專利名稱：糖化胺的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用氧化還原反應(yīng)來測定糖化蛋白質(zhì)等糖化胺的方法。
背景技術(shù)：
血球中的糖化血紅蛋白(特別是“HbAlc”)，由于其濃度反映生物體血糖值的過去狀況，因此被作為糖尿病診斷和治療等中的重要指標(biāo)。該HbAlc的測定通常通過免疫學(xué)方法、HPLC法等進行。
但是，在全血或血球中，除了作為測定對象的糖化血紅蛋白(糖化Hb)以外，還存在作為非測定對象物的糖化胺(例如糖化清蛋白、糖化肽和糖化氨基酸等)等各種糖化物。因此，也測定了這種測定對象物以外的糖化物(非測定對象物)，結(jié)果得到了高于真值的測定值，存在著顯示假陽性的問題。
為了解決這種問題，在上述免疫學(xué)方法中，提出了例如以下的方法。即，在測定對象物與抗測定對象物的抗體的主反應(yīng)之前，形成非測定對象物與抗非測定對象物抗體的復(fù)合物，使非測定對象物的結(jié)構(gòu)變?yōu)椴粚μ腔疕b的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響的結(jié)構(gòu)的方法(例如參照專利文獻1)、通過B/F分離，將非測定對象物從試樣中分離除去的方法等。另外在HPLC法中，提出了例如對于1個試樣準(zhǔn)備2根HPLC柱，用第1根柱將非測定對象物從試樣中除去，用第2根柱進行測定對象物的分離分析的方法。
然而，如果利用上述免疫學(xué)方法，則成本高，而且由于進一步需要與主反應(yīng)不同的抗體抗原反應(yīng)，因此存在反應(yīng)體系的環(huán)境設(shè)定變得復(fù)雜、測定需要很長時間的問題。另外，對于B/F分離，顯然操作變得煩雜。而且，由于抗體僅對具有特異性的物質(zhì)(抗原)起效，因此當(dāng)試樣中所含有的非測定對象物的種類不明確或其種類多樣時等，難以充分地排除非測定對象物的影響。另外，即便在HPLC法中，由于使用2根柱，因此也難以回避高成本，而且由于非測定對象物的分離需要時間，因此為了提高測定精度時，在測定時間的縮短上是有限的。
另一方面，近年來在以糖化Hb為代表的各種糖化蛋白質(zhì)的測定中，利用了氧化還原反應(yīng)的酶法被廣泛使用，可謀求實用化。具體可如下測定。
首先，制備使血球溶血的試樣，在該溶血試樣中添加蛋白酶，生成糖化Hb分解物。進而在該分解物中添加果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為“FAOD”)，使其作用于糖化Hb的糖化部分，通過該氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫。該過氧化氫量與上述糖化蛋白質(zhì)的質(zhì)量相對應(yīng)。然后，在該反應(yīng)液中添加過氧化物酶(以下稱為“POD”)和通過氧化而顯色的基質(zhì)，通過酶反應(yīng)使上述顯色性基質(zhì)顯色。通過測定該顯色可測定上述過氧化氫量，其結(jié)果可決定血球中的糖化Hb。
但是，即便在這種酶法中，與上述相同，可發(fā)現(xiàn)作為試樣中所含有的非測定對象物的糖化物成為起因，從而顯示高于真值的值的問題。因此，為了解決該問題，在酶法中本申請人也提出了下述方法(例如專利文獻2)。
即，作為第1方法，提出了預(yù)先在試樣中添加對測定對象糖化Hb的反應(yīng)性低的FAOD(分解用FAOD)，由此預(yù)先處理非測定對象的糖化物，之后，使用對糖化Hb的反應(yīng)性高的FAOD(測定用FAOD)對糖化Hb的蛋白酶分解物進行處理，由此測定。
另外，作為第2方法，提出了預(yù)先利用對糖化Hb的反應(yīng)性高的少量FAOD(分解用FAOD)對試樣進行前處理后，用蛋白酶對該試樣進行處理，再次添加與上述相同的FAOD(測定用FAOD)的方法。在該第2方法中，使分解用FAOD的添加量為少量、詳細(xì)地說減小前處理用FAOD與測定用FAOD之比，從速度論的觀點出發(fā)，是為了防止前處理階段糖化Hb與FAOD的反應(yīng)。并且，上述第2方法中的蛋白酶的添加不僅為了上述糖化Hb的分解，而且也為了使最初添加的分解用FAOD失活。這是因為，如果最初添加的分解用FAOD殘存的話，則通過蛋白酶的添加所生成的糖化Hb分解物會與殘存FAOD反應(yīng)。
但是，如果利用以往的第1酶法，即便預(yù)先利用前處理用FAOD對非測定對象物進行前處理，由于用于主反應(yīng)的測定用FAOD為不同的催化功能，因此該測定用FAOD所作用的非測定對象物成為未被完全處理的狀態(tài)。因此，雖然可見測定精度的提高，但需要精度的進一步提高。并且，在第1酶法中，由于需要分別使用(1)前處理用FAOD、(2)蛋白酶、(3)測定用FAOD(+POD)的至少3種試劑的3階段反應(yīng)，因此測定上耗費時間，試劑的制備也很麻煩。
另一方面，在以往的第2酶法中，如上所述，必須使前處理FAOD的添加量為少量，并且在添加測定用FAOD之前，使前處理用FAOD幾乎完全失活是重要的。但是，如果使前處理FAOD的添加量為少量，則為了消化非測定對象物必須確保充分的處理時間，當(dāng)嘗試完全消化時則存在處理時間延長、進而整個測定時間變長的問題。而且，利用前處理FAOD、蛋白酶、測定用FAOD的各處理都不能同時進行，也對測定時間有影響。
專利文獻1日本特開2000-180439號公報專利文獻2國際公開第03-033729號公開文本發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供一種糖化胺的測定方法，由此可容易且簡單地進行可靠性優(yōu)異的糖化胺的測定。
