專利名稱：檢測牙周病的檢驗試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測牙周病的檢驗試劑盒。本發(fā)明還涉及用于牙周病的診斷和發(fā)展風險預測的方法。
背景技術(shù)：
西方世界大約7-15％的成年人患有牙周炎，這使得它成為我們最常見的疾病之一。它是一種多種因素疾病，在牙齒和齒齦之間的凹處(pocket)存在致病菌是必要的而不是充分的判據(jù)。宿主的炎癥和免疫系統(tǒng)也在疾病的發(fā)生中起到至關(guān)重要的作用。牙周炎的發(fā)展被認為是對齒齦下細菌的慢性炎癥反應，其導致牙齒支持組織的破壞。它周期性發(fā)作并在早期可能被忽視。
破壞過程被認為是宿主防御系統(tǒng)和牙周袋內(nèi)特殊細菌菌種之間復雜的相互作用的結(jié)果。牙周病出現(xiàn)和發(fā)展中所涉及的致病菌包括，但不限于，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)(以前表示為Bacteroides gingivalis)，福賽斯擬桿菌(Bacteroidesforsythus)(現(xiàn)在也稱為Tannerella forsythensis)，伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)，齒垢密螺旋菌(Treponema denticola)和中間普雷沃氏菌(Prevotellaintermedia)。
在較近的幾年中，細菌的毒性產(chǎn)物(主要是毒素和酶)的重要性被廣泛地研究，并且被認為在發(fā)病機制中起主要作用(Eley和Cox(2003))。細菌被認為經(jīng)歷不同的生長階段，并在這些階段中在牙周袋內(nèi)具有或多或少的破壞性?；钚约毦a(chǎn)生毒性產(chǎn)物以有助于其在牙周袋中的存活和營養(yǎng)。在高細菌活性期間，那些毒性產(chǎn)物導致牙齒支持組織的破壞和宿主防御系統(tǒng)效能的減弱。
現(xiàn)今牙科醫(yī)生是通過測量牙周袋的探診深度、診察附著在牙槽骨上的牙齒的X光照片并參考探診出血(bleeding on probing)評估牙周炎。致病因素包括吸煙習慣、壓力和牙周炎的家族病史。該方法嚴重依賴于牙科醫(yī)生的主觀鑒定。探診深度僅僅是對過去的附著喪失的測量，其在現(xiàn)在發(fā)生的牙周炎或其未來的發(fā)展中幫助很小。探診出血能夠表明復原過程而不是破壞過程。
有時候微生物樣本被采集并送到實驗室通過培養(yǎng)或DNA技術(shù)(Socransky(1994)開發(fā)的棋盤式DNA-DNA雜交技術(shù))進行分析。但是，需要大約一個星期的時間獲得結(jié)果，并且僅能顯示某些細菌的存在，其不是必然表明牙周炎。
進行了大量的工作在來自患者口腔的液體，例如齦縫液(GCF)中尋找能夠診斷或預測牙周炎發(fā)生的化合物，主要是蛋白質(zhì)，例如酶或細胞因子。
直到現(xiàn)在還有大量的測試和測定法被開發(fā)(Armitage(2003))。這些測定法致力于鑒定細菌、細菌的毒性產(chǎn)物或宿主蛋白質(zhì)。
用于研究它們在牙周炎中的治療或預后價值的宿主來源的蛋白質(zhì)主要包括來自人炎癥系統(tǒng)的產(chǎn)物。這些蛋白質(zhì)的作用是配合(orchestrate)炎癥和免疫應答，重新塑造組織或幫助殺死侵入的細菌。
研究得最多的預期用于診斷牙周炎的宿主來源蛋白質(zhì)包括天然的絲氨酸蛋白酶(組織蛋白酶G、azurocidin、蛋白酶3、彈性蛋白酶)、膠原酶、轉(zhuǎn)氨酶(美國專利4,981,787，5,834,226和4,801,535)、堿性磷酸酶、β-葡萄糖苷酸酶(美國專利6,277,587)、二肽基肽酶(dipeptidyl pedidase)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(美國專利5,866,432)，基質(zhì)金屬蛋白酶(美國專利5,736,341和6,280,687)和細胞因子，例如白細胞介素(特別是IL-1β(美國專利5,328,829)、IL-6和IL-8)和炎癥介質(zhì)，例如前列腺素E2和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP′s)被認為是牙周病的標志。美國專利5,736,341公開了對MMP-8存在的檢測，美國專利5,866,432公開了對中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白存在的檢測以及美國專利6,280,687公開了MMP-13的存在。這三個專利提出了一種基于免疫色譜原理的用于牙周炎診斷和發(fā)展預測的快速牙科檢驗(chair side test)。然而，在Oringer(2002)所給出的來自美國牙周病學協(xié)會的報告文件中，指出了需要進行附加的研究以證實MMP′s在牙周病的發(fā)展中的作用。
