水解過敏素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水解過敏素的制備方法。具體涉及天然過敏素的純化的提取液的制備方法，包含步驟：提取包含致敏性蛋白的過敏素天然源以形成提取液；純化所述提取液以去除非蛋白成分以形成純化的提取液；將所述純化的提取液變性以形成純化的變性提取液，所述純化的變性提取液包含蛋白，其中一起形成所有蛋白的至少60％的最豐富蛋白為至少兩種蛋白，且所有蛋白占純化的變性提取液干燥重量的至少60％。以及，天然過敏素的純化的提取液的制備方法，其包含步驟：水解變性過敏素以形成過敏素水解產(chǎn)物；純化所述過敏素水解產(chǎn)物以去除分子量超過10,000Da和低于1,000Da的肽，從而獲得純化的水解產(chǎn)物，其中70％更優(yōu)選80％的肽介于10,000和1,000Da間。
【專利說明】
水解過敏素的制備方法
[0001 ] 本申請是申請?zhí)?00780023913.3，申請日為2007年6月28日，發(fā)明名稱為"水解過 敏素的制備方法"的中國專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及天然過敏素的提取液的制備方法、來自這些提取液的肽以及可由新型 方法獲得的過敏素提取液。
【背景技術】
[0003] 普通的過敏素為花粉、塵螨、霉菌、藥物、食物和動物毛發(fā)和皮肩。
[0004] 最普通的過敏反應疾病為鼻炎，哮喘和特應性皮炎。過敏性哮喘為慢性炎性紊亂。 通過使用抗阻胺藥、詰抗劑(0-antogonists)和皮質(zhì)類固醇實現(xiàn)過敏性紊亂的癥狀治療。
[0005] 此外，所謂的"特效"免疫療法基于脫敏作用。通常對患者實施特效冒犯性 (offending)過敏素的皮下注射。治療起始于小的過敏素劑量并增加計量。通常治療保持幾 年。此類治療遭受純的患者順應性，且因為患者經(jīng)受嚴重的過敏性反應之苦，該類治療由于 安全性原因而被質(zhì)疑。
[0006] 除了包含重復的皮下注射的方法之外，還有口腔脫敏作用的方法。
[0007] 美國專利4，822，611公開了包含使用過敏素的口腔治療的治療過敏的方法。美國 專利4,822,611描述了顯示來自不同制造商的提取液的逐批差異和不同的商購"散裝"致敏 性提取液。未描述這些提取液的制備。
[0008] GB 1 247 614公開了提取過敏素的方法。該方法的目的是通過包括所有可提取的 過敏素成分得到更完全和有效的致敏性提取液。
[0009] 美國專利5,770,698公開了過敏性活性蛋白質(zhì)提取液的提純方法。圖2的譜未顯示 280nm的峰。這意味著所述提取液含有顯著含量的非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。W0 99/22762公開了類似的 方法，因此，產(chǎn)物也包含大量非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
[0010] 在另一方面，有發(fā)展基于單表位的高特效制劑的趨勢。例如，W0 00/58349公開了 分離并純化的包含兩個肽鍵遠離酪氨酸/精氨酸對的亮氨酸的肽。能使用這些肽制備藥物 組合物以完成治療或預防，在此情況下尤其用于狗的犬過敏反應。
[0011] 在一方面，使用方法以純化特定識別的單個致敏性分子。在另一方面，人們試圖制 造盡可能完全的致敏性提取液。
[0012] 根據(jù)第一選擇，過敏素制劑無相關的表位以在確定的患者內(nèi)引發(fā)耐受性一直都有 可能。第二選擇具有逐批差異的缺點和存在能夠引起免疫反應的化合物(如DNA分子、碳水 化合物、它們的絡合物的脂)的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的一個目標是克服現(xiàn)有技術的至少一些缺點，特別是提供來自天然過敏素 的抗原，所述抗原相比于粗過敏素提取液具有顯著降低的引起變應原性反應的能力，但也 能夠刺激T-細胞。