為了達成上述目的，本發(fā)明的糖化胺測定方法包含將蛋白酶添加在試樣中，通過上述蛋白酶分解上述試樣中作為測定對象的糖化胺的工序；在上述試樣中添加FAOD，使上述FAOD作用于糖化胺的分解物并進行氧化還原反應(yīng)的工序；測定上述氧化還原反應(yīng)的工序；通過上述氧化還原反應(yīng)的測定結(jié)果來決定上述糖化胺的量的工序，該測定方法的特征在于，其還進一步包含在添加上述蛋白酶的分解工序之前，在上述試樣中添加上述FAOD，使上述FAOD作用于與上述測定對象糖化胺不同且存在于上述試樣中作為非測定對象的糖化胺的工序，以除去上述非測定對象糖化胺的影響，而且，通過在上述分解工序之前添加的FAOD來進行上述分解工序后的上述氧化還原反應(yīng)。本發(fā)明中作為測定對象物的糖化胺也稱作“測定對象糖化胺”、作為非測定對象物的糖化胺也稱作“非測定對象糖化胺”、對非測定對象糖化胺的FAOD反應(yīng)也稱作“前處理反應(yīng)”、對測定對象糖化胺的FAOD反應(yīng)也稱作“主反應(yīng)”。
上述FAOD為一般名稱，其基質(zhì)特異性隨FAOD種類的不同而不同，其為不僅可作用于糖化氨基酸、也可作用于糖化肽和糖化蛋白質(zhì)的酶。并且，作為上述糖化胺，包括例如糖化蛋白質(zhì)、糖化肽、糖化氨基酸等，但本發(fā)明中所述的“測定對象糖化胺”表示糖化蛋白質(zhì)或糖化肽。
本發(fā)明人等對以糖化Hb為代表的糖化胺的測定方法進行了銳意研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過預(yù)先在試樣中添加FAOD來處理非測定對象糖化胺后，添加蛋白酶，使已添加的FAOD作用于利用該蛋白酶生成的測定對象糖化胺的分解物，進而完成本發(fā)明。根據(jù)該方法，為了預(yù)先在試樣中添加FAOD來處理非測定對象物，在進行利用蛋白酶的分解反應(yīng)和主反應(yīng)時，與FAOD作用的非測定對象物已經(jīng)被消化。因此，能夠防止非測定對象物為起因的假陽性和測定值的上升(高值化)，并能夠確保顯著優(yōu)異的測定精度。另外，根據(jù)本發(fā)明，如果預(yù)先通過FAOD處理非測定對象糖化胺，則之后如后所述，利用蛋白酶的測定對象物的分解、氧化還原反應(yīng)等可隨時間進行、也可同時進行。因此，測定中的反應(yīng)工序數(shù)可減少至極少的2個工序，能夠進行簡單的操作。并且，不僅是臨床檢查、而且在食品分析等中也廣泛適用的以往的酶法中，利用蛋白酶處理樣品后，添加主反應(yīng)的酶是基本形態(tài)，例如本發(fā)明那樣，可在添加蛋白酶之前添加主反應(yīng)的酶FAOD也是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)的。因此，如果將這種本發(fā)明測定方法適用于例如上述糖化Hb的測定中，則成為糖化Hb的作為糖尿病診斷指標(biāo)的可靠性也提高、且在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中有用的方法。
具體實施例方式
如上所述，本發(fā)明的測定方法包含在試樣中添加蛋白酶，通過上述蛋白酶分解上述試樣中作為測定對象的糖化胺的工序；在上述試樣中添加FAOD，使上述FAOD作用于糖化胺分解物并進行氧化還原反應(yīng)的工序；測定上述氧化還原反應(yīng)的工序；通過上述氧化還原反應(yīng)的測定結(jié)果來決定上述糖化胺的量的工序，該測定方法的特征在于，其還進一步包含在添加上述蛋白酶的分解工序之前，在上述試樣中添加上述FAOD，使上述FAOD作用于與上述測定對象糖化胺不同且存在于上述試樣中作為非測定對象的糖化胺的工序(前處理工序)，以除去上述非測定對象糖化胺的影響，而且，通過在上述分解工序之前添加的FAOD來進行上述分解工序后的上述氧化還原反應(yīng)。即，通過在上述分解工序之前、為了作用于上述非測定對象糖化胺而添加的FAOD，進一步可進行上述分解工序后的氧化還原反應(yīng)。
作為上述測定對象物，只要是可利用上述氧化還原反應(yīng)的糖化胺則沒有特別限制，利用本發(fā)明能夠進行測定。作為具體的測定對象糖化胺，可列舉出糖化Hb、糖化白蛋白等糖化蛋白質(zhì)、糖化肽，本發(fā)明的測定方法尤其對血球內(nèi)糖化胺、特別是糖化Hb的測定是有用的。
本發(fā)明中，上述氧化還原反應(yīng)工序為例如使FAOD作用于糖化胺分解物而產(chǎn)生過氧化氫的工序，優(yōu)選測定上述氧化還原反應(yīng)的工序包含在上述試樣中添加氧化酶(例如POD)和通過氧化而顯色的基質(zhì)，并通過上述氧化酶使上述產(chǎn)生的過氧化氫和上述基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的工序。由于通過該反應(yīng)而上述基質(zhì)顯色，因此通過該顯色量的測定，能夠測定上述氧化還原反應(yīng)。
本發(fā)明中，優(yōu)選上述分解工序、上述氧化還原反應(yīng)工序、測定上述氧化還原反應(yīng)的工序同時進行。由此，能夠減少測定工序、且可迅速且簡單地進行操作。具體地說，例如(1)在上述前處理工序后，在上述試樣中同時添加蛋白酶、氧化酶和通過氧化而顯色的基質(zhì)，(2)在上述分解工序之前，將上述氧化酶與上述FAOD同時添加于上述試樣中，進而同時將蛋白酶和通過氧化而顯色的基質(zhì)添加于上述試樣中，或者(3)在上述分解工序之前，將上述通過氧化而顯色的基質(zhì)與上述FAOD一起添加在上述試樣中，進而同時將蛋白酶和氧化酶添加在上述試樣中，由此可同時進行上述3個工序。
本發(fā)明的測定方法中使用的FAOD優(yōu)選為催化下述式(1)所示的反應(yīng)的FAOD，例如可列舉出特異性地作用于α-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下稱為“FAOD-α”)、特異性地作用于氨基酸側(cè)鏈的氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下稱為“FAOD-S”)、特異性地作用于α-氨基被糖化的糖化胺和氨基酸側(cè)鏈的氨基被糖化的糖化胺的任一個的FAOD(以下稱為“FAOD-αS”)等。