美國專利6,406,873宣稱單獨的或結(jié)合的兩種炎癥介質(zhì)(纖溶酶原激活物抑制劑2和組織纖溶酶原激活物)能夠診斷牙周炎。
美國專利5,248,595描述了同時分析多達三種不同的牙周病原體的方法。
Chapple(1997)綜述了傳統(tǒng)的和現(xiàn)在使用的牙周診斷方法并得出結(jié)論，檢測標志物，例如齦縫液中堿性磷酸酶的存在，與臨床評估，例如分析組織顏色、探診牙周袋深度和檢測牙齒松動度相比更加靈敏和具有特異性。Chapple還得出結(jié)論，結(jié)合兩種或多種該標志物能夠產(chǎn)生最準確的用于診斷正在發(fā)生的或?qū)⒁l(fā)生的疾病活動性的手段，但是其沒有顯示該組合。
Jin等(1999)通過使用DNA探針技術(shù)研究了牙周袋中牙周病原體，即細菌的存在與齦縫液(GCF)中彈性蛋白酶之間的相關(guān)性。
Nisengard等(1992)描述了用于檢測牙齦卟啉單胞菌，伴放線放線桿菌和中間普雷沃氏菌存在的快速膠乳凝集檢驗。
Lamster等(1994)研究了臨床附著喪失和它與來自人白細胞的β-葡萄糖苷酸酶的相互關(guān)系。
Eley和Cox(1996)開發(fā)了一種牙科檢驗，其基于特異于來自牙齦卟啉單胞菌的gingipain的酶底物。
最近，開發(fā)了許多評估牙周病活動性的方法。然而，上述方法中沒有一種提供了足夠靈敏和特異的試驗以診斷牙周炎及其破壞模式。非特異性方法的一個結(jié)果是幾個實際沒有患牙周炎的患者將被治療。臨床觀察例如探診深度不夠可靠，因為深的牙周袋不是必然包含正在發(fā)生的炎癥，X光線照相術(shù)評估必須結(jié)合詳細的臨床觀察以給出正確的診斷，僅僅是在牙周袋中存在病原菌不能準確地反映疾病活動性。而且迄今為止開發(fā)的基于檢測宿主或細菌來源蛋白質(zhì)的酶學方法的診斷還不是足夠特異的，因為酶底物可以被多種不同的酶切割。
還研究了不同的細胞因子，但是沒有設(shè)計出快速且特異的檢驗。
因此牙科醫(yī)生需要牙科檢驗試劑盒，其優(yōu)選-是快速的，可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果。
-需要最少的時間和工作努力。
-是耐用的并且能夠在臨床環(huán)境中粗略地處理。
-提供容易解釋的結(jié)果。
-在室溫下或在冰箱中具有長的保存期限。
-適合牙科診所的托盤，是環(huán)保的并且提供良好的患者信息材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷并提供符合現(xiàn)在牙科醫(yī)生需要的檢驗試劑盒。更具體地說，本發(fā)明旨在提供用于檢測牙周病的檢驗試劑盒和方法，其是特異的、靈敏的并且易于使用。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了包括檢測源自細菌的物質(zhì)和源自人免疫或炎癥系統(tǒng)的物質(zhì)的共存的方法可以被用于這個目的。
本發(fā)明可以被用于幫助牙科醫(yī)生和牙科保健員向他們的患者提供更加有效的牙周病治療。本發(fā)明的檢驗試劑盒和方法可以被用于篩選可疑牙齒，以追蹤觀察先前的治療，決定最合適的治療形式，選擇正確種類的抗生素和告知患者每天良好的口腔衛(wèi)生的重要性。
在第一個方面，本發(fā)明涉及通過分析來自患者口腔的樣品診斷患者的牙周病的檢驗試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測源自細菌的第一物質(zhì)的第一檢測試驗和用于檢測源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的第二檢測試驗。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及通過分析來自患者口腔的樣品診斷患者的牙周病的檢驗試劑盒，所述試劑盒至少包括第一檢測試驗，其至少含有具有用于結(jié)合源自細菌的第一物質(zhì)的結(jié)合位點的第一親和配體，和第二檢測試驗，其至少含有具有用于結(jié)合源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的結(jié)合位點的第二親和配體。
優(yōu)選地，所述患者是哺乳動物，最優(yōu)選是人。
來自所述第一檢測試驗的結(jié)果結(jié)合來自所述第二檢測試驗的結(jié)果被用于檢測牙周病。