[0014] 通過提供過敏素提取液的制備方法解決了所述問題，該過敏素提取液包含大多數(shù) 蛋白質(zhì)（該蛋白質(zhì)含有部分過敏素提取液)但具有降低的，優(yōu)選非常低含量非蛋白質(zhì)成分 (如核酸、脂、糖等）。
[0015] 本發(fā)明制備的提取液優(yōu)于現(xiàn)有技術的提取液，特別是本發(fā)明制備的提取液顯示可 再生的蛋白質(zhì)組合物而不會被純化至單表位。
[0016] 本發(fā)明的過敏素提取液的制備方法包含如下步驟：
[0017] a)提取包含致敏性蛋白質(zhì)的過敏素天然源以形成提取液，
[0018] b)純化所述提取液以去除非蛋白質(zhì)成分以形成純化的提取液，
[0019 ] c)將所述純化的提取液變性以形成純化的變性提取液，
[0020] 所述純化的變性提取液包含蛋白質(zhì)，其中最豐富(w/w)的蛋白質(zhì)(其一起形成所有 蛋白質(zhì)的至少60% (w/w))為至少兩種蛋白質(zhì)，且所有蛋白質(zhì)占純化的變性提取液干燥重量 的至少60% (w/w)。
[0021] 該方法稱為方法I。
[0022] 與現(xiàn)有技術的方法相反，本發(fā)明的方法制備主要包含蛋白質(zhì)的過敏素提取液而不 會將所述提取液純化至單肽或蛋白質(zhì)。
[0023] 與現(xiàn)有技術的產(chǎn)物相反，本發(fā)明的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點：
[0024] -基本上去除了除蛋白質(zhì)之外的免疫物質(zhì)；
[0025] _天然過敏素提取液能夠刺激T-細胞而具有降低的引起迅速過敏性反應(嗜堿性 粒細胞活化、肥大細胞脫顆粒)的能力。
[0026] 能使用不同的天然過敏素作為起始原料。典型的天然起始原料為牛奶、毒液、蛋、 雜草、草、樹、灌木、花、蔬菜、谷物、菌類、水果、漿果、堅果、種子、豆類、魚類、貝類、海產(chǎn)、肉 類、香料、昆蟲、螨類、霉菌、動物、鴿子扁虱、蠕蟲、海雞冠、動物皮肩、線蟲、巴西橡膠樹，以 及它們的混合物。
[0027] 在材料提取之后，純化提取液以去除非蛋白質(zhì)成分，如糖、脂、核酸等。典型的幾個 不同的蛋白質(zhì)以純化的提取液的蛋白餾分存在。
[0028] 根據(jù)現(xiàn)有技術，一種蛋白質(zhì)被純化而其他剩余蛋白質(zhì)為"雜質(zhì)"。
[0029]相反，本發(fā)明的目的是一起純化蛋白質(zhì)。使用如SDS-PAGE的方法并接著通過密度 測量法能輕易地測量純化的提取液中的蛋白質(zhì)的相對含量。
[0030]對于蛋白質(zhì)總重量的60%，需要結合至少兩種最主要的蛋白質(zhì)，即，沒有單個蛋白 質(zhì)占所有蛋白質(zhì)的60 %(w/w)或更多。更優(yōu)選地，所有蛋白質(zhì)的60 %由至少3種主要的蛋白 質(zhì)形成，優(yōu)選由至少4種主要的蛋白質(zhì)且更優(yōu)選由至少5、6、7、8、9或10種蛋白質(zhì)形成。
[0031]例如，有如下蛋白質(zhì)：
[0032] 蛋白質(zhì) 1:27%
[0033] 蛋白質(zhì) 2:13%
[0034] 蛋白質(zhì) 3:34%
[0035] 蛋白質(zhì) 4:19%
[0036] 蛋白質(zhì) 5:17%
[0037] 一起形成至少60%( ? 60%或更多）的最主要的蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)3 + 1(34+27 = 61%)〇