(1)上述式(1)中，R1為羥基或來源于糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。上述糖殘基(R1)在反應(yīng)前的糖為醛糖時為醛糖殘基、在反應(yīng)前的糖為酮糖時為酮糖殘基。例如，反應(yīng)前的糖為葡萄糖時，由于阿馬多爾重排，反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)成為果糖結(jié)構(gòu)，此時，糖殘基(R1)成為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)例如可表示為-[CH(OH)]n-CH2OH，n為0～6的整數(shù)。
上述式(1)中，R2沒有特別限制，但糖化胺在為糖化氨基酸或糖化肽(含糖化蛋白質(zhì))的情況下、α-氨基被糖化的情況下、除α-氨基以外的氨基(氨基酸側(cè)鏈的氨基)被糖化的情況下有所不同。
上述式(1)中，α-氨基被糖化時，R2為以下述式(2)所示的氨基酸殘基或肽殘基。此時，特異性地催化上述式(1)反應(yīng)的為上述FAOD-α和FAOD-αS。
-CHR3-CO-R4(2)上述式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基，R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以下述式(3)表示。在下述式(3)中，n為大于等于O的整數(shù)、R3與上述同樣，表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可全部相同、也可不同。
-(NH-CR3H-CO)n-OH (3)另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸側(cè)鏈基被糖化)時，R2可以下述式(4)表示。此時，特異性地催化上述式(1)反應(yīng)的為上述FAOD-S和FAOD-αS。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)上述式(4)中，R5表示氨基酸側(cè)鏈基中被糖化的氨基以外的部分。例如被糖化的氨基酸為賴氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-CH2-；例如被糖化的氨基酸為精氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
上述式(4)中，R6為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以下述式(5)表示。在下述式(5)中，n為大于等于0的整數(shù)、R3與上述同樣，表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可全部相同、也可不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H (5)在上述式(4)中，R7為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以下述式(6)表示。下述式(6)中，n為大于等于0的整數(shù)，R3與上述同樣，表示氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可全部相同，也可不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(6)作為特異性地作用于上述糖化α-氨基的FAOD-α，例如可列舉出市售的商品名為果糖基-氨基酸氧化酶(FAOX-TE)(Kikkoman公司生產(chǎn))、青霉菌(Penicillium)屬來源的FAOD(日本特開平8-336386公報)等。作為特異性地作用于上述氨基酸殘基的被糖化的側(cè)鏈的FAOD-S，例如可列舉出鐮刀菌(Fusarium)屬來源的FAOD(日本生物工學(xué)會大會，平成12年度“尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)來源的氨基酸氧化酶的基質(zhì)特異性的轉(zhuǎn)變；藤原真紀(jì)等”)等。作為作用于上述糖化α-氨基和糖化側(cè)鏈基兩者的FAOD-αS，例如可列舉出市售的商品名FOD(旭化成公司生產(chǎn))、赤霉菌(Gibberella)屬來源的FAOD(日本特開平8-154672號公報)、鐮刀菌屬來源的FAOD(日本特開平7-289253號公報)、曲霉菌(Aspergillus)屬來源的FAOD(WO99/20039號)等。
這些FAOD可根據(jù)測定對象糖化胺的種類進行適當(dāng)決定。測定對象物如上所述為糖化Hb時，由于可通過測定其β鏈N末端纈氨酸中α-氨基的糖化程度來計算HbAlc(％)，因此優(yōu)選使用特異性地作用于糖化α-氨基的FAOD-α。特別是，由于作為FAOD-α的商品名FAOX-TE特異性地作用于α-氨基被糖化的游離“纈氨酸”，因此使得Val從N末端序列變?yōu)椤癡al-His-Leu…”的β鏈N末端纈氨酸、或N末端序列變?yōu)椤癡al-Leu-Ser-Pro-Ala-Asp…”的α鏈N末端纈氨酸中游離出來，從而適于測定糖化程度。并且還可使用上述FAOD-α、特別是利用通常手段從鐮刀菌sp.GL2-1(FERM BP-8451)中得到的FAOD。由于該FAOD-α特異性地作用于α-氨基被糖化的游離Val、Val-Leu、Val-Leu-Ser、Val-His、Val-His-Leu等，因此使得這些序列從α鏈、β鏈的N末端游離，從而適于測定糖化量。并且，測定對象物為α-氨基被糖化的氨基酸(糖化Val)和肽(糖化Val-His)，ε-氨基被糖化的氨基酸(糖化Lys)和肽(糖化Lys-Thr、糖化Lys-Ser)等時，優(yōu)選使用特異性地作用于糖化Lys和糖化Val兩者的FAOD-αS。