優(yōu)選所述第一物質(zhì)是由所述細菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選所述蛋白質(zhì)是細菌毒性產(chǎn)物，更優(yōu)選是酶或毒素。優(yōu)選的酶為蛋白酶，例如來自牙齦卟啉單胞菌的arg-gingipain和來自福賽斯擬桿菌的48 kDa蛋白酶。有益毒素的例子是來自伴放線放線桿菌的白細胞毒素。
第二物質(zhì)優(yōu)選是白細胞產(chǎn)物、細胞因子或人炎癥介質(zhì)。優(yōu)選的白細胞產(chǎn)物是天然絲氨酸蛋白酶，更優(yōu)選的是人中性白細胞彈性蛋白酶。優(yōu)選的細胞因子是白細胞介素-1β、白細胞介素-6和白細胞介素-8。有益炎癥介質(zhì)的例子是腫瘤壞死因子-α。
細菌來源的第一物質(zhì)和如上定義的第二物質(zhì)，優(yōu)選人中性白細胞彈性蛋白酶的共存應該顯示活性細菌和活性免疫或炎癥系統(tǒng)二者，并且這表明了牙周破壞。
顯然即使在科學界已經(jīng)充分確定了牙周病是一種多種因素疾病，但還沒有人開發(fā)同時分析樣品中細菌和宿主來源的產(chǎn)物的檢驗。
檢驗試劑盒還可以包括第三檢測試驗，其至少含有具有用于結(jié)合源自細菌或源自如上定義的患者免疫或炎癥系統(tǒng)，優(yōu)選源自細菌的第三物質(zhì)的結(jié)合位點的第三親和配體，并且在一些實施方案中甚至進一步可以含有用于結(jié)合附加物質(zhì)的檢測試驗。
優(yōu)選地，第一親和配體是表現(xiàn)與所述第一物質(zhì)選擇性結(jié)合的抗體，而第二親和配體是表現(xiàn)與所述第二物質(zhì)選擇性結(jié)合的抗體。
抗體的使用優(yōu)于其它方法(例如酶學方法)，因為一旦被開發(fā)和檢驗了交叉反應性，抗體對其目標就具有高的特異性，并且能夠檢測不同于酶的化學物質(zhì)，如毒素和細胞因子。此外，研制針對新抗原的新抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
優(yōu)選本發(fā)明檢驗試劑盒中的所述檢測試驗包括免疫色譜測定。
使用免疫色譜測定/方法的優(yōu)點之一是它們能夠容易地生產(chǎn)和使用，具有長的保存期限，產(chǎn)生快速結(jié)果并且能夠被設(shè)計為非常特異于預期檢測的物質(zhì)。
所述檢驗試劑盒進一步優(yōu)選含有支架，其配備有接收樣品的樣品存貯器，其中所述第一和第二檢測試驗被安排在所述支架上，直接或通過可移動安排的隔離工具與所述樣品存貯器接觸，該工具使所述樣品存貯器與所述檢測試驗隔離。所述試劑盒也可以含有附加的用于稀釋和調(diào)節(jié)用于所述檢測試驗的所述樣品的緩沖液，優(yōu)選在與所述樣品存貯器分開的緩沖液存貯器中，和至少一個用于獲得樣品的取樣裝置。
本發(fā)明所述檢驗試劑盒中含有的單個檢測試驗可以共同或單獨提供。在檢測試驗分開出售的情況下，伴隨取出的GCF等的樣品在每個試驗中被單獨分析，結(jié)果被結(jié)合以診斷牙周病。
本發(fā)明的檢驗試劑盒和方法用于牙周病的牙科檢驗，其中牙科醫(yī)生或牙科保健員從牙周袋中取出如GCF樣品。該樣品通過檢測試劑盒中提供的試驗進行分析，來自這些試驗的結(jié)果根據(jù)預先確定的標準進行判斷以評估正在發(fā)生的牙周病的發(fā)生。
在第二個方面，本發(fā)明涉及診斷牙周病和/或預測所述疾病的發(fā)展風險的方法，所述方法包括分析來自患者口腔的樣品中至少源自細菌的第一物質(zhì)的存在和源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的存在，第一和第二物質(zhì)如上述所定義。
此外，本發(fā)明的診斷方法也可以包括如上的檢測附加物質(zhì)存在的方法。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括使用顯示與所述第一物質(zhì)選擇性結(jié)合的第一抗體，其中所述第二方法包括使用顯示與所述第二物質(zhì)選擇性結(jié)合的第二抗體。
更優(yōu)選地，所述第一和第二方法的至少一種包括使用免疫色譜測定。


圖1顯示檢驗試劑盒的實施方案，其中兩種免疫色譜測定被安排在配備有樣品存貯器的支架上。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過分析來自患者口腔的樣品檢測患者牙周病的檢驗試劑盒，其中所述試劑盒至少包括第一檢測試驗，其至少含有具有用于結(jié)合源自細菌的第一物質(zhì)的結(jié)合位點的第一親和配體，和第二檢測試驗，其至少含有具有用于結(jié)合源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的結(jié)合位點的第二親和配體。
優(yōu)選地，所述來自患者口腔的樣品是齦縫液、植入物周圍溝液、唾液或漱口水樣品。