[0038] 此外，純化的提取液的蛋白質(zhì)總含量為純化的提取液的至少60重量％，所述含量 優(yōu)選為純化的提取液的至少70重量％或80重量％，更優(yōu)選為90重量％。
[0039] 優(yōu)選用水溶液進行提取。合適的鹽為但不限制于如碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、醋 酸鹽、TRIS 和 HEPES。
[0040] 也與許多其他提取方法不同，優(yōu)選提取介質(zhì)的量相對較大，即至少為過敏素天然 源重量的20倍，優(yōu)選為所述重量的100倍或更多。
[0041 ]可通過如下的一種或多種進行提取液的純化：
[0042] -離子交換色譜法步驟(包括陰離子交換色譜法和陽離子交換色譜法），
[0043] -體積排阻色譜法步驟(也稱為凝膠過濾），
[0044] -沉淀步驟，
[0045]-疏水相互作用色譜法步驟，
[0046] -假親合和親合色譜法，和/或
[0047] -滲濾。
[0048] 在優(yōu)選的具體實施方案中使用離子交換色譜法，其中在陽離子交換劑的情況下負 載溶液的pH介于陽離子交換劑的酸性官能pKa和具有提取液中的蛋白質(zhì)的最低pKa的蛋白 質(zhì)的pKa之間。在陰離子交換劑的情況下所述pH介于陰離子交換劑的堿性官能pKa和具有組 成提取液的蛋白質(zhì)的最高pKa的蛋白質(zhì)的pKa之間。
[0049] 通過該方法，所有的蛋白質(zhì)結合于離子交換劑上，而中性雜質(zhì)以及與離子交換樹 脂具有相同電荷的雜質(zhì)將被去除。
[0050] 在優(yōu)選地具體實施方案中，用包含一種或多種表面活性劑和/或變性劑的溶液進 行至少一個純化步驟。所述表面活性劑可為非離子型、陰離子型、陽離子型或兩性的。合適 的變性劑為離液劑、還原劑和它們的混合物。合適的變性劑為例如尿素、鹽酸胍、乙二醇、異 丙醇。尿素的合適濃度為3M或更高，優(yōu)選4M或更高。胍鹽的合適的濃度優(yōu)選為2M，優(yōu)選為3M 或更高。乙二醇和/或異丙醇的合適濃度為5重量％或更高，更優(yōu)選為10重量％或更高，不超 過20重量％。
[0051] 在一些情況中，根據(jù)本發(fā)明的方法I制備純化的提取液是足夠的。此類提取液可用 于制備活體外/活體內(nèi)以及試管內(nèi)診斷、過敏性疾病的預防和治療。本發(fā)明的進一步的具體 實施方案為由方法I的提取液或者由任何其他來源制備過敏素水解產(chǎn)物的方法。若所述提 取液來自任何其他純化的過敏素源而非來自方法I，需要一個變性的初步步驟以改進消化 性。
[0052]所述方法(方法II)包含如下步驟 [0053] a)水解變性過敏素以形成過敏素水解產(chǎn)物，
[0054] b)純化所述過敏素水解產(chǎn)物以去除分子量超過10，OOODa和低于1，OOODa的肽，從 而獲得純化的水解產(chǎn)物，其中70%，更優(yōu)選80%的肽介于10，000Da和1，000Da之間。
[0055]由此獲得的產(chǎn)物的優(yōu)點是所述肽為變性蛋白質(zhì)的消化結果。由于特定的大小標 定，所述肽具有降低的誘導快速過敏性反應以及促炎癥反應的能力。
[0056]如需要，優(yōu)選在離液劑、還原劑或它們的混合物的存在下進行變性。合適的離液劑 為例如尿素和鹽酸胍。典型的還原劑為例如二硫蘇糖醇(dithiotriethol)、0_疏基乙醇、硫 代甘油和它們的混合物。
[0057]通常用酶進行水解步驟。合適的酶為例如胃蛋白酶、胰島素、糜蛋白酶。也能在離 液劑，優(yōu)選尿素或鹽酸胍的存在下進行該水解步驟。在水解過程中尿素和鹽酸胍的濃度應 低于4M，優(yōu)選低于3M。
[0058]在方法II的步驟b)中，分子量大于10,000Da或小于l，000Da的肽被去除。
