用于人乳頭瘤病毒16基因檢測(cè)的生物試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于人乳頭瘤病毒16（HPV16）基因檢測(cè)的生物試劑盒、其制備方法以及在基因檢測(cè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案涉及引物和探針的設(shè)計(jì)、合成和純化以及細(xì)胞提取液的配置和標(biāo)準(zhǔn)品的制備。所述試劑盒的組分包括：DNA提取液，HPV16PCR反應(yīng)液，HPV16強(qiáng)陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。采用本發(fā)明的試劑盒可通過PCR基因擴(kuò)增的方法進(jìn)行HPV16基因檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV16的篩查和臨床診斷。本發(fā)明的試劑盒用于基因檢測(cè)的步驟簡(jiǎn)便、檢測(cè)效率高、結(jié)果可靠。
【專利說明】用于人乳頭瘤病毒16基因檢測(cè)的生物試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域的基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及用于人乳頭瘤病毒16(HPV16)基因檢測(cè)的生物試劑、其制備方法以及基因的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一種最小的DNA (脫氧核糖核酸)病毒。HPV呈球形，直徑約為45~55nm，具有嗜上皮性，在人和動(dòng)物中分布廣泛。HPV在自然界中廣泛存在，人類感染HPV十分普遍，感染率也很高。綜合國(guó)外一些報(bào)道，在自然人群中HPV感染率從低于I %到高達(dá)50 %，在性活躍人群中20 %~80 %以上的人有HPV感染史。
[0003]HPV病毒在臨床上可分為許多的亞型，而不同亞型的病毒可能導(dǎo)致不同的疾病。另外，根據(jù)致病力的程度或危險(xiǎn)性大小，可將不同的亞型分為低危和高危兩大類，其中HPV高危亞型的感染會(huì)引起生殖器癌和子宮頸癌上皮細(xì)胞病變。人乳頭瘤病毒16 (HPV16)屬于高危亞型，是宮頸癌的重要致病因素。
[0004]目前宮頸癌的篩查主要是基于細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)方法，有宮頸巴氏(Pap)涂片、陰道鏡活檢、液基薄層細(xì)胞學(xué)或薄片制備細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)等多種。
[0005]宮頸巴氏涂片是群體篩查的常規(guī)手段，但受取材、涂片制作質(zhì)量、閱片技術(shù)影響，準(zhǔn)確性低，假陽性率高，重復(fù)性差，敏感性也有限，漏診率可達(dá)30%。TCT法會(huì)引起不適、操作不便、費(fèi)用高，不易為廣大患者接受。宮頸組織活檢有創(chuàng)傷，不利于人群普查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)試劑盒，用于快速檢測(cè)人乳頭瘤病毒16(HPV16)類型。HPV16檢測(cè)簡(jiǎn)單易行，標(biāo)本可由醫(yī)生采集或患者自取，是對(duì)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法的重要補(bǔ)充。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于人乳頭瘤病毒16型(HPV16)基因檢測(cè)的生物試劑、制備方法以及基因檢測(cè)方法。
[0008]一方面，本發(fā)明提供了一種用于HPV16基因檢測(cè)的試劑盒。所述試劑盒的組分包括:引物、探針、Taq聚合酶、IOXbuffer緩沖液、dNTP、試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品和超純水。
[0009]其中，合成的引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成。根據(jù)HPV的不同分型設(shè)計(jì)不同引物和探針。
[0010]另一方面，本發(fā)明還提供了用于HPV16基因檢測(cè)的試劑盒的制備方法，其包括下述步驟:
[0011]I)確定待測(cè)基因片段:根據(jù)科技文獻(xiàn)的方向性報(bào)道初步選定候選基因片斷，然后經(jīng)研發(fā)過程中與待檢樣本病理相關(guān)性的比較，最終確認(rèn)與臨床疾病最具相關(guān)性的待測(cè)基因片斷；