齦縫液(GCF)是從牙周袋流入口腔的液體。在炎癥情況下，GCF分別含有炎性細胞、細菌及其副產(chǎn)物，其內(nèi)容物可以被用作破壞性牙周炎的標志物。收集GCF是最低程度的侵入性過程，液體提供生化指示物的定量來源，其反映了患者的反應以及細菌的攻擊。
植入物周圍溝液是牙齒被牙植入物替代的情況下的GCF等同物，即從植入物部位流入口腔的液體。
如果希望進行第一和第二物質(zhì)的位點特異性檢測，GCF和植入物周圍溝液是優(yōu)選的，因為可以從每個被檢查的牙齒表面獲得截然不同的樣品。
唾液或漱口水樣品可以被用于獲得不是位點特異性的檢測或診斷。
在本文中使用的術(shù)語“牙周病”和牙周炎在廣義上應被理解為包括諸如牙周炎、植入物周圍炎(其中支持植入物的組織被分解)，以及如1999國際牙周疾病和病況分類研討會所定義的其它形式的牙周病這類疾病。
牙周病原菌，例如牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis)、福賽斯擬桿菌(Bacteroides forsythus)、伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋菌(Triponema denticola)和中間普雷沃氏菌(Prevotellaintermedia)能夠存在于口腔中以及牙齒和不含其的健康牙齦之間的牙周袋中，其導致牙周病的發(fā)展。細菌需要一定的生長條件和營養(yǎng)物質(zhì)的存在以成為活性的?；钚约毦a(chǎn)生毒性產(chǎn)物(例如以上提及的毒素和酶)以幫助其存活和營養(yǎng)。
牙齦卟啉單胞菌和福賽斯擬桿菌都產(chǎn)生已知為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的分子量為約50kDa的蛋白水解酶。來自牙齦卟啉單胞菌的蛋白酶之一被命名為arg-gingipain，來自福賽斯擬桿菌的蛋白酶之一是48kDa蛋白酶。伴放線放線桿菌產(chǎn)生116kDa的白細胞毒素，其是孔形成白細胞毒素(pore-forming leukotoxins)的毒素內(nèi)重復(repeats-in-toxin)外蛋白家族的成員，對人多形核白細胞具有特異的細胞毒性。
在優(yōu)選的實施方案中，所述第一物質(zhì)是細菌毒性產(chǎn)物，優(yōu)選是酶，如蛋白酶，更優(yōu)選來自牙齦卟啉單胞菌的arg-gingipain和來自福賽斯擬桿菌的48kDa蛋白酶或者毒素，更優(yōu)選來自伴放線放線桿菌的白細胞毒素。
毒性產(chǎn)物的存在可以激發(fā)宿主的炎癥反應和免疫系統(tǒng)，從而在感染部位聚集防御系統(tǒng)細胞，例如多形核(PMN)白細胞。
白細胞不能應付感染部位大量的細菌和細菌產(chǎn)物，來自白細胞粒(leukocyte granulates)的酶被釋放到牙周袋中。這些最初為了殺死侵入的細菌的酶對周圍組織具有高破壞性。人中性白細胞彈性蛋白酶已顯示出降解牙齒周圍的許多支持組織。彈性蛋白酶經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)在牙周袋中與其蛋白酶抑制劑(α-1抗胰蛋白酶)相結(jié)合。然而，來自牙齦卟啉單胞菌的蛋白酶已顯示出降解人血清中蛋白酶抑制劑α-1抗胰蛋白酶和α-2巨球蛋白，在牙周或植入物周圍袋中剩下高破壞形式的彈性蛋白酶。
本文中，“源自免疫或炎癥系統(tǒng)”的物質(zhì)是指源自參與免疫或炎癥系統(tǒng)的細胞的物質(zhì)。該物質(zhì)可以由所述細胞分泌，或者可以源自所述細胞的溶解，例如用于配合免疫和炎癥應答或者重新塑造組織或者殺死侵入的細菌。
第二物質(zhì)可以是白細胞產(chǎn)物，諸如天然絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選人中性白細胞彈性蛋白酶或者細胞因子，諸如白細胞介素，優(yōu)選選自白細胞介素-1β、白細胞介素-6以及白細胞介素-8、或者炎癥介質(zhì)，優(yōu)選腫瘤壞死因子-α或者可能為前列腺素E2。
最優(yōu)選地，所述第二物質(zhì)為人中性白細胞彈性蛋白酶。
適合本發(fā)明的檢測的源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的其它物質(zhì)包括，但不限于，膠原酶、轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、β-葡萄糖苷酸酶、二肽基肽酶、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶。
最優(yōu)選地，所述第一物質(zhì)為細菌毒性產(chǎn)物，而所述第二物質(zhì)為人中性白細胞彈性蛋白酶。
至少細菌來源的第一物質(zhì)和如前文所定義的第二物質(zhì)，優(yōu)選人中性白細胞彈性蛋白酶的共存應該顯示活性細菌和活性免疫或炎癥系統(tǒng)二者，并且這表明了牙周病。因此檢測至少所述第一物質(zhì)和所述第二物質(zhì)的共存是有益的。
