專利名稱：海狗油中omega3不飽和脂肪酸的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海狗油及其用海狗油制得的軟膠囊中OMEGA3不飽和脂肪酸的測定方法。
背景技術(shù)：
海狗為海豹科動物豎琴海豹(Harp seal)的俗稱，棲居于北極和大西洋的北部。由于加拿大政府采取的保護措施，海狗的數(shù)量以每年5％的速度穩(wěn)定增長。為保持海狗與魚群之間的生態(tài)平衡，經(jīng)聯(lián)合國和加拿大政府批準，每年可以少量地捕殺海狗。
海狗油取材于新捕獵的北極海狗皮下脂肪，經(jīng)過真空蒸餾等工藝，在低溫條件下除去蛋白、碳水化合物等物質(zhì)，得到呈微黃色、透明液體狀的精煉海狗油。
海狗油中富含人體所需的OMEGA3不飽和脂肪酸(簡稱Ω-3PUFA或ω-3多不飽和脂肪酸)，其營養(yǎng)價值要優(yōu)于其他食用油類。在海狗油中除發(fā)現(xiàn)魚油中通常含有的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)外，還有含量可觀的二十二碳五烯酸(DPA)。理想條件下提煉加工的海狗油，其中EPA、DHA和DPA的含量可高達25％以上。
由于海狗油中富含OMEGA3不飽和脂肪酸使海狗油具有調(diào)節(jié)血脂，抗動脈粥樣硬化、降血壓、抑制血小板聚集和抗血栓作用，研究表明海狗油對前列腺疾病及糖尿病亦有一定療效。因為其成分復(fù)雜，各成分含量參差不齊，所以用一般分離、分析手段對OMEGA3不飽和脂肪酸難以定性、定量?！督K藥學與臨床研究》雜志2001年第9卷第3期報道了用氣相色譜法測定海狗油中的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)。但由于此方法采用的為氣相色譜法，其準確率不高，另外，《藥學進展》雜志2002年24卷4期報道了氣相色譜-質(zhì)譜測定海狗油中不飽和脂肪酸的方法，但該方法主要從分離角度解決不飽和脂肪酸的分離問題，沒有涉及含量測定問題。本發(fā)明根據(jù)海狗油中不飽和脂肪酸的特點，選擇適合的色譜條件，制定標準指紋圖譜，以控制海狗油產(chǎn)品的質(zhì)量，利于工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種海狗油及其制劑的質(zhì)量控制方法。
本發(fā)明是通過比較海狗油中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)的指紋圖譜對海狗油及其制劑的質(zhì)量進行控制的。
本發(fā)明采用液相色譜法，對海狗油中的不飽和脂肪酸如海狗油原油中EPA、DHA、DPA進行衍生化后用高效液相色譜法對其進行含量測定，根據(jù)標準品的圖譜和樣品的圖譜比較來判定海狗油中的不飽和脂肪酸的含量，特別是EPA、DHA、DPA的含量，本發(fā)明所述標準指紋圖譜是對海狗油中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)的純化的標準對照品，采用本發(fā)明的高效液相色譜條件進行測定，得到的高效液相圖譜。而海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜是指對海狗油產(chǎn)品中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)，采用本發(fā)明的高效液相色譜條件進行測定，得到的高效液相圖譜。
所述純化的標準對照品可以從市場上買到，也可以通過已知的提取方法提取得到。
本發(fā)明的質(zhì)量控制方法可包括下列步驟1、制定標準對照指紋圖譜；2、測定海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜；3、將上述指紋圖譜進行比較；4、測算海狗油及含有海狗油的制劑中不飽和脂肪酸的量；根據(jù)本發(fā)明，步驟1中制定標準對照指紋圖譜；具體操作步驟如下(a)對照溶液的制備(1)取二十碳五烯酸甲酯(EPAM)對照品1ml(含EPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含EPAM 1mg的溶液，搖勻，作為EPAM儲備液。
(2)取二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)對照品1ml(含DHAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DHAM 1mg的溶液，搖勻，作為DHAM儲備液。
(3)取二十二碳五烯酸甲酯(DPAM)對照品1ml(含DPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DPAM 1mg的溶液，搖勻，作為DPAM儲備液。