作為上述蛋白酶，沒有特別限制，可使用選自金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶、氨基肽酶中的至少一種蛋白酶，但優(yōu)選根據(jù)測定對象糖化胺的種類進行選擇。特別優(yōu)選可選擇性地分解測定對象糖化胺的蛋白酶、可特異性地游離FAOD易作用的分解物的蛋白酶。如果是可選擇性地分解測定對象糖化胺的蛋白酶，即便例如在試樣中存在其它糖化胺(特別是糖化蛋白質(zhì)、糖化肽)時，由于這些糖化胺難以被分解、也不產(chǎn)生FAOD易作用的分解物，因此測定精度也可進一步提高。具體地說，測定對象物為上述糖化Hb時，優(yōu)選選擇性地分解糖化Hb的蛋白酶，例如可列舉出金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬胰臟來源的胰蛋白酶、枯草桿菌(Bacillus subtilis)來源的蛋白酶等，更優(yōu)選為金屬蛋白酶、枯草桿菌來源的蛋白酶，特別優(yōu)選為金屬蛋白酶。
并且，使用上述FAOD-α?xí)r，優(yōu)選可特異性地游離FAOD-α易作用的分解物、例如β鏈N末端纈氨酸或含有其的肽(例如二肽、三肽等)的蛋白酶，可使用枯草桿菌蛋白酶、鏈霉蛋白酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等。具體地說，例如通過利用枯草桿菌蛋白酶、鏈霉蛋白酶等處理糖化Hb，能夠游離Val-His-Leu的三肽，進而如果利用特異的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶處理His-Leu，則可游離糖化纈氨酸(果糖基纈氨酸)。
另外，使用鐮刀菌屬(例如Fusarium sp.GL2-1(FERM BP-8451))來源的FAOD-α?xí)r，優(yōu)選例如可特異性地游離α鏈N末端纈氨酸或者含有其的肽(例如二肽、三肽等)的蛋白酶，例如可使用內(nèi)切蛋白酶ASP-N等。具體地說，例如通過利用上述內(nèi)切蛋白酶ASP-N處理糖化Hb，則可游離Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Asp肽，進而通過利用羧基肽酶Y進行處理，可游離糖化Val-Leu。另外，為糖化白蛋白時，可使用例如蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶、無花果蛋白酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等，白蛋白的種類(例如HSA、BSA等)不受其來源的任何限制，可進行測定。
本發(fā)明中的測定試樣沒有特別限制，也可將本發(fā)明的測定方法適用于例如全血、血漿、血清、血球、尿、脊髓液等生物體試樣，果汁等飲料水、醬油、調(diào)味汁等食品類等試樣。其中，本發(fā)明的測定方法對例如上述全血、血漿、血清、血球等血液試樣及其它生物體試樣有用。例如，測定作為上述血球成分的糖化胺時，可使全血直接溶血后作為試樣使用，也可將紅血球從全血中分離出來后使上述紅血球溶血作為試樣使用。另外，由于在點滴等成分中多含有例如葡萄糖等糖類、各種氨基酸，因此由于從這些成分產(chǎn)生糖化胺，有時患者的血液等中糖化氨基酸一過性地增加。所以，本發(fā)明的測定方法對這種點滴后的患者的血液試樣等也極為有用。
本發(fā)明中，上述氧化還原反應(yīng)的測定優(yōu)選為通過上述FAOD的氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生的、且來源于測定對象糖化胺的過氧化氫量的測定。過氧化氫的量可如下決定例如通過POD還原來源于測定對象糖化胺的過氧化氫，同時氧化通過氧化而顯色的基質(zhì)(顯色性基質(zhì))，通過測定顯色了的上述基質(zhì)的顯色程度來決定。
此外，POD的添加順序沒有特別限制，例如可在上述蛋白酶的添加前或添加后添加，也可與上述蛋白酶同時添加。顯色性基質(zhì)的添加也同樣沒有限制。具體例在后敘述。
接著，列舉出測定在含有非測定對象物的全血試樣中血球中糖化Hb的一例，對本發(fā)明測定方法進行說明。另外，在該實施方式中所謂的“糖化氨基酸”，只要沒有特別表示，則指在試樣中所含有的非測定對象糖化氨基酸，不含作為測定對象物的糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的糖化氨基酸。
首先，將全血溶血，制備溶血試樣。該溶血方法沒有特別限定，例如可使用利用表面活性劑的方法、利用超聲波的方法、利用滲透壓之差的方法、利用冷凍溶解的方法等。其中從操作的簡單性等理由出發(fā)，優(yōu)選使用表面活性劑的方法。
作為上述表面活性劑，例如可使用聚氧乙烯-對叔辛基苯基醚(Triton系表面活性劑等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯(Tween系表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij系表面活性劑等)等非離子性表面活性劑，具體地說，例如可列舉出商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等。利用上述表面活性劑的處理條件可為通常處理溶液中的血球濃度為1～10體積％時，添加上述表面活性劑以使得上述處理溶液中的濃度變?yōu)?.1～1重量％，并在室溫下攪拌5秒～1分鐘左右。