在某些情況下，本發(fā)明的檢驗試劑盒包括用于檢測所述樣品中附加物質(zhì)的附加檢測試驗，優(yōu)選所述附加物質(zhì)選自如前文所述的源自細菌的物質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的檢驗試劑盒所述第一親和配體包含顯示與所述第一物質(zhì)選擇性結(jié)合的第一抗體，而所述第二親和配體包含顯示與所述第二物質(zhì)選擇性結(jié)合的第二抗體。
本文中，“抗體”是指單克隆抗體、多克隆抗體、合成產(chǎn)生的抗體或者抗體等同物及其功能性片段。
特別適合本發(fā)明的抗體為特異性結(jié)合于任意以上提到的第一或第二物質(zhì)的抗體。針對人中性白細胞彈性蛋白酶的抗體可從MPBiomedicals購得。針對來自伴放線放線桿菌的白細胞毒素的抗體已經(jīng)被研制出來(Johansson et al.2000)，針對來自牙齦卟啉單胞菌的蛋白酶的抗體也已經(jīng)被研制出來(Nakagawa et al.2001)。
本文中，“試驗”是指檢測樣品中一種或多種物質(zhì)存在和/或測定其數(shù)量的方法?；谠囼灥姆治鼋Y(jié)果為可檢測的反應，例如顏色、熒光、吸光率和/或發(fā)光上的變化，傳導性的變化、放射性的變化等。
適合與本發(fā)明檢驗試劑盒一起使用的檢測試驗可以基于幾種免疫學方法之一。該方法包括，但不限于，免疫色譜法、免疫測定法、免疫凝集法、熒光免疫法、免疫發(fā)光法、比濁免疫法、ELISA和濁度測定法。
在本發(fā)明的檢驗試劑盒的優(yōu)選實施方案中，所述第一和第二檢測試驗提供免疫色譜測定、優(yōu)選具體為所謂“色條試驗(strip-test)”，其作為側(cè)向流動試驗實施。有幾種免疫色譜測定的不同變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。每種免疫色譜測定優(yōu)選使用兩種特異于待檢測物質(zhì)的不同抗原決定簇的抗體。
此外，可以使多于一種檢測試驗配合一個單獨的色條試驗，以便兩種或者多種特定物質(zhì)的存在能夠在一個單獨的條帶上被檢測到。
而且，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以設(shè)計免疫色譜測定以使得樣品中需要有預定臨界數(shù)量的被尋找物質(zhì)以產(chǎn)生陽性信號。
本發(fā)明還涉及診斷牙周疾病和/或預測所述疾病的發(fā)展風險的方法，所述方法包括分析來自患者口腔的樣品中源自細菌的至少第一物質(zhì)的存在以及源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的存在。
在本發(fā)明的方法中，來自患者口腔的樣品以及第一和第二物質(zhì)如前文所定義。
在某些情況下，本發(fā)明的診斷方法進一步包含檢測所述樣品中如前文所定義的附加物質(zhì)的存在的步驟。
在本發(fā)明所述診斷方法的優(yōu)選實施方案中，所述第一方法包括使用顯示與所述第一物質(zhì)選擇性結(jié)合的第一抗體，而所述第二方法包括使用顯示與所述第二物質(zhì)選擇性結(jié)合的第二抗體，其中所述抗體如前文所定義。
最優(yōu)選地，所述第一和第二方法中至少一種包括使用免疫色譜方法。
適于與本發(fā)明方法一起使用的其它檢測方法可以基于幾種免疫學方法之一。所述方法包括，但不限于，免疫色譜法、免疫測定法、免疫凝集法、熒光免疫法、免疫發(fā)光法、比濁免疫法、ELISA和濁度測定法。
優(yōu)選的實施方案優(yōu)選本發(fā)明的檢驗試劑盒，如圖1中所圖解的，包括兩個免疫色譜檢測試驗1，2，其被安排在配備有用于接收樣品的樣品存貯器4的支架3上。這兩個檢測試驗1，2被安排，直接或通過可移動安排的隔離工具5與樣品存貯器4相接觸。
樣品存貯器4優(yōu)選用支架材料構(gòu)成。支架3可以用幾種不同的材料制造，例如塑料、紙、紙板或者其組合，諸如壓有塑料層的紙。檢測試驗1，2以這種形式安排在支架3上使得每個試驗的樣品接收區(qū)域直接或通過可移動安排的隔離工具5與樣品存貯器4相接觸。所述隔離工具5可以是覆蓋試驗上樣品接收區(qū)域的可移動的隔擋、使存貯器與試驗隔離的障礙物等。
試劑盒可以進一步包含附加的用于稀釋和調(diào)節(jié)用于所述檢測試驗的所述樣品的緩沖液和至少一個用于獲得待分析的樣品的取樣裝置。適用的取樣裝置的類型可以取決于待分析的樣品的類型。例如齦縫液為粘性液體并且能夠容易地通過小刷子、牙線、吸水紙尖或一次性吸管進行收集。其它用于獲取唾液或漱口水樣品的取樣裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。優(yōu)選緩沖液與樣品存貯器分開保存在緩沖液存貯器中，例如分開的燒瓶、在支架上形成的附加的存貯器或者在位于樣品存貯器中的可穿孔的袋子內(nèi)。