精密量取上述各儲備液各1ml，置10ml的棕色量瓶中，加0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，作為對照溶液；(b)色譜條件色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為6∶2∶2；檢測波長210±2nm；(c)測定精密吸取對照品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到對照品指紋圖譜。
以上所述對照品，是純化的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)經(jīng)過衍生化后的二十碳五烯酸甲酯(EPAM)、二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)與二十二碳五烯酸甲酯(DPAM)樣品。
步驟2中測定海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜；具體操作步驟如下(a)供試品的制備取海狗油原油或含有海狗油的制劑如海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸內(nèi)容物，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇鈉，不斷振搖，至小油滴完全消失，加冰乙酸，用甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液；(b)色譜條件色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為4～7∶1～3∶1～3；檢測波長200～400nm；(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到供試品指紋圖譜。
其優(yōu)選的色譜條件和操作步驟如下(a)供試品的制備取海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸內(nèi)容物或海狗油原油約100mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇鈉4ml，不斷振搖，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試溶液；(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為6∶2∶2；檢測波長210±2nm；(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到供試品指紋圖譜。
本發(fā)明中，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性照高效液相色譜法(中國藥典2005年版二部附錄VD)進行的。
步驟3中是將供試品指紋圖譜和標準對照品指紋圖譜進行圖譜比較。以外標峰面積法計算供試品中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)總百份含量。
根據(jù)本發(fā)明，以上色譜條件是經(jīng)過篩選得到的，具體篩選情況如下1.波長選擇取EPAM、DHAM、DPAM對照品，加異丙醇適量，以0.005％甲醇BHT溶液，在200～400nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，結(jié)果EPAM、DHAM、DPAM均在210nm±2nm波長處有最大吸收，見圖9A。
2.流動相摸索采用乙腈-甲醇-水(7∶1∶2)為流動相，流速1.2ml/min，檢測波長210nm的條件進行檢測時，檢測時間較長，見圖9B。
在此流動相的基礎(chǔ)上，對流動相的極性稍加調(diào)整，采用乙腈-甲醇-水(6∶2∶2)為流動相，流速1.5ml/min，在保證各個組分的分離度符合要求的同時，縮短了分析時間，提高了工作效率，見圖10。
3.溶劑空白取空白溶劑20u1注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果空白溶劑峰均在tR10.068min之前，見圖11。
4.專屬性試驗4.1酸、堿破壞因海狗油樣品經(jīng)酸堿破壞后無法進行酯化，在流動相中也不溶解，無法進行測定。
4.2高溫試驗取海狗油原油，于60℃條件下放置，于0、24小時取樣，按含量測定法進行測定，結(jié)果經(jīng)高溫后，膠丸外觀變硬，但與0天相比未出現(xiàn)其它雜質(zhì)峰，見圖12、圖13。
4.3高濕試驗取海狗油原油，置RH92.5％條件下放置，于24小時取樣按含量測定法進行測定，與0天相比未出現(xiàn)其它雜質(zhì)峰，見圖14。