另外，利用上述滲透壓之差時，例如相對于全血的體積添加2～100倍體積量的精制水，使其溶血。
接著，在上述溶血試樣中添加FAOD。通過該FAOD的添加，作為上述溶血試樣中的非測定對象糖化胺且可成為上述FAOD的基質(zhì)的物質(zhì)被分解(前處理工序)。具體地說，通過FAOD所催化的上述式(1)的反應(yīng)，非測定對象糖化胺的糖化部分伴隨著過氧化氫的產(chǎn)生而被分解。這樣，由于可與FAOD反應(yīng)的非測定對象糖化胺在該階段已經(jīng)被分解，因此在下個工序中，即便用蛋白酶將糖化Hb分解，在本工序中添加的FAOD與非測定對象物也不會發(fā)生反應(yīng)，而僅使糖化Hb分解物與FAOD反應(yīng)。另外，也可同時進行該工序和上述溶血處理。
由于該工序中產(chǎn)生的非測定對象來源的過氧化氫因血球中含有的谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶，在產(chǎn)生的同時迅速地消失，因此在現(xiàn)階段產(chǎn)生的過氧化氫不會對后述糖化Hb來源的過氧化氫的測定(POD反應(yīng))產(chǎn)生影響。這樣，過氧化氫在產(chǎn)生的同時瞬間被消化，在從例如反應(yīng)液中含有的Hb與非測定對象物的含有比例、反應(yīng)速度論的方面出發(fā)考慮也是明確的，另外，不對POD反應(yīng)產(chǎn)生影響，由后述實施例的結(jié)果也可明白。
這樣，當(dāng)測定對象糖化胺為以糖化Hb為代表的血球內(nèi)成分時，由于通過血球中本來就存在的過氧化氫酶等，在非測定對象糖化胺的分解中產(chǎn)生的過氧化氫迅速被分解，因此不用另外添加過氧化氫酶等，操作變得更加簡單。當(dāng)試樣中不含血球時(例如血清試樣、尿等)，即不含血球中的過氧化氫酶時，也可另外添加過氧化氫酶來除去非測定對象糖化胺來源的過氧化氫。這樣，通過上述過氧化氫酶除去過氧化氫時，為了防止在之后進行的FAOD處理中產(chǎn)生的過氧化氫也被除去，優(yōu)選在測定上述氧化還原反應(yīng)時添加過剩量的POD和顯色性基質(zhì)，并且，上述POD和顯色性基質(zhì)的添加優(yōu)選例如在FAOD的添加前進行或與FAOD的添加同時進行。此時，優(yōu)選相對于上述過氧化氫酶的添加量(U)，添加例如5～100倍活性(U)量的POD。
另外，作為處理由非測定對象糖化胺產(chǎn)生的過氧化氫的方法，還可采用以下的其它方法。例如有在添加蛋白酶之前，使FAOD和POD以及電子供給體共存的方法。由此，在添加蛋白酶之前，由非對象糖化胺產(chǎn)生的過氧化氫通過POD反應(yīng)發(fā)生脫氫，電子被供給給電子供給體。因此，即便之后添加蛋白酶，過氧化氫也已被除去，對測定對象糖化胺的測定沒有影響。另外，也可在添加蛋白酶之前添加FAOD、POD及通過氧化而顯色的顯色劑，預(yù)先測定該顯色量，利用該顯色量進行校正。
FAOD對上述溶血試樣的添加量，只要是能夠充分進行非測定對象物的處理和后述的糖化Hb分解物的處理的量即可。例如，可由溶血試樣中的Hb濃度等適宜決定，但為了迅速除去非測定對象物，優(yōu)選添加過剩量。具體地說，在反應(yīng)液中血球濃度為0.3體積％時，例如FAOD為0.1～30U/L的范圍、優(yōu)選為2～10U/L、更優(yōu)選為3～6U/L。在反應(yīng)液中全血濃度為0.3體積％時，F(xiàn)AOD為0.1～45U/L的范圍、優(yōu)選為2～15U/L、更優(yōu)選為3～9U/L。
該FAOD處理的條件沒有特別限定，反應(yīng)溫度例如為2～60℃、優(yōu)選為4～40℃，反應(yīng)時間例如為1～30分鐘、優(yōu)選為3～5分鐘，pH例如為6～9的范圍。另外，該處理通常在緩沖液中進行，作為上述緩沖液，沒有特別限定，例如可列舉出Tris鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液等。
上述溶血工序和FAOD添加工序可分別進行，但從時間的短縮、工序的簡單化方面出發(fā)，優(yōu)選同時進行。特別是，考慮到使用了試劑盒的本發(fā)明的測定方法的實施，優(yōu)選同時進行溶血和非測定對象糖化胺的FAOD處理，原因在于由此可減少試劑數(shù)。
接著，在添加了上述FAOD的反應(yīng)液中進一步添加蛋白酶、POD以及通過氧化而顯色的基質(zhì)(顯色性基質(zhì))。這樣，通過上述蛋白酶的添加，糖化Hb被分解以使得之前添加的FAOD容易作用，在該分解物和FAOD之間發(fā)生上述式(1)所示的反應(yīng)，產(chǎn)生糖化Hb來源的過氧化氫。即，通過蛋白酶的添加，利用已經(jīng)添加的FAOD進行的氧化還原反應(yīng)自動開始。而且，在產(chǎn)生的同時，上述過氧化氫被POD還原，另一方面，共存的上述顯色性基質(zhì)被氧化，呈現(xiàn)顯色。該顯色可利用例如分光光度計等作為吸光度進行測定，由此結(jié)果可決定過氧化氫量。而且，例如使用該過氧化氫濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線等能夠求出試樣中的糖化Hb的量(糖化量)。
該處理通常在上述緩沖液中進行，條件可根據(jù)所用蛋白酶的種類、測定對象的糖化蛋白質(zhì)的種類及其濃度等進行適宜決定。
上述反應(yīng)液中的蛋白酶濃度，在血球濃度為0.3體積％時，例如為10KU/L～300MU/L的范圍、優(yōu)選為1MU/L～60MU/L、更優(yōu)選為5MU/L～30MU/L，上述反應(yīng)液中的全血濃度為0.3體積％時，為10KU/L～150MU/L的范圍、優(yōu)選為1MU/L～30MU/L、更優(yōu)選為5MU/L～15MU/L。