在獲得樣品之后，優(yōu)選與緩沖液相混合以獲得適合檢測試驗的pH，離子強度和粘度?；旌现螅瑯悠繁晦D(zhuǎn)移至樣品存貯器，從而，可選通過移去隔離工具，使其與檢測試驗的接收區(qū)域相接觸。
通過毛細管流，使得樣品沿著纖維素帶遷移至另一區(qū)域，在該區(qū)域通過液體流動獲得由特異于將通過檢測試驗進行分析的蛋白(抗原)的一個抗原決定簇的抗體包被的小顆粒(例如膠態(tài)金或者膠乳)。存在于樣品中的抗原附著于結(jié)合有抗體的顆粒上并且進一步沿著纖維素帶遷移。進一步沿著毛細管流的路徑，不可逆地結(jié)合至帶上，為識別該抗原的另一個抗原決定簇的另一個抗體(單克隆或多克隆的)。已經(jīng)捕獲抗原的顆粒附著于帶上第二抗體結(jié)合的區(qū)域，其中抗原夾在顆粒和結(jié)合有相應抗體的帶之間。
如果在同一區(qū)域捕獲足夠的顆粒，帶上形成可以看到的線(檢驗線)。沒有捕獲到抗原的顆粒繼續(xù)沿著帶下行，有些在功能控制線上被捕獲。顆粒太小無法用人眼逐個看見。只有當在同一區(qū)域捕獲足夠的顆粒時，才能形成可以看到的線。
上述過程基本上在兩條帶上同時發(fā)生，由此在幾分鐘之內(nèi)獲得每個被分析的物質(zhì)的一個結(jié)果。
上述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案以及下面的實驗僅旨在舉例說明目的，而不應理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍由附加的權(quán)利要求所限定。
實驗材料與方法用于下面的研究的樣品從已經(jīng)委托瑞典Kristianstad的公共牙科機構(gòu)，牙周病學學部進行牙周治療的16名志愿者中獲得。患者的年齡在28至54歲之間，平均年齡為40歲。所有個體均具有位于不同的牙齒上的至少三個探診深度大于或等于6mm的部位。沒有患者在之前的6個月中進行了醫(yī)療處理或者接受牙周和/或抗生素治療。
隔一周，一式兩份進行取樣和臨床檢查。用于酶分析的樣品在微生物取樣和臨床檢查之前被收集。第一次取樣和檢查在給予任何治療之前進行(基線，檢測1)。第二次取樣和檢查發(fā)生在第一次治療結(jié)束之后的6個月(檢測2)，第三次在第二次治療結(jié)束后的再一個6個月(檢測3)。
在基線檢查之后，所有患者接受口腔衛(wèi)生保健指導和整個牙列的牙齦上和牙齦下的清創(chuàng)術(shù)。在第二次治療期間，在總厭氧活菌計數(shù)中牙齦卟啉單胞菌≥0.5％或者中間普雷沃氏菌≥5％，或者牙齦下樣品中存在伴放線放線桿菌的所有部位進行麻醉下的牙周手術(shù)或矯正。所有選擇用于研究的其它部位均接受牙齦上磨光處理。
從每個患者中，在初始探診深度≥6mm的3至10個部位收集樣品。取樣區(qū)域被干燥并且用棉卷隔離，并且，在牙齦上，用無菌刮匙和棉棒仔細地移除牙垢。對于酶分析，三個介質(zhì)吸水紙尖(Johnson andJohnson，Windsor，NJ)被連續(xù)插入至牙周溝中約1mm并且保留15秒。每個吸水紙尖的潮濕的部分用無菌剪刀剪下并且放入含有100μl0.85％NaCl的微細吸收管(Nunc，Rosklide，Denmark)中。樣品立即在-20℃冷凍并且在-80℃存放6小時，直至分析。對微生物分析，3個吸水紙尖被連續(xù)插入到牙周袋中直至遇到阻力并且在該處放置15秒。吸水紙尖被放入含有10個直徑為3mm的玻璃珠以及3.3ml的VMGAIII運送培養(yǎng)基的管形瓶中，在有氧條件下制備和貯存。樣品在24小時內(nèi)被加工。細菌在富集布氏瓊脂平板上生長并且通過合適的方法被鑒別。
為研究診斷檢驗的合適截斷值，我們用選擇性底物研究了來自人噬中性白細胞的彈性蛋白酶以及來自牙齦卟啉單胞菌的arg-gingipain。
第一組雙份樣品被用于酶分析。所有的樣品在冰上解凍并且在13,000xg離心3分鐘。
用于檢測來自牙齦卟啉單胞菌的arg-gingipain的酶底物為在含有5％DMSO的測定緩沖液中具有1mM終濃度的N-苯甲酰-L-精氨酸-對-硝基苯胺(BAPNA)。測定緩沖液為含有5mM CaCl，pH為7.5，含有50mM甘氨酰-甘氨酸以及5mML-半胱氨酸的0.1M的Tris-HCl(如以前被本發(fā)明人在專利US 5,981,164中所報道的在arg-gingipain存在下甘氨酸-甘氨酸選擇性刺激BAPNA)。在加入50μL底物前，10μL的樣品與140μL的測定緩沖液在用牛血清白蛋白預涂的96孔微量滴定平板的孔中預溫育15分鐘。平板在增濕室中37℃溫育，并且從12至36小時每隔幾個小時用微量滴定平板讀取器通過分光光度法以O(shè)D405讀取值監(jiān)視pNA的釋放。一個單位的活性等于在一個小時溫育中酶解1mmol底物的酶的量。
