔的病理活檢及病理切片未發(fā)現其它器質性病變。如果加入甘油前進行急性毒性試驗則合格的戶塵螨點刺液無小鼠死亡。
實施例4戶塵螨過敏原標準化點刺液的靈敏度和特異度。
在北京協和醫(yī)院變態(tài)反應科進行1000例的戶塵螨過敏原標準化點刺液的臨床點刺試驗。每例患者在簽署知情同意書后，接受點刺試驗以診斷是否存在戶塵螨過敏。所用點刺針為清華大學生產的點刺針(醫(yī)療器材準字號蘇鹽藥管械(準)字2004第1010015號)。經過500例的戶塵螨過敏原標準化點刺液的臨床點刺試驗表明與目前，國際公認的戶塵螨過敏的體外檢測方法比較，該標準化點刺液的靈敏度為91％，特異度度為92％。
權利要求
1.一種培養(yǎng)和收集戶塵螨(Dermatophagoides pterronyssinus簡稱Derp)的方法，其包括a).在20-25℃，70-75％相對濕度條件下，用透氣帶蓋的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)戶塵螨；b)利用飽和食鹽水漂浮法及50-200目篩網收集。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于培養(yǎng)戶塵螨的飼料含有酵母粉30％，豆粉35.2％，玉米粉3.2％，糖35.2％，豬油3.7％，不含魚粉、蝦皮、人皮屑等動物蛋白，其中每100g飼料含Vit A 904.579 IU，VitD 201.729 IU，Vit B1 2.001mg，Vit B2 7.525mg，Vit B6 1.189mg，Vit B12 0.945mg，Vit C 60.519mg，Vit K3 10.490mg，Vit D3 0.755mg，煙酸9.888mg，生物素0.040mg，葉酸0.312mg，泛酸鈣8.875mg，肌醇12.104mg，NaCl 103.477mg，FeSO463.701mg，ZnSO44.711mg，MnSO41.705mg，Vit E 10.11mg。
3.一種提取戶塵螨過敏原的方法，包括步驟將由權利要求1或2獲得的凍干戶塵螨進行丙酮脫脂，用Coca’s液溶解，1∶10至1∶20比例(W/V)提取。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于提取時先4℃超聲2-3次，每次2-3分鐘，然后再4℃提取4-24小時，4℃下10000rpm離心15分鐘，取上清液經過濾紙和0.2μm濾器過濾。
5.一種采用雙夾心單克隆抗體法測定戶塵螨提取液中戶塵螨過敏原第一組分(Der p1)含量的方法，其包括步驟a).將經過HPLC純化的抗Der P1單克隆抗體溶解在PBS溶液中；b).用NaHCO3緩沖液稀釋Der P1單克隆抗體，包被聚乙烯板，孵育過夜，用含Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液(PBS-T)洗板；c).加入含BSA的PBS-T，室溫孵育，用PBS-T洗板。d).加入稀釋的過敏原標準品或樣品，室溫孵育；e).使用過敏原標準品等比稀釋制備Der P1標準曲線，其中空白對照僅含有PBS-T；f).塵土或過敏原樣品常規(guī)稀釋，用PBS-T洗板，然后加入稀釋的生物素化抗Der P1的單克隆抗體，室溫孵育；g).用PBS-T洗板，加入稀釋的鏈霉素卵蛋白-過氧化酶，然后再使用PBS-T按比例稀釋，室溫孵育半小時；h).用PBS-T洗板，然后加入用枸櫞酸磷酸緩沖液溶解的AB T S顯色，顯色時還要加入按比例稀釋的H2O2；i).讀板。
6.根據權利要求5的方法，其特征在于步驟b)中用NaHCO3緩沖液，按1∶1000比例稀釋Der P1單克隆抗體，用含0.05％Tween-20，pH7.4的PBS緩沖液洗板3次。
7.根據權利要求5或6的方法，其特征在于步驟f)中塵土或過敏原樣品常規(guī)2倍稀釋1∶10-1∶80。
8.根據權利要求7的方法，其特征在于當405nm光密度值在2.0-4.0時讀板。
9.根據權利要求5或6的方法，其特征在于單克隆抗體溶液含有50％甘油。
10.一種測定在加入甘油之前的戶塵螨過敏原點刺液急性毒性的方法，包括步驟取6周-8周齡體重為17-22克的BALB/c小鼠，在每只小鼠腹腔內注射0.5ml戶塵螨過敏原點刺液原液，觀察1周，根據是否有小鼠死亡來判斷過敏原點刺液的毒性。
全文摘要
本發(fā)明公開了戶塵螨(Dermatophagoidespterronyssinus簡稱Der p)的培養(yǎng)和收集、戶塵螨過敏原提取以及測定戶塵螨提取液中戶塵螨過敏原第一組分(Der pl)含量的方法。其中戶塵螨提取液中Der pl含量的測定采用雙夾心單克隆抗體法。另外，本發(fā)明還公開了戶塵螨過敏患者標準血清庫的建立以及戶塵螨提取液過敏原總生物活性的測定。本發(fā)明的戶塵螨的培養(yǎng)和收集以及戶塵螨過敏原提取的方法與測定戶塵螨提取液中Der pl含量的方法均具有操作方便、快速的特點。
文檔編號G01N33/53GK1763174SQ20051009335
公開日2006年4月26日 申請日期2005年8月26日 優(yōu)先權日2005年8月26日
發(fā)明者孫勁旅, 張宏譽, 尹佳, 黎明 申請人:中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)院