上述反應(yīng)液中的POD濃度優(yōu)選例如為過剩量。如果POD為過剩量，則能夠在產(chǎn)生的同時與過氧化氫迅速地反應(yīng)，這是因為例如能夠充分抑制由試樣中的過氧化氫酶產(chǎn)生的影響。作為具體例，反應(yīng)液中的血球濃度為0.3體積％時，例如為0.01KU/L～4MU/L的范圍、優(yōu)選為0.1KU/L～200KU/L、更優(yōu)選為5KU/L～100KU/L，當(dāng)上述反應(yīng)液中的全血濃度為0.3體積％時，為0.01KU/L～2MU/L的范圍、優(yōu)選為0.1KU/L～100KU/L、更優(yōu)選為5KU/L～50KU/L。上述反應(yīng)液中的顯色性基質(zhì)的濃度，在血球濃度為0.3體積％時，例如為0.01～300μmol/L的范圍、優(yōu)選為1～100μmol/L、更優(yōu)選為5～30μmol/L。
該處理條件沒有特別限制，反應(yīng)溫度例如為2～60℃、優(yōu)選為4～40℃，反應(yīng)時間例如為1～30分鐘、優(yōu)選為3～10分鐘，pH例如為6～9的范圍。
作為上述顯色性基質(zhì)，例如可列舉出N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)二苯胺鈉、對苯二胺(OPD)、組合Trinder’s試劑和4-氨基安替比林的基質(zhì)等。作為上述Trinder’s試劑，可以列舉出例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。除了上述氨基安替比林之外，還可使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在這種顯色性基質(zhì)中，如上所述，特別優(yōu)選為N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)二苯胺鈉。
在本發(fā)明中，在上述蛋白酶的添加后，也可在上述試樣中添加POD和顯色性基質(zhì)，分別進行蛋白酶處理和POD處理，但由于下述理由，優(yōu)選同時進行上述兩處理。即，第1原因為，如果與蛋白酶一起添加POD和顯色性基質(zhì)，則產(chǎn)生的過氧化氫瞬間與POD反應(yīng)、不必?fù)?dān)心如上所述被過氧化氫酶除去；第2原因為，如果將上述兩處理作為1個工序，則能夠更簡單且迅速地進行測定。第3原因為，如果考慮使用了試劑盒的測定，則可根據(jù)工序數(shù)來減少試劑數(shù)，因此可降低成本。特別是，在以往的第2酶法中，一般至少需要分解用FAOD處理、蛋白酶處理和測定用FAOD處理這樣3個工序或更多個工序的處理，而從以往的第1酶法中測定用FAOD的穩(wěn)定性方面看，由于必須將蛋白酶和測定用FAOD作為分別的試劑進行制備，因此所用試劑必須至少為3試劑系統(tǒng)。但是，根據(jù)本發(fā)明，能夠以極少的工序數(shù)進行反應(yīng)，即將非測定對象物的除去作為1個工序(也可含有溶血處理)、將蛋白酶處理和POD處理作為1個工序的2個工序。因此，能夠利用含有FAOD的試劑(也可含有溶血試劑)、含有蛋白酶和POD及顯色性基質(zhì)的試劑的2個試劑系統(tǒng)實現(xiàn)測定。這樣，利用2個試劑系統(tǒng)的測定成為可能，從成本方面、簡單性方面出發(fā)也極為有用。
此外，為了同時進行蛋白酶處理和POD處理，如上所述，例如可使上述FAOD作用于上述非測定對象糖化胺后，在上述試樣中同時添加蛋白酶、POD和顯色性基質(zhì)。另外，除此之外，還可以在上述分解工序之前，與FAOD一起將POD添加在試樣中，進而在試樣中同時添加蛋白酶和顯色性基質(zhì)。另外，也可在上述分解工序之前，與FAOD一起將顯色性基質(zhì)添加在上述試樣中，進而同時在試樣中添加蛋白酶和POD，由此進行。在這種情況下，在進行溶血處理時，可與上述FAOD一起進一步添加溶血試劑。
上述過氧化氫量除了利用使用了上述POD等的酶的方法進行測定之外，還可使用例如電的方法進行測定。
另外，在本發(fā)明中，為了進一步提高測定精度，在利用蛋白酶進行的分解工序之前，還可進一步添加各種添加劑。作為上述添加劑，可列舉出例如四唑鎓化合物。通過添加上述四唑鎓化合物，如可得到下述各種效果。通常，由于血液試樣等中存在抗壞血酸等還原物質(zhì)，因此會引起通過氧化而顯色的基質(zhì)被還原從而顯色消失的問題，但通過四唑鎓化合物的添加，可回避這種問題，能夠進一步提高測定精度。另外，通過四唑鎓化合物的添加，還具有促進測定對象糖化胺的分解，從而FAOD有效作用于分解物的效果。
作為上述四唑鎓化合物，其種類沒有特別限制，例如可列舉出2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓及其鹽(例如單鈉鹽)等。
另外，也可與上述四唑鎓化合物同樣地使用WO03/107011所公開的磺酸化合物、硝基化合物等。作為具體例，可列舉出月桂硫酸鈉(SLS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、月桂硫酸鋰(LiLS)、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸鈉(ABSA)、4-氨基-4’-硝基均二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉(ANDS)、4，4’-二偶氮均二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉(DADS)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸、N-環(huán)己烷-3-氨基丙磺酸、N-環(huán)己基-2-羥基-3-氨基丙磺酸、哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸)、紅菲繞啉等，2，4-二硝基苯酚(2，4-DNP)、2，5-二硝基苯、2，6-二硝基苯、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、對硝基苯酚(p-NP)、2，4-二硝基苯胺(2，4-DNA)、對硝基苯胺(p-NA)、亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、4-氨基-4’-硝基均二苯乙烯-2，2’-二磺酸二鈉(ANPS)、硝基苯等。