通過加入5μl的CGF至含有145μl測定緩沖液(pH為7.5的1M Tris，0.5M NaCl)的96孔微量滴定平板的孔中進行彈性蛋白酶測定。15分鐘后，通過加入50μl的2mM甲氧琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-纈氨酸-pNA在含有20％DMSO的測定緩沖液中的溶液開始反應。平板在增濕室中37℃溫育。釋放pNA的酶促反應從12至26小時每隔幾小時用微量滴定平板讀取器(Molecular Devices)在OD405讀取并且與稀釋的純化酶的標準品相比較。記錄的讀取值針對時間作圖并且從圖的線性部分以DA405/60分鐘計算酶活性。每個位置彈性蛋白酶的量以ng表示。
截斷(cut-off)研究中包括具有牙齦卟啉單胞菌生長或者存在甘氨酸-甘氨酸刺激的BAPNA活性但是沒有伴放線放線桿菌生長的患者。這個標準從8個不同的患者中獲得35個位置。在這個有限的研究中使用初期治療一年后的檢測。用壓力平衡探針從牙周袋底部至根部牙骨質(zhì)邊緣測量的附著喪失被用作牙周病進一步發(fā)展的度量。分析彈性蛋白酶和arg-gingipain預測進一步的附著喪失的能力。單獨地將彈性蛋白酶截斷水平設(shè)置為每個位置20ng而將arg-gingipain設(shè)置為每個位置0.27單位。
結(jié)果

作為進一步附著喪失預測物的彈性蛋白酶產(chǎn)生50％的敏感性和93％的特異性。用Fisher′s精密檢驗計算得到0.0264*的p值。

作為進一步附著喪失預測物的Arg-gingipain產(chǎn)生了100％的敏感性和55％的特異性。用Fisher′s精確檢驗計算得到0.0216*的p值。
對單獨的彈性蛋白酶和arg-gingipain而言，不得不喪失敏感性或者特異性。這促使我們研究這兩種酶的組合。我們研究了這兩種酶的新截斷水平，發(fā)現(xiàn)彈性蛋白酶的檢測極限應當為每個位置2ng而arg-gingipain為0.30單位。

作為進一步附著喪失預測物的彈性蛋白酶和arg-gingipain的組合產(chǎn)生了83％的敏感性和90％的特異性。用Fisher′s精確檢驗計算得到小于0.001***的p值。該有限的數(shù)據(jù)顯示了作為牙周疾病標志物的彈性蛋白酶和arg-gingipain的組合可產(chǎn)生統(tǒng)計學上比任一單個酶更顯著的檢驗。
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權(quán)利要求
1.通過分析來自患者口腔的樣品檢測患者牙周病的檢驗試劑盒，其中所述試劑盒至少包括檢測源自細菌的第一物質(zhì)的第一檢測試驗，以及檢測源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的第二檢測試驗。
2.按照權(quán)利要求1的檢驗試劑盒，其中所述的第一檢測試驗至少包括具有用于結(jié)合所述源自細菌的第一物質(zhì)的結(jié)合位點的第一親和配體，所述第二檢測試驗至少包含具有用于結(jié)合所述源自患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的結(jié)合位點的第二親和配體。
3.按照權(quán)利要求1或2的檢驗試劑盒，其中所述第一物質(zhì)為細菌毒性產(chǎn)物。
4.按照權(quán)利要求3的檢驗試劑盒，其中所述的第一物質(zhì)為酶。
5.按照權(quán)利要求4的檢驗試劑盒，其中所述酶為蛋白酶。
6.按照權(quán)利要求5的檢驗試劑盒，其中所述的蛋白酶選自來源于牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的arg-gingipain和來源于福賽斯擬桿菌(Bacterioides forsythus)的48kDa蛋白酶。
7.按照權(quán)利要求3的檢驗試劑盒，其中所述的第一物質(zhì)為毒素。
8.按照權(quán)利要求7的檢驗試劑盒，其中所述的毒素為來源于伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)的白細胞毒素。
9.按照前述權(quán)利要求中任一項的檢驗試劑盒，其中所述的第二物質(zhì)為白細胞產(chǎn)物。
10.按照權(quán)利要求9的檢驗試劑盒，其中所述的白細胞產(chǎn)物為天然絲氨酸蛋白酶。
11.按照權(quán)利要求10的檢驗試劑盒，其中所述的天然絲氨酸蛋白酶為人中性白細胞彈性蛋白酶。
12.按照權(quán)利要求1-8中任一項的檢驗試劑盒，其中所述的第二物質(zhì)為細胞因子。
13.按照權(quán)利要求12的檢驗試劑盒，其中所述的細胞因子為白細胞介素。