4.4光照試驗取海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸，置4500Lx±500Lx強光下照射，于24小時取樣，按含量測定法進行測定，結(jié)果與0天相比未出現(xiàn)其它雜質(zhì)峰，結(jié)果見圖15。
4.5氧化試驗取海狗油原油約100mg，通入氧氣，密閉放置，于24小時取樣按含量測定法進行測定，結(jié)果海狗油顏色明顯加深，但與0天相比未出現(xiàn)其它雜質(zhì)峰，見圖16。
5.EPAM、DHAM、DPAM線性精密量取標準曲線下各濃度的供試溶液各20ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，分別繪制標準曲線。結(jié)果EPAM的標準曲線方程為Y＝43890x+180.65，r＝0.9998；DHAM的標準曲線方程為Y＝46333x+145.85，r＝0.9999；DPAM的標準曲線方程為Y＝40385x+116.13，r＝0.9999。結(jié)果見表2。
表2 EPAM、DHAM、DPAM線性測定結(jié)果

結(jié)果表明EPAM、DHAM、DPAM在0～1mg/ml的濃度范圍內(nèi)線性良好。
6.精密度6.1重復(fù)性精密吸取海狗油標準曲線下濃度為0.1mg/ml的EPAM、DHAM、DPAM溶液20ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進樣6次，分別以EPAM、DHAM、DPAM的峰面積計算RSD，結(jié)果見表3。
表3 EPAM、DHAM、DPAM重復(fù)性測定結(jié)果

結(jié)果表明EPAM、DHAM、DPAM重復(fù)性良好。
6.2中間精密度取重復(fù)性項下溶液，連續(xù)兩天進樣，以峰面積計算，結(jié)果見表4。
表4 EPAM、DHAM、DPAM日間精密度測定結(jié)果


結(jié)果表明EPAM、DHAM、DPAM日間精密度良好。
6.3重現(xiàn)性精密稱取海狗油原油約100mg六份，按照含量測定項下操作，以含量計算，結(jié)果見表5。
表5 EPAM、DHAM、DPAM重現(xiàn)性測定結(jié)果

結(jié)果表明EPAM、DHAM、DPAM重現(xiàn)性良好。
7.檢測限取線性項下濃度為0.005mg/ml的EPAM溶液，不斷稀釋取20ul進樣，結(jié)果濃度為0.00005mg/ml的溶液峰高約為基線噪音的3倍，故EPAM最小檢測限為1.0ng。
取線性項下濃度為0.005mg/ml的DHAM溶液，不斷稀釋取20ul進樣，結(jié)果濃度為0.00005mg/ml的溶液峰高約為基線噪音的3倍，故DHAM最小檢測限為1.0ng。
取線性項下濃度為0.005mg/ml的DPAM溶液，不斷稀釋取20ul進樣，結(jié)果濃度為0.00005mg/ml的溶液峰高約為基線噪音的3倍，故DPAM最小檢測限為1.0ng。
8.定量限取線性項下濃度為0.005mg/ml的EPAM溶液，不斷稀釋取20ul進樣，結(jié)果濃度為0.000125mg/ml的溶液峰高約為基線噪音的10倍，故EPAM最小檢測限為2.5ng。見圖17。
取線性項下濃度為0.005mg/ml的DHAM溶液，不斷稀釋取20ul進樣，結(jié)果濃度為0.000125mg/ml的溶液峰高約為基線噪音的10倍，故DHAM最小檢測限為2.5ng。見圖18。
取線性項下濃度為0.005mg/ml的DPAM溶液，不斷稀釋取20ul進樣，結(jié)果濃度為0.000125mg/ml的溶液峰高約為基線噪音的10倍，故DPAM最小檢測限為2.5ng。見圖19。
9.加樣回收率準確稱取已準確定量的海狗油約50mg九份，精密稱定，分別置50ml棕色量瓶中，分別定量加入EPAM、DHAM、DPAM貯備溶液(精密吸取各對照品1ml，分別用用異丙醇稀釋至10ml)各4.0ml、5.0ml、6.0ml，每種濃度3份，衍生化后用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試溶液，進樣測定，照下式計算回收率

M測得量(mg)P原樣品液本底量(mg)A理論加入量(mg)結(jié)果見表6。
表6 海狗油加樣回收率

結(jié)果，海狗油加樣回收率良好。
10.耐用性
10.1樣品溶液穩(wěn)定性取重復(fù)性項下溶液，于室溫條件下放置，分別于0、2、6、12、24小時取20ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積計算，結(jié)果見表7。
表7 EPAM、DHAM、DPAM溶液穩(wěn)定性測定結(jié)果

結(jié)果表明海狗油溶液穩(wěn)定性良好。
10.2條件改變對分離度的影響將色譜柱ODSC18(5um，150×4.6mm)改為ODSC18(5um，250×4.6mm)，柱子型號由ODSC18改為PHENEGON。
結(jié)果采用ODSC18(5um，250×4.6mm)柱子，流動相乙腈-甲醇-水(6∶2∶2)，1.5ml/min，210nm波長處進行含量測定，分離度及柱效均符合要求。見圖20。