[0059] 因此，純化的水解產(chǎn)物的肽包含分子量介于1,000至10,000Da的肽。去除大或小的 肽的合適方法為超濾和體積排阻色譜法。該體積排阻色譜法也可在離液劑，例如尿素、鹽酸 胍、乙二醇、異丙醇和它們的混合物的存在下進行。
[0060] 本發(fā)明的進一步的具體實施方案為可由本發(fā)明的方法I獲得的過敏素提取液。通 常在該提取液中，以重量計最主要的蛋白質(zhì)（其一起形成所有蛋白質(zhì)的至少60重量％)為至 少2種蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少3或4種蛋白質(zhì)或更優(yōu)選至少5、6、7、8、9或10種蛋白質(zhì)。通過光密度 260?見到純度:光密度280 nm-比率〈1，優(yōu)選〈0.9，更優(yōu)選介于0.75和0.9之間。
[0061] 進一步的具體實施方案為可由方法II獲得的過敏素水解產(chǎn)物。所述過敏素水解產(chǎn) 物能用于：
[0062]-過敏性疾病的活體內(nèi)診斷：點刺試驗、皮內(nèi)注射、結膜、吸氣和吸入試驗；
[0063] _過敏性疾病的活體外和試管內(nèi)診斷:試驗中所用的ELISA試劑盒或標準樣品；
[0064] -過敏性疾病的預防和治療：用于脫敏/脫敏作用治療以及結合/不結合佐劑的免 疫應答調(diào)節(jié)。
[0065] 本發(fā)明的過敏素提取液能用于藥物組合物和/或食物組合物的制備以誘導耐受 性。耐受性的誘導能用于治療和防止過敏性反應。
[0066] 本發(fā)明的進一步的具體實施方案為包含完整形式或水解形式的本發(fā)明的過敏素 提取液的藥物組合物。此外，藥物組合物可包含一種或多種如下物質(zhì):三磷酸核苷、二磷酸 核苷、單磷酸核苷、核酸、肽核酸、核苷或它們的類似物、免疫抑制細胞因子、誘導免疫蛋白 酶體、1，25_二羥基維生素D3或它們的類似物的表達的化合物、脂多糖、內(nèi)毒素、熱休克蛋 白、具有NADPH或NADP-硫氧還蛋白還原酶的硫氧還蛋白、二硫蘇糖醇、如舒喘靈的腎上腺素 能受體、如丁氧胺的腎上腺素能受體、調(diào)節(jié)粘連分子ICAM-1、N-乙?；?L-半胱氨酸、y-L-谷 氨?；?L-半胱氨酰-甘氨酸(還原的L-谷胱甘肽）、a-2-巨球蛋白的表達的化合物、Foxp3基 因表達的誘導物、黃酮類、異黃酮類、紫檀堿化七61'0〇3印3]1〇1(18)、如白藜蘆醇的二苯乙稀、 速激肽受體拮抗劑、糜酶抑制劑、類似CpG或MPL的疫苗佐劑或類似酵母多糖、0-1，3_葡聚糖 的致耐受性佐劑、調(diào)節(jié)T-細胞誘導物、將粒子粘合至腸粘膜的粘膜-粘連劑(如植物凝集素、 鋅、鋅鹽、多糖、維生素和細菌溶菌產(chǎn)物）。
[0067] 基于組合物中的天然過敏素源，可包含選自花粉過敏素、牛乳過敏素、毒液過敏 素、蛋過敏素、雜草過敏素、草過敏素、樹過敏素、灌木過敏素、花過敏素、蔬菜過敏素、谷物 過敏素、菌類過敏素、水果過敏素、漿果過敏素、堅果過敏素、種子過敏素、豆類過敏素、魚類 過敏素、貝類過敏素、海產(chǎn)過敏素、肉類過敏素、香料過敏素、昆蟲過敏素、螨類過敏素、霉菌 過敏素、動物過敏素、鴿子扁虱過敏素、蠕蟲過敏素、海雞冠過敏素、動物皮肩過敏素、線蟲 過敏素、巴西橡膠樹過敏素的過敏素。
[0068] 在優(yōu)選的具體實施方案中，制備藥物組合物用于口腔施用、用于舌下藥物傳遞、用 于腸道藥物傳遞。
【附圖說明】
[0069] 圖1:通過IgG免疫印記確定的免疫反應性。帶1:分子量標記，帶2:粗蛋白質(zhì)提取 液，帶3:純化的過敏素變性提取液。由BSA 5%和牛乳3%封閉膜?；颊哐逑♂屩?/250。 IgG結合通過稀釋至1/2,500的羊抗人IgG HRP檢測并通過TMB載體揭示。過敏素1: ±61-541^)&，過敏素2:±36-311^)&。