[0012]2)根據(jù)所述待測(cè)基因片段設(shè)計(jì)并生產(chǎn)引物和探針，采用多核苷酸合成儀生產(chǎn)所述引物；[0013]3)提取細(xì)胞基因組DNA:用DNA提取液提取病人基因組及對(duì)照組基因組DNA ；[0014]4)確定PCR擴(kuò)增條件，其包括酶、探針、引物、基因組DNA用量及PCR的擴(kuò)增條件:不同組合的引物片斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性，敏感性等技術(shù)特征，反復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行多條所述待測(cè)基因片斷的檢測(cè)反應(yīng)，最終確定包括所述引物、探針最佳濃度及酶的最佳反應(yīng)條件，其中，PCR基因擴(kuò)增的結(jié)果由熒光PCR儀來檢測(cè)；
[0015]5)進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)以進(jìn)一步確定反應(yīng)條件:通過大量實(shí)驗(yàn)，反復(fù)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果中包括清晰度和靈敏性的因素，最終確定反應(yīng)條件；
[0016]6)根據(jù)最終確定的所述反應(yīng)條件，制備試劑盒，其組分包括:引物、探針、dNTP、IOXbuffer緩沖液、Taq聚合酶、試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品和超純水。
[0017]又一方面，本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行HPV16基因檢測(cè)的方法。
[0018]采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行HPV16基因檢測(cè)，其中所述試劑盒的組分包括:細(xì)胞提取液、引物、探針、dNTPUOXbuffer緩沖液、Taq聚合酶、試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品和超純水。
[0019]本發(fā)明以用基因組提取試劑盒提取的患者的細(xì)胞基因組DNA為模板，用試劑盒提供的引物、探針、dNTP、酶、試劑標(biāo)準(zhǔn)品等組分，20 μ L反應(yīng)體系，按照特定的比例分別加入，采用PCR基因擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV的基因檢測(cè)。
[0020]具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0021]I)試劑準(zhǔn)備:取PCR反應(yīng)液備用。
[0022]2)加樣:向準(zhǔn)備好試劑的0.2ml離心管中，分別加入處理后的樣品(包括和強(qiáng)陽性質(zhì)控品)上清液I μ 1,8，OOOrpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。
[0023]3)程序編輯:按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、以及未知標(biāo)本(含陽性質(zhì)控品)，并在樣本參數(shù)中設(shè)置樣品名稱。設(shè)置程序后運(yùn)行。
[0024]本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵涉及引物和探針的設(shè)計(jì)、合成和純化以及細(xì)胞提取液的配置和標(biāo)準(zhǔn)品的制備。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用PCR基因擴(kuò)增的方法檢測(cè)基因分型，方法設(shè)計(jì)和流程比較簡(jiǎn)單；醫(yī)院的投入比較少，一般醫(yī)院的設(shè)備就可以檢測(cè)；使用方便，無需特殊儀器和酶切步驟；檢測(cè)耗時(shí)較短；檢測(cè)效率高，結(jié)果可靠、有效，可用于HPV的篩查和臨床診斷，具有相當(dāng)大的市場(chǎng)潛力。
[0026]基因擴(kuò)增是所有DNA分析技術(shù)中最靈活和靈敏的手段，本發(fā)明以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法是進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)及分型的最好方法。本發(fā)明的試劑盒及其方法可以應(yīng)用于檢測(cè)、病毒負(fù)荷定量、DNA測(cè)序和突變分析，也可以進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，同時(shí)分析多個(gè)DNA序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]有關(guān)本發(fā)明的上述簡(jiǎn)要介紹以及下述的詳細(xì)描述，結(jié)合附圖會(huì)得到更好的理解。