根據(jù)本發(fā)明，標準對照的指紋圖譜見圖2l～26。
該圖譜中除10.2分鐘以前溶劑峰外，有3個吸收峰，其單峰面積均超過總峰面積的25％的吸收峰有3個，分別為1號峰，平均保留時間Rt為25.009min，RSD為0.06％，平均峰面積為4215.84，RSD為0.36％；2號峰，平均保留時間Rt為32.506min，RSD為0.07％，平均峰面積為5568.583，RSD為0.23％；3號峰，平均保留時間Rt為42.790min，RSD為0.07％，平均峰面積為4428.999，RSD為0.55％；本發(fā)明通過對照指紋圖譜來測定海狗油中OMEGA3不飽和脂肪酸的含量，以控制含海狗油產(chǎn)品的質(zhì)量。
本發(fā)明的優(yōu)點如下1.與對照溶液所獲得的指紋圖譜相比，可確認海狗油供試品中OMEGA3不飽和脂肪酸含量的多少，便于確定產(chǎn)品的質(zhì)量。
2.本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。
本發(fā)明提供了一種測定海狗油中OMEGA3不飽和脂肪酸的方法，本發(fā)明是通過大量實驗所得到的切實可行的方法，具有重復(fù)性。在本發(fā)明中通過高效液相、在相同測試條件下所獲取的海狗油中OMEGA3不飽和脂肪酸組分高效液相指紋圖譜的重復(fù)性好，因此可通過將上述測定方法中建立的測定海狗油中OMEGA3不飽和脂肪酸的指紋圖譜作為標準指紋圖譜，作為測定含有OMEGA3不飽和脂肪酸產(chǎn)品的標準指紋圖譜，以鑒別其OMEGA3不飽和脂肪酸的含量。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它實施方案，本發(fā)明實施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種改變和改進。例如，使用不同的檢測儀器所獲得的測定結(jié)果可能有所不同，但只要使用本發(fā)明所述的質(zhì)量控制方法，均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。


下面給出海狗油檢測相關(guān)的HPLC圖譜，旨在進一步說明本發(fā)明，但對本發(fā)明并不構(gòu)成限制。
圖1 海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量對照HPLC圖譜1圖2 海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量對照HPLC圖譜2圖3 041002批海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量HPLC圖譜1-1圖4 041002批海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量HPLC圖譜1-2圖5 041006批海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量HPLC圖譜1-1圖6 041006批海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量HPLC圖譜1-2圖7 041010批海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量HPLC圖譜1-1圖8 041010批海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸含量HPLC圖譜1-2圖9A 測定波長的選擇圖9B 流動相摸索(乙腈-甲醇-水＝7∶1∶2)HPLC圖譜圖10 流動相摸索(乙腈-甲醇-水＝6∶2∶2)HPLC圖譜圖11 溶劑空白HPLC圖譜圖12 專屬性試驗(0天)HPLC圖譜圖13 專屬性試驗(高溫60℃、24h)HPLC圖譜圖14 專屬性試驗(高濕RH92.5％、24h)HPLC圖譜圖15 專屬性試驗(光照4500Lx±500Lx、24h)HPLC圖譜圖16 專屬性試驗(氧化試驗、24h)HPLC圖譜圖17 EPAM定量限HPLC圖譜圖18 DHAM定量限HPLC圖譜圖19 DPAM定量限HPLC圖譜圖20 柱效、分離度HPLC圖譜圖21 海狗油標準對照指紋圖譜1圖22 海狗油標準對照指紋圖譜2圖23 海狗油標準對照指紋圖譜3圖24 海狗油標準對照指紋圖譜4圖25 海狗油標準對照指紋圖譜5圖26 海狗油標準對照指紋圖譜6圖27 海狗油原油HPLC圖譜圖28 海狗油原油的圖譜與標準對照指紋圖譜的比較圖29 海狗油膠丸的圖譜與標準對照指紋圖譜的比較具體實施方式
實施例1制定標準對照指紋圖譜；精密量取對照液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
標準對照指紋圖譜結(jié)果 標準對照指紋圖譜見附圖21～26。