[0070] 圖2:通過IgE免疫印記確定的免疫反應性。帶1:分子量標記，帶2:粗蛋白質(zhì)提取 液，帶3:純化的蛋白質(zhì)。由BSA 5 %和牛乳3 %封閉膜。患者血清稀釋至1 /5。IgE結合通過稀 釋至1/10,000的羊抗人IgE HRP檢測并通過TMB載體揭示。過敏素l:±61-54kDa，過敏素2: ±36-31kDa。
[0071]圖3:SEC G25洗脫曲線的排阻峰。柱體積/樣品體積的比率為12。使用三HC1 25mM、 尿素1.5M，pH 8.0以9毫升/分鐘的流速平衡樹脂。通過280nm的吸光度跟蹤洗脫。
[0072] 圖4:通過SDS-PAGE確定的蛋白質(zhì)曲線。4-12%雙-三凝膠。帶1:分子量標記，帶2: 純化的過敏素變性提取液。使用考馬斯亮藍R-250進行染色。
[0073]圖5:通過SDS-PAGE確定的蛋白質(zhì)和肽曲線。4-12%雙-三凝膠。帶1:分子量標記， 帶2:純化的過敏素變性提取液(13微克），帶3:水解產(chǎn)物（13微克）。使用考馬斯亮藍R-250進 行染色。
[0074] 圖6:G50SEC洗脫曲線。使用尿素2M、NaCl 100mM，pH 3.0平衡柱子。流速為15毫升/ 分鐘。柱體積/樣品體積的比率為10。通過280nm的吸光度跟蹤洗脫。
[0075]圖7:HPLC分析的標定曲線。將10微升如下標準樣品（1毫克/毫升)注射至BioSep-SEC S2000柱：1.牛血清白蛋白（66kDa)，2.乳球蛋白（18.5kDa)，3.細胞色素C( 12kDa)，4. 高血糖素(3.5kDa)，5. lkDa合成肽。
[0076] 圖8 :體積排阻HPLC曲線。柱：BioSep-SEC S2000(reENOMENEX)。洗脫緩沖液： Na2HP〇4 50mM-SDS 0.5%(w/v)pH 6.8。流速為1毫升/分鐘。在214_檢測。注射10微升樣品。 使用介于10kDa和lkDa界限之間的曲線下面積計算感興趣的肽的百分率。
[0077] 圖9:花粉衍生產(chǎn)物的變應原性性質(zhì)。用增加濃度(0、1、10、100和1000納克/毫升） 的花粉粗提取液，花粉純化的蛋白質(zhì)和花粉純化的肽孵育來自花粉過敏志愿者的血樣。通 過具有在IgE-陽性白細胞上的門控的流式細胞術測定gp53蛋白質(zhì)表達。結果表述為活化細 胞中的gp53陽性細胞百分數(shù)(2次測量的平均±偏差）。
[0078]圖10:通過花粉蛋白質(zhì)和花粉肽進行的人類PBMC增殖性的刺激。在增加濃度（10 30和90微克/毫升）的花粉蛋白質(zhì)或花粉肽存在下在37°C孵育由花粉過敏志愿者純化的人 類PBMC 5天。將[3H]-胸腺嘧啶核苷加入細胞培養(yǎng)基16小時，并使用液體閃爍原理利用拆十 數(shù)器測定所述[ 3H]_胸腺嘧啶核苷的摻入。結果表述為5次測量的平均。本發(fā)明的方法進一 步通過如下非限制性的實施例示例。
【具體實施方式】
[0079] 實施例
[0080] 實施例1:提取
[0081 ]將1 % (w/v)花粉（來自 ALLERG0N的Lolium perenne)加入碳酸氫鈉（12? 5mM)并在 攪拌下孵育2小時。然后通過加入2% (w/v)的硅藻土(ACROS)并通過0.2微米的過濾器使所 述溶液澄清并過濾。該樣品構成粗提取液。
[0082]使用花粉過敏患者的血清通過免疫印跡分析提取液中過敏素的存在。用抗人IgG 或IgE抗體使IgG和IgE表位顯影。
[0083]如圖1和圖2所示，在提取液中有兩種主要的過敏素。
[0084] 將所述粗提取液酸化至pH 3.0并加入Tween 20(0.1%，v/v)。該樣品構成酸化的 提取液。
[0085]實施例2:過敏素蛋白質(zhì)的純化 [0086] 所述過敏素提取液通過如下進行純化：