14.按照權(quán)利要求13的檢驗試劑盒，其中所述的白細胞介素選自白細胞介素-1β、白細胞介素-6和白細胞介素-8。
15.按照權(quán)利要求12的檢驗試劑盒，其中所述細胞因子為炎癥介質(zhì)。
16.按照權(quán)利要求15的檢驗試劑盒，其中所述的炎癥介質(zhì)選自腫瘤壞死因子-α和前列腺素E2。
17.按照權(quán)利要求2至16中任一項的檢驗試劑盒，其中所述的第一親和配體為顯示與所述第一物質(zhì)選擇性結(jié)合的第一抗體，所述的第二親和配體為顯示與所述第二物質(zhì)選擇性結(jié)合的第二抗體。
18.按照權(quán)利要求17的檢驗試劑盒，其中每個所述的第一和第二檢測試驗都提供免疫色譜測定。
19.按照前述任一權(quán)利要求的檢驗試劑盒，進一步包含配備有接收所述樣品的樣品存貯器的支架，其中所述第一和第二檢測試驗被安排在所述的支架上，其直接或通過使所述樣品存貯器與所述檢測試驗隔離的可移動安排的隔離工具與所述樣品存貯器相接觸。
20.按照前述任一權(quán)利要求的檢驗試劑盒，進一步包含用于稀釋和調(diào)節(jié)用于所述檢測試驗的所述樣品的附加緩沖液。
21.按照權(quán)利要求20的檢驗試劑盒，進一步包含與所述樣品存貯器分開的緩沖液存貯器。
22.按照前述任一權(quán)利要求的檢驗試劑盒，進一步包含至少一個用于獲得所述樣品的取樣裝置。
23.按照前述任一權(quán)利要求的檢驗試劑盒用于檢測牙周病的用途。
24.診斷牙周病和/或預測所述疾病的發(fā)展風險的方法，所述方法包括分析來自患者口腔的樣品中來源于細菌的至少第一物質(zhì)的存在和來源于患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的存在。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中所述第一物質(zhì)為細菌毒性產(chǎn)物。
26.按照權(quán)利要求25的方法，其中所述的第一物質(zhì)為酶。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中所述的酶為蛋白酶。
28.按照權(quán)利要求27的方法，其中所述的蛋白酶選自來源于牙齦卟啉單胞菌的arg-gingipain和來源于福賽斯擬桿菌的48kDa蛋白酶。
29.按照權(quán)利要求25的方法，其中所述的第一物質(zhì)為毒素。
30.按照權(quán)利要求29的方法，其中所述的毒素為來源于伴放線放線桿菌的白細胞毒素。
31.按照權(quán)利要求24-30中任一項的方法，其中所述的第二物質(zhì)為白細胞產(chǎn)物。
32.按照權(quán)利要求30的方法，其中所述的白細胞產(chǎn)物為天然絲氨酸蛋白酶。
33.按照權(quán)利要求32的方法，其中所述的天然絲氨酸蛋白酶為人中性白細胞彈性蛋白酶。
34.按照權(quán)利要求24-30中任一項的方法，其中所述的第二物質(zhì)為細胞因子。
35.按照權(quán)利要求36的方法，其中所述的細胞因子為白細胞介素。
36.按照權(quán)利要求35的方法，其中所述的白細胞介素選自白細胞介素-1β、白細胞介素-6和白細胞介素-8。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其中所述細胞因子為炎癥介質(zhì)。
38.按照權(quán)利要求37的方法，其中所述的炎癥介質(zhì)選自腫瘤壞死因子-α和前列腺素E2。
39.按照權(quán)利要求24-38中任一項的方法，其中所述的分析包括用選擇性地檢測所述第一物質(zhì)存在的第一方法和選擇性檢測所述第二物質(zhì)存在的第二方法分析所述樣品。
40.按照權(quán)利要求39的方法，其中所述的第一方法包括使用顯示與所述第一物質(zhì)選擇性結(jié)合的第一抗體，而其中所述的第二方法包括使用顯示與所述第二物質(zhì)選擇性結(jié)合的第二抗體。
41.按照權(quán)利要求40的方法，其中所述第一和第二方法中的至少一種包括使用免疫色譜測定。
全文摘要
通過分析來自患者口腔的樣品診斷患者牙周病的檢驗試劑盒。檢驗試劑盒至少包括用于檢測來源于細菌的第一物質(zhì)的第一檢測試驗和檢測來源于患者免疫或炎癥系統(tǒng)的第二物質(zhì)的第二檢測試驗。最優(yōu)選地，所述第一物質(zhì)為諸如來源于牙齦卟啉單胞菌的arg－gingipain的細菌毒性產(chǎn)物，所述第二物質(zhì)為人中性白細胞彈性蛋白酶。
文檔編號G01N33/68GK1906486SQ200480041129
公開日2007年1月31日 申請日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者T·本特松, M·維克斯特倫 申請人:滕德拉股份公司