實施例2測定海狗油原油樣品的指紋圖譜；取海狗油樣品備用；取海狗油原油約100mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇鈉4ml，不斷振搖，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試溶液。精密量取供試溶液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
海狗油原油含量測定結(jié)果

海狗油原油HPLC圖譜見附圖27。
結(jié)果表明海狗油原油可以用此方法進行含量測定。
實施例3含有海狗油的膠丸的指紋圖譜測定取含有海狗油的膠丸的內(nèi)容物約100mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇鈉4ml，不斷振搖，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試溶液。精密量取供試溶液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
海狗油膠丸含量測定結(jié)果

海狗油膠丸的HPLC圖譜見附圖3～8。
實施例4實施例1的圖譜和實施例2的圖譜比較方法(見附圖28)在海狗油原油的圖譜中，與標準對照指紋圖譜相對應(yīng)的位置上有主成分峰出現(xiàn)，以外標峰面積法計算供試品原油中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)總百份含量。
實施例5實施例1的圖譜和實施例3的圖譜比較方法(見附圖29)在海狗油膠丸的圖譜中，與標準對照指紋圖譜相對應(yīng)的位置上有主成分峰出現(xiàn)，以外標峰面積法計算供試品膠丸中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)總百份含量。
實施例6
測算海狗油中不飽和脂肪酸的量；不飽和脂肪酸的量(％)＝A1+A2+A3其中 (A1、A2、A3分別為EPA、DPA、DHA在海狗油膠丸中所占的比例)f為系數(shù)，其中fEPA＝0.9557，fDPA＝0.9593，fDHA＝0.9590A樣供試品中被測成分的峰面積A對對照品中被測成分的峰面積C對對照品中被測成分的濃度W樣供試樣品的稱樣量D供試樣品的稀釋倍數(shù)以上均以外標峰面積法計算。
實施例7測算海狗油膠丸中不飽和脂肪酸的量；不飽和脂肪酸的量(％)＝A1+A2+A3(A1、A2、A3分別為EPA、DPA、DHA在海狗油膠丸中所占的比例)其中 f為系數(shù)，其中fEPA＝0.9557，fDPA＝0.9593，fDHA＝0.9590A樣供試品中被測成分的峰面積A對對照品中被測成分的峰面積C對對照品中被測成分的濃度W樣供試樣品的稱樣量D供試樣品的稀釋倍數(shù)W平均膠丸平均裝樣量W標膠丸標示量以上均以外標峰面積法計算。
權(quán)利要求
1.一種海狗油及含有海狗油的制劑中不飽和脂肪酸的含量的測定方法，其特征在于，經(jīng)過以下步驟步驟1、制定標準對照指紋圖譜；步驟2、測定海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜；步驟3、將上述指紋圖譜進行比較；步驟4、測算海狗油及含有海狗油的制劑中不飽和脂肪酸的量。
2.權(quán)利要求1的測定方法，其特征在于，步驟1中制定標準對照指紋圖譜；具體操作步驟如下(a)對照溶液的制備(1)取二十碳五烯酸甲酯(EPAM)對照品1ml(含EPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含EPAM 1mg的溶液，搖勻，作為EPAM儲備液；(2)取二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)對照品1ml(含DHAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DHAM 1mg的溶液，搖勻，作為DHAM儲備液；(3)取二十二碳五烯酸甲酯(DPAM)對照品1ml(含DPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DPAM 1mg的溶液，搖勻，作為DPAM儲備液；精密量取上述各儲備液各1ml，置10ml的棕色量瓶中，加0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，作為對照溶液；(b)色譜條件色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為6∶2∶2；檢測波長210±2nm；(c)測定精密吸取對照品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到對照品指紋圖譜。