此外，為了進一步提高上述四唑鎓化合物的效果，優(yōu)選例如與表面活性劑一起添加到上述試樣中。作為上述表面活性劑，沒有特別限制，可列舉出TritonX-100、TWEEN20等所代表的非離子性表面活性劑；十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、CHAPS等所代表的陰離子表面活性劑；苯扎氯銨等所代表的陽離子表面活性劑等。除此之外，還可將尿素等用作添加物。
通常在求糖化胺(特別是糖化蛋白質(zhì))的糖化率時，分別測定蛋白質(zhì)的量和蛋白質(zhì)的糖化量，由兩者計算糖化率。本發(fā)明的測定方法中，測定對象糖化胺為糖化Hb時，Hb的測定也可用以往公知的方法進行，例如，也可以在上述試樣中添加四唑鎓化合物、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、疊氮化鈉等，通過將上述Hb變性使其穩(wěn)定，測定其吸光度，由此求得(例如參照WO 02/27330)。另外，當(dāng)測定對象糖化胺為糖化白蛋白時，可使用對甲酚、溴甲酚綠等公知的物質(zhì)來測定白蛋白的量。
本發(fā)明的測定試劑盒為用于上述本發(fā)明測定方法中的、由第1試劑和第2試劑構(gòu)成的2試劑系統(tǒng)試劑盒，其特征在于，上述第1試劑至少包含F(xiàn)AOD、第2試劑至少包含蛋白酶，而且POD和通過氧化而顯色的基質(zhì)的任一個包含在上述第1試劑中、另一個包含在上述第2試劑中，或者上述POD和上述基質(zhì)兩個都包含在上述第2試劑中。
本發(fā)明的測定試劑盒中的第1試劑和第2試劑的組合(A～C)的具體例如下所示。
(A)第1試劑FAOD第2試劑蛋白酶+POD+顯色性基質(zhì)(B)第1試劑FAOD+POD第2試劑蛋白酶+顯色性基質(zhì)(C)第1試劑FAOD+顯色性基質(zhì)第2試劑蛋白酶+POD為了進一步提高測定精度，本發(fā)明的試劑盒中，例如上述第1試劑還進一步包含上述在分解工序前可添加于試樣中的四唑鎓化合物、磺酸化合物、硝基化合物、表面活性劑等添加物。在將血球溶血時，在上述第1試劑中還可進一步含有溶血試劑。各試劑中各成分的含量沒有特別限制，可在將這些成分添加在反應(yīng)體系時，反應(yīng)液中的濃度變?yōu)樯鲜鰸舛鹊姆秶鷥?nèi)適當(dāng)設(shè)定。
這種本發(fā)明的試劑盒例如可通過首先在試樣中添加上述第1試劑，之后添加上述第2試劑來實施本發(fā)明的測定方法。添加上述第1試劑后的處理條件(例如溫度和處理時間等)、以及添加第2試劑后的處理條件如前所述。
實施例1(I)在血球試樣中添加作為非測定對象糖化胺的各種糖化氨基酸，測定血球中的HbAlc。
血球試樣離心分離健康人的血液(3000G、10分鐘)，在回收的血球中添加下述糖化氨基酸水溶液和水，制備血細(xì)胞比容值為60％的全血試樣。全血試樣中的上述糖化氨基酸水溶液的添加比例為0體積％、1體積％、3體積％。上述糖化氨基酸水溶液為含有16種糖化氨基酸(果糖基異亮氨酸、果糖基亮氨酸、果糖基賴氨酸、果糖基蛋氨酸、果糖基苯基丙氨酸、果糖基蘇氨酸、果糖基色氨酸、果糖基纈氨酸、果糖基酪氨酸、果糖基精氨酸、果糖基組氨酸、果糖基丙氨酸、果糖基天冬氨酸、果糖基脯氨酸、果糖基絲氨酸、果糖基甘氨酸)的溶液，各糖化氨基酸的濃度分別約為0.02～0.4w/v％。
(實施例1)以下所示的操作使用自動分析器(商品名JCA-BM8、日本電子公司生產(chǎn))進行。首先，在0.58μL上述血球試樣中添加15μL精制水。添加精制水是為了對在后述比較例中添加的試劑a(15μL)進行容量校正。接著，在上述血球試樣中添加74μL下述第1試劑，在37℃下培育約4分鐘，之后測定混合溶液的吸光度(第一測定)。接著，約1分鐘后在上述混合溶液中添加18.5μL下述第2試劑，在37℃下培育3分鐘，之后測定該反應(yīng)液的吸光度(第二測定)。吸光度測定都在主波長為700nm、副波長為570nm處進行。第1測定的吸光度乘以89.58/108.08，進行用量校正，求出第二測定的吸光度和上述第1測定的校正吸光度之差(ΔAbs.)。將血球試樣中糖化氨基酸溶液的添加量為0體積％時的ΔAbs.作為100％，求出各血球試樣的ΔAbs.相對值(％)。將該結(jié)果作為實施例1，示于下述表1。將該ΔAbs.作為血液試樣的HbAlc濃度，在后進行考察。
第1試劑硼酸(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))1mmol/L赤霉菌屬來源的FAOD(ARKRAY公司生產(chǎn)) 5KU/L四唑鎓化合物(商品名WST-3、同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 1.7mmol/LNaN3(Nacalai Tesque公司生產(chǎn)) 0.66mmol/L聚氧乙烯月桂醚(日光化學(xué)公司生產(chǎn) 1g/L第2試劑Tris-HCl緩沖液300mmol/LPOD(東洋紡公司生產(chǎn)) 67KU/L顯色性基質(zhì)(商品名DA-64、和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn)) 71.3μmol/LCaCl2(Nacalai Tesque公司生產(chǎn)) 12.5mmol/LNaCl(Nacalai Tesque公司生產(chǎn)) 200mmol/L金屬蛋白酶 10MU/L(比較例1)該例為利用第1FAOD將非測定對象糖化胺分解后，使用不同的第2FAOD與測定對象HbAlc發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進行上述HbAlc測定的現(xiàn)有方法。