[0028]圖1描述用試劑盒提取b，c，d三個(gè)臨床樣本的基因組。圖中:a表示HPV16陽性對(duì)照組，b，c，d分別為三個(gè)感染HPV患者的臨床樣本基因組，e表示陰性對(duì)照組。采用HPV16引物16F1，16R1和探針16P1進(jìn)行PCR，F(xiàn)AM熒光信號(hào)檢測(cè)；結(jié)果如圖1所示，a顯示為標(biāo)準(zhǔn)S型曲線、b，c，d樣本的曲線也為S曲線，e顯示為直線。因此確定b，c, d患者感染HPV為16亞型?！揪唧w實(shí)施方式】
[0029]在對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不局限于下述有關(guān)發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。同時(shí)也應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語只是用于針對(duì)特定的實(shí)施方式進(jìn)行描述，而不是用來進(jìn)行限制。
[0030]所用DNA合成儀為德國(guó)polygen，引物的制備方法是采用固相亞磷酰胺三酯法，亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相鄰的核苷酸通過3’ 一5’磷酸二酯鍵連接。 [0031]檢測(cè)中所需要的儀器設(shè)備主要有:DNA合成儀，熒光PCR儀等。
[0032]本試劑盒檢測(cè)分析的原理是:按照HPV16病毒鑲嵌在人體基因組中，而正常人中沒有，因此，當(dāng)以兩種人的基因組為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增時(shí)，病人出現(xiàn)病毒的目的條帶即S曲線，而正常人不出現(xiàn)條帶即無S曲線。用此種方法來檢測(cè)宮頸癌病人。
[0033]實(shí)施例1.引物的制備
[0034]本例中引物的制備包括以下步驟:
[0035]用德國(guó)polygenDNA合成儀合成引物和探針，
[0036]I)打開儀器和軟件。
[0037]2)校準(zhǔn)試劑選擇滑塊和校準(zhǔn)10個(gè)柱子的滑塊。
[0038]3)開啟自動(dòng)沖洗功能將液體充滿各個(gè)管子。
[0039]4)用CPG填充柱子滑塊中的孔。
[0040]在合成以前，應(yīng)將柱子滑塊里填充正確的CPG，柱子中填充好的CPG含有對(duì)應(yīng)的3’端的核苷酸，因?yàn)閮x器合成寡核苷酸的順序是從3’端到5’端完成的。
[0041]注意:加CPG過程中不能突然觸擊濾膜，否則可能會(huì)有泄漏出現(xiàn)。
[0042]5)將滑塊裝到儀器上。
[0043]6)合成開始前，輸入所需要的序列作為主程序，按開始鍵開始運(yùn)行。
[0044]7)運(yùn)行完后，將滑塊從設(shè)備中卸下來，用戳子的細(xì)頭端將柱子里的材料和濾膜去除掉。操作人員將柱子滑塊附到模型臺(tái)架上，并安裝穩(wěn)固。用小收集管將CPG收集好，進(jìn)行下一步處理。
[0045]8)將寡核苷酸與CPG分離，通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，用PAGE方法純化引物，用水稀釋完后通過微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量。
[0046]NCBI上找到HPV16序列,用primer express軟件根據(jù)序列設(shè)計(jì)出引物和探針,再通過NCBI上BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該引物探針序列是HPV16的特異性序列，因此將其作為檢測(cè)HPV16的引物和探針。
[0047]設(shè)計(jì)合成引物(16F1和16R1)和探針(16P1)序列見下表:
[0048]
名稱序列

T6F1 ~TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA
【權(quán)利要求】
1.一種用于人乳頭瘤病毒16(HPV16)基因檢測(cè)的試劑盒，其包括DNA提取液，HPV16PCR反應(yīng)液，HPV16強(qiáng)陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，其中: 所述HPV16PCR反應(yīng)液包括超純水，緩沖液，dNTP，引物16F1和16R1，以及探針16P1 ； 所述引物16F1的序列為TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA，所述引物16R1的序列為TGTCCAACTGCAAGTAGTCTGGAT,所述探針 16P1 的序列為 FAM-CACGGATGAATATGTTGCAC-MGBNFQ。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括:DNA提取液2管；HPV16PCR反應(yīng)液20管；HPV16強(qiáng)陽性質(zhì)控品I管；陰性質(zhì)控品I管。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括:DNA提取液2管，500μ I/管；HPV16PCR反應(yīng)液20管，19 μ I/管；HPV16強(qiáng)陽性質(zhì)控品I管，200 μ I/管；陰性質(zhì)控品I管，150μ I/管；其中，所述HPV16PCR反應(yīng)液包括超純水14.3 μ 1，IOXbuffer緩沖液2 μ 1，dΝΤΡ0.4 μ 1，引物 16F10.4μ 1,16R10.4μ 1，探針 16Ρ10.4μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成，并且根據(jù)HPV的不同分型而設(shè)計(jì)。