[0087]-陽離子交換色譜法
[0088]用28X床體積（Bv)的碳酸氫鈉 12.5mM、檸檬酸鹽30mM，pH 3.0、Tween 20 0.1% (v/v)平衡微孔離子交換膜（sartobind)Sl莫(SART0RIUS)。將所述酸化的提取液加載至所 述平衡膜。最初用35XBv的碳酸氫鈉12.5mM、梓檬酸鹽30mM，pH 3.0、Tween 20 0.1%(v/v) 沖洗柱子，然后用42XBv的碳酸氫鈉12.5mM、檸檬酸鹽30mM，pH3.0沖洗柱子。用碳酸鹽 0.1M、氯化鈉0.5M，pH 9.15洗脫蛋白質(zhì)。通過280nm的0D跟蹤蛋白質(zhì)的存在。集中感興趣的 餾分(圖3)。
[0089]-硫酸銨沉淀 [0090] 該步驟在〇-4 r下進行。
[0091 ]將達到90%飽和的一定數(shù)量的硫酸銨在攪拌下加入產(chǎn)物。在鹽全部溶解之后停止 攪拌。所述懸浮液孵育過夜并在15分鐘期間以10,000g離心2次。每次仔細丟棄上清液。 [0092]-變性
[0093] 將微粒以9毫克/毫升再懸浮于尿素6M、DTT 10mM、三HC1 0.1M，pH 8.0,并在37°C 下孵育1小時。
[0094]-在G25樹脂(來自AMERSHAM的細Sephadex)上的體積排阻色譜法
[0095] 將所述變性樣品加載至柱子并用三HC1 25mM、尿素1.5M，pH 8.0洗脫蛋白質(zhì)。
[0096]通過在280nm的0D測量跟蹤蛋白質(zhì)的存在。集中感興趣的餾分以構成純化的變性 過敏素提取液。
[0097]進一步分析所述純化的過敏素提取液。測定蛋白質(zhì)含量(BCA測定)和干燥重量以 評估蛋白質(zhì)純度。通過去除碳水化合物(苔黑酚試驗)并也通過0D26Q/0D28Q的降低跟蹤純化 效率。
[0098]表1:去除非蛋白質(zhì)組分以形成純化的提取液
[0100] 如表1所示，所述純化方法允許：
[0101] -提取液中蛋白質(zhì)百分率由~15%增加至80%;
[0102] -0D26q/0D28()比率趨于0 ? 5(其表示純蛋白質(zhì)）；
[0103] -碳水化合物的顯著去除(剩余含量代表蛋白質(zhì)的碳水化合物部分）。
[0104] 圖4表示對于純化的變性過敏素提取液得到的典型的SDS-PAGE曲線。由圖可見，6 種蛋白質(zhì)占純化的提取液中的蛋白質(zhì)總重量的至少60 %。
[0105] 實施例3:變性過敏素提取液的水解
[0106] 使用如下規(guī)程水解所述提取液：
[0107] 將所述純化的過敏素提取液酸化至pH 2.0。以2.5毫克/毫升的花粉蛋白質(zhì)和 lEu. Ph. U的胃蛋白酶(MERCK)(對于337毫克蛋白質(zhì))在37 °C和2小時期間進行消化。
[0108]圖5顯示了純化的提取液(帶2)和水解的提取液(帶3)之間的比較。由圖可見，在用 胃蛋白酶孵育之后，對應于變性未消化蛋白質(zhì)的高分子量蛋白質(zhì)消失。
[0109] 實施例4:純化
[0110] 為了去除MW2 10,000Da和l，000Da的肽，通過如下方式純化所述水解產(chǎn)物：
[0111] -在G50樹脂(來自AMERSHAM的細Sephadex)上的體積排阻色譜法。
[0112] 將16.5%(v/v)的異丙醇和0.1M NaCl加入所述水解產(chǎn)物。迅速將該樣品加載至 G50柱。洗脫所述肽并集中含有肽(Mff< 1 OkDa)的餾分，如圖6所示。
[0113] -在lkDa膜上的滲濾(來自PALL的超濾卡Omega PES)。
[0114] 將所述肽濃縮10 X，用10體積的三HC1 50mM pH 7.4滲濾，并最終濃縮2.5 X。該樣 品構成純化的過敏素水解產(chǎn)物。