3.權(quán)利要求1的測定方法，其特征在于，步驟2中測定海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜；；具體操作步驟如下(a)供試品的制備取海狗油原油或含有海狗油的制劑如海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸內(nèi)容物，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇鈉，不斷振搖，至小油滴完全消失，加冰乙酸，用甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液；(b)色譜條件色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為4～7∶1～3∶1～3；檢測波長200～400nm；(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到供試品指紋圖譜。
4.權(quán)利要求1的測定方法，其特征在于，步驟4中測算海狗油及含有海狗油的制劑中不飽和脂肪酸的量；是以外標峰面積法計算供試品中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)總百份含量。
5.權(quán)利要求1的測定方法，其特征在于，經(jīng)過以下步驟步驟1中制定標準對照指紋圖譜；具體操作步驟如下(a)對照溶液的制備(1)取二十碳五烯酸甲酯(EPAM)對照品1ml(含EPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含EPAM 1mg的溶液，搖勻，作為EPAM儲備液；(2)取二十二碳六烯酸甲酯(DHAM)對照品1ml(含DHAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DHAM 1mg的溶液，搖勻，作為DHAM儲備液；(3)取二十二碳五烯酸甲酯(DPAM)對照品1ml(含DPAM 10.0mg)，置10ml棕色量瓶中，加異丙醇定容至刻度，制成每1ml中含DPAM 1mg的溶液，搖勻，作為DPAM儲備液；精密量取上述各儲備液各1ml，置10ml的棕色量瓶中，加0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，作為對照溶液；(b)色譜條件色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為6∶2∶2；檢測波長210±2nm；(c)測定精密吸取對照品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到對照品指紋圖譜；步驟2中測定海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜；具體操作步驟如下(a)供試品的制備取海狗油ω-3多不飽和脂肪酸膠丸內(nèi)容物或海狗油原油約100mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加0.5mol/L的甲醇鈉4ml，不斷振搖，至小油滴完全消失，加0.2ml冰乙酸，用0.005％的甲醇BHT溶液定容至刻度，搖勻，用0.45um濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試溶液；(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為乙腈-甲醇-水，乙腈-甲醇-水的比例為6∶2∶2；檢測波長210±2nm；(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到供試品指紋圖譜。步驟3中是將供試品指紋圖譜和標準對照品指紋圖譜進行圖譜比較；步驟4中是以外標峰面積法計算供試品中二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPA)總百份含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海狗油中OMEGA3不飽和脂肪酸的測定方法，該方法采用液相色譜法，對海狗油中的不飽和脂肪酸如海狗油原油中EPA、DHA、DPA進行衍生化后用高效液相色譜法對其進行含量測定，根據(jù)標準品的圖譜和樣品的圖譜比較來判定海狗油中的不飽和脂肪酸的含量，特別是EPA、DHA、DPA的含量，本發(fā)明的方法包括下列步驟1.制定標準對照指紋圖譜；2.測定海狗油及含有海狗油的制劑的指紋圖譜；3.將上述指紋圖譜進行比較；4.測算海狗油及含有海狗油的制劑中不飽和脂肪酸的量。
文檔編號G01N1/28GK1920554SQ20051009326
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月23日
發(fā)明者葉正良, 王國成, 張廣明, 郭立民, 張旗 申請人:天津貝特藥業(yè)有限公司