5.用于制備權(quán)利要求1所述的試劑盒的方法，其包括下述步驟: 1)確定待測(cè)基因片段:根據(jù)科技文獻(xiàn)的方向性報(bào)道初步選定候選基因片斷，然后經(jīng)研發(fā)過程中與待檢樣本病理相關(guān)性的比較，最終確認(rèn)與臨床疾病最具相關(guān)性的待測(cè)基因片斷； 2)根據(jù)所述待測(cè)基因片段 設(shè)計(jì)并生產(chǎn)引物和探針，采用多核苷酸合成儀生產(chǎn)所述引物； 3)提取細(xì)胞基因組DNA:用DNA提取液提取病人基因組及對(duì)照組基因組DNA ； 4)確定PCR擴(kuò)增條件，其包括酶、探針、引物、基因組DNA用量及PCR的擴(kuò)增條件:不同組合的引物片斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性，敏感性等技術(shù)特征，反復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行多條所述待測(cè)基因片斷的檢測(cè)反應(yīng)，最終確定包括所述引物、探針最佳濃度及酶的最佳反應(yīng)條件，其中，PCR基因擴(kuò)增的結(jié)果由熒光PCR儀來檢測(cè)； 5)進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)以進(jìn)一步確定反應(yīng)條件:通過大量實(shí)驗(yàn)，反復(fù)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果中包括清晰度和靈敏性的因素，最終確定反應(yīng)條件； 6)根據(jù)最終確定的所述反應(yīng)條件，制備試劑盒，其組分包括:引物、探針、dNTP、IOXbuffer緩沖液、Taq聚合酶、試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品和超純水。
6.采用權(quán)利要求1所述的試劑盒進(jìn)行HPV基因檢測(cè)的方法，其包括: 以用基因組提取試劑盒提取的患者的細(xì)胞基因組DNA為模板，用試劑盒提供的引物、探針、dNTP、酶、試劑標(biāo)準(zhǔn)品等組分，20 μ L反應(yīng)體系，按照特定的比例分別加入； 采用PCR基因擴(kuò)增技術(shù)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV的基因檢測(cè)； PCR結(jié)束后，采用瓊脂糖專用電泳儀進(jìn)行電泳、EB染色、成像并進(jìn)行基因分型，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV的基因檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其中所述PCR反應(yīng)進(jìn)一步包括: 在0.2mL的PCR管里面，加入患者模板(50ng/μ I )，瞬時(shí)離心混勻后放入PCR儀中，在設(shè)定的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序條件下獲得針對(duì)正常對(duì)照組和感染HPV16基因擴(kuò)增的對(duì)照結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其中所述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件包括: PCR反應(yīng)體系(20 μ I )，包括:HPV16PCR反應(yīng)液18μ 1，模板2μ I ;其中PCR反應(yīng)液的配置:超純水 14.3 μ 1,10Xbuffer2y 1，d NTP0.4 μ 1，引物 16F10.4μ 1,16R10.4μ 1，探針16Ρ10.4μ I ； 擴(kuò)增程序，包括:6 0° C30s —95° C2min —95° C15s — 60° Clmin (共 40 個(gè)循環(huán))。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103540682SQ201310294133
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月13日
【發(fā)明者】鐘建, 方平科 申請(qǐng)人:鐘建