[0115] 通過體積排阻HPLC控制純化的效率。用Na2HP〇4 50mM-SDS0.5%(w/v)pH 6.8以1毫 升/分鐘的流速平衡BioS印-SEC S2000柱(PHENOMENEX)。在214nm處檢測肽。
[0116] 如圖7所示例由標定曲線計算10kDa和lkDa界限。
[0117] 如圖8所示，分子量介于1，OOODa和10，OOODa之間的肽占純化的水解產(chǎn)物中所有肽 的約75 %。
[0118] 實施例5:變應原性的降低
[0119] 通過測量其誘導嗜堿性細胞脫粒的能力評定花粉粗提取液(根據(jù)實施例1)、純化 的花粉蛋白質(zhì)(根據(jù)實施例2)和純化的花粉肽(根據(jù)實施例4)的變應原性性質(zhì)。
[0120]在試管內(nèi)對用增加濃度的花粉粗提取液、純化的蛋白質(zhì)和純化的肽孵育的來自花 粉過敏志愿者的新鮮人類血樣進行試驗。通過測量、通過流式細胞法、在活化細胞（即IgE陽 性細胞）的細胞膜上的gp53蛋白質(zhì)標記的表達評定嗜堿性細胞脫粒。該蛋白質(zhì)通常在剩余 細胞內(nèi)的顆粒的膜中存在，且一旦細胞活化會出現(xiàn)在細胞表面（由于顆粒的膜與細胞質(zhì)膜 的融合）。因此通過標記的特定抗-gp53抗體，該蛋白質(zhì)變得可檢測。如圖9所示，相比于純化 的蛋白質(zhì)，純化的肽為約30X較不致敏，且相比于花粉粗提取液，純化的肽為100X較不致 敏。
[0121 ]實施例6:花粉蛋白質(zhì)和花粉肽的致免疫性
[0122] 通過測量其激發(fā)人類外周血單核細胞(PBMC)的增殖性研究過敏素蛋白質(zhì)和肽的 致免疫性。
[0123] 將通過密度梯度離心純化的PBMC(其來自"花粉-致敏性"志愿者的血樣)在增加濃 度的花粉蛋白質(zhì)和花粉肽存在下在96-孔板中培養(yǎng)5天。在第5天，將[ 3H]_胸腺嘧啶核苷加 入細胞培養(yǎng)基并進一步在37°C下孵育所述板16小時。使用液體閃爍原理利用拆十數(shù)器測定
[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入(圖10)。
[0124]花粉蛋白質(zhì)(根據(jù)實施例2)和花粉肽(根據(jù)實施例4)以劑量濃度依賴性的方式激 發(fā)人類PBMC的增殖。由過敏素肽誘導的增殖略微低于在應答蛋白質(zhì)中所觀察到的增殖。這 些結果顯示肽的制備方法保持了大多數(shù)在T細胞活化中牽涉的過敏素的表位。
【主權項】
1. 一種純化的過敏素水解產(chǎn)物的制備方法，該制備方法包含如下步驟： -提取包含致敏性蛋白質(zhì)的過敏素天然源以形成提取液， -純化所述提取液以去除非蛋白質(zhì)成分以形成純化的提取液， -將所述純化的提取液變性以形成純化的變性提取液，其中使用離液劑和還原劑的混 合物進行變性，所述純化的變性提取液包含蛋白質(zhì)，其中一起形成所有蛋白質(zhì)的60%或更 多(w/w)的最豐富(w/w)的蛋白質(zhì)為至少兩種蛋白質(zhì)，且所有蛋白質(zhì)占純化的變性提取液干 燥重量的至少60% (w/w)， -水解所述純化的變性提取液以形成過敏素水解產(chǎn)物， -純化所述過敏素水解產(chǎn)物以去除分子量超過l〇,〇〇〇Da和低于l，000Da的肽，從而獲得 純化的水解產(chǎn)物，其中80 %的肽介于10，OOODa和1，OOODa之間。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在不含鹽或包含選自碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、醋 酸鹽、TRIS或HEPES的鹽的溶液中進行所述提取。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中用提取介質(zhì)進行所述提取，其中提取介質(zhì)的重 量為過敏素天然源重量的至少20倍。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中用提取介質(zhì)進行所述提取，其中提取介質(zhì)的重 量為過敏素天然源重量的100倍。5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述純化包含一個或多個離子交換色譜法步驟、凝 膠過濾或體積排阻色譜法步驟、沉淀步驟、疏水相互作用色譜法步驟、假親合或親合色譜法 步驟或滲濾步驟。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中使用包含表面活性劑和/或變性劑的溶液進行至少 一個純化步驟。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中 所述離液劑選自：尿素、鹽酸胍、及其混合物，以及 其中，所述還原劑選自：二硫蘇糖醇、硫代甘油、β-巰基乙醇及其混合物。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中尿素的濃度高于4Μ和/或鹽酸胍的濃度超過3Μ。9. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中尿素的濃度高于5Μ和/或鹽酸胍的濃度超過4Μ。10. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中使用酶進行水解。11. 根據(jù)權利要求1或10所述的方法，其中使用胃蛋白酶、胰蛋白酶或糜蛋白酶進行水 解。12. 根據(jù)權利要求1或10所述的方法，其中在離液劑的存在下進行水解。13. 根據(jù)權利要求1或12所述的方法，其中在尿素和鹽酸胍的存在下進行水解。14. 根據(jù)權利要求1或10所述的方法，其中通過體積排阻色譜法和/或通過超濾進行肽 的去除。15. 根據(jù)權利要求14所述的方法，其中在離液劑存在下進行體積排阻色譜法步驟。16. 根據(jù)權利要求14所述的方法，其中在尿素、鹽酸胍、乙二醇、異丙醇或其混合物存在 下進行體積排阻色譜法步驟。17. 根據(jù)權利要求1或10所述的方法，其中 所述過敏素選自：花粉過敏素、牛乳過敏素、毒液過敏素、蛋過敏素、雜草過敏素、草過 敏素、樹過敏素、灌木過敏素、花過敏素、蔬菜過敏素、谷物過敏素、菌過敏素、水果過敏素、 漿果過敏素、堅果過敏素、種子過敏素、豆過敏素、魚過敏素、貝過敏素、海產(chǎn)過敏素、肉過敏 素、香料過敏素、昆蟲過敏素、螨過敏素、霉菌過敏素、動物過敏素、鴿子蜱過敏素、蠕蟲過敏 素、海雞冠過敏素、動物皮肩過敏素、線蟲過敏素和巴西橡膠樹過敏素。18. 可通過權利要求1或10所述的方法獲得的純化的過敏素水解產(chǎn)物。19. 權利要求18的所述過敏素水解產(chǎn)物用于制備誘導耐受性的藥物組合物的用途。20. 權利要求18的所述過敏素水解產(chǎn)物用于食物組合物的用途。21. 根據(jù)權利要求19所述的用途，其中耐受性的誘導用于治療或防止過敏性反應。22. -種藥物組合物，其包含權利要求18的所述過敏素水解產(chǎn)物。23. 根據(jù)權利要求22所述的藥物組合物，其中所述過敏素選自花粉過敏素。24. 根據(jù)權利要求22所述的藥物組合物，其中所述過敏素選自螨類過敏素。25. 根據(jù)權利要求22所述的藥物組合物，用于口腔施用、用于舌下藥物傳遞、用于腸道 藥物傳遞。
【文檔編號】A61K39/35GK105854012SQ201610191809
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2007年6月28日
【發(fā)明人】T·萊貢, S·皮羅頓, G·普拉希爾
【申請人】生物技術工具公司