除了添加試劑a-1(15μL)代替上述精制水、添加下述試劑b(74μL)代替上述第1試劑、添加下述試劑c代替上述第2試劑之外，與上述實施例1同樣操作，進行吸光度的測定，求出ΔAbs.，并計算相對值(％)。將這些結(jié)果示于下述表1。作為下述試劑a-1中的第1FAOD，使用商品名FAOX-TE(Kikkoman公司生產(chǎn))，作為下述試劑c中的第2FAOD，使用赤霉菌屬來源的FAOD(ARKRAY公司生產(chǎn))。比較例1中的上述試劑a-1為在血球的溶血和非測定對象糖化胺的分解中使用的試劑，試劑b為在HbAlc的分解中使用的試劑，試劑c為在與HbAlc分解物的氧化還原反應(yīng)和顯色反應(yīng)中使用的試劑。
試劑a-1聚氧乙烯月桂醚(日光化學(xué)公司生產(chǎn)) 12g/LCHES(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 80mmol/LMOPS(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 30mmol/L第1FAOD0.3KU/L試劑bMES(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 1mmol/L四唑鎓化合物(商品名WST-3、同仁化學(xué)公司生產(chǎn))1.7mmol/LNaN3(Nacalai Tesque公司生產(chǎn)) 0.66mmol/LCaCl2(Nacalai Tesque公司生產(chǎn)) 2.5mmol/LNaCl(Nacalai Tesque公司生產(chǎn)) 50mmol/L金屬蛋白酶 10MU/L試劑cTris-HCl緩沖液 300mmol/L第2FAOD17.4KU/LPOD(東洋紡公司生產(chǎn))67KU/L顯色性基質(zhì)(商品名DA-64、和光純藥公司生產(chǎn)) 71.3μmol/L(比較例2)該例為在用FAOD將非測定對象糖化胺分解后，利用蛋白酶使上述FAOD失活，進而添加相同的FAOD，與測定對象HbAlc的分解物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進行上述HbAlc測定的現(xiàn)有方法。
除了使用將上述比較例1中的上述試劑a-1的第1FAOD替換為赤霉菌屬FAOD(ARKRAY公司生產(chǎn))的試劑a-2之外，與上述比較例1同樣操作，進行吸光度的測定，求出ΔAbs.，并計算相對值(％)。將這些結(jié)果示于下述表1。在比較例2中，試劑a-2和試劑c使用相同的FAOD，試劑b為在HbAlc的分解和試劑a-2的FAOD失活中使用的試劑。
(比較例3)作為比較例3，不在上述比較例1的試劑a-1中添加FAOD、而是使用用精制水進行了用量校正的試劑a-3，除此之外，與上述比較例1同樣操作，進行吸光度的測定，求出ΔAbs.，并計算相對值(％)。
表1

X血球試樣中上述糖化氨基酸水溶液的添加比例(體積％)如上述表1所示，使用了FAOD無添加的試劑a-3的比較例3，由于在使用對HbAlc的FAOD的氧化還原反應(yīng)之前，預(yù)先添加于試樣中的糖化氨基酸未被分解，因此可見隨著糖化氨基酸溶液的添加比例的增加，ΔAbs.的相對值顯著上升。特別是，糖化氨基酸溶液的添加比例為3體積％時，ΔAbs.顯示約為75倍的值。另外，對于在上述氧化還原反應(yīng)之前，利用FAOD來處理添加的糖化氨基酸的比較例1和2，與比較例3相比更受到抑制，但ΔAbs.的相對值的上升顯著，當(dāng)糖化氨基酸溶液的添加比例為3體積％時，ΔAbs.在比較例1中顯示約為3倍的值，在比較例2中顯示約為9.5倍的值。與此相對，實施例1中即便增加糖化氨基酸溶液的添加比例，ΔAbs.的相對值也沒有顯著的變化，顯示基本一定的值，即便糖化氨基酸溶液的添加比例為3體積％時，ΔAbs.僅變化了1成左右。由這種結(jié)果可知，根據(jù)實施例，即便作為非測定對象物的糖化氨基酸是高濃度，也能進行非常有效的處理，由此能夠高精度地測定測定對象糖化胺。
(II)進一步改變實施例1中試劑1的FAOD濃度，進行與上述實施例1同樣的吸光度測定，計算ΔAbs.的相對值(第1試劑中FAOD的濃度3、5、10KU/L)。另外，分別對比較例1改變試劑a-1的FAOD濃度、對比較例2改變試劑a-2的FAOD濃度，同樣計算ΔAbs.的相對值(上述試劑a-1和試劑a-2的FAOD濃度0.3、3、30KU/L)。它們的結(jié)果示于下述表2。在下述表2中，F(xiàn)AOD濃度在實施例中表示第1試劑中的濃度、在比較例1中表示試劑a-1中的濃度、在比較例2中表示試劑a-2中的濃度、在比較例3中表示試劑a-3中的濃度。
表2

如上述表2所示，相對于未處理的比較例3，在比較例1中，通過增加試劑a-1中的FAOD濃度，提高了除去添加于試樣中的糖化氨基酸的能力。但是，如上所述，用于除去糖化氨基酸的試劑a-1的FAOD和用于與測定對象HbAlc的氧化還原反應(yīng)的試劑c的FAOD，在催化功能上不同，因此試劑c的FAOD所作用的糖化氨基酸殘存，不能進一步抑制吸光度的上升。另外，在比較例2中，如果增加試劑a-2的FAOD濃度，則除去糖化氨基酸的能力提高，但進一步增加FAOD濃度時，即便通過試劑b添加蛋白酶，相反地上述FAOD不會失活而大量地殘存。因此，在添加試劑c之前，殘存FAOD與Hb分解物反應(yīng)，并且，為了成為3試劑系統(tǒng)，由殘存FAOD產(chǎn)生的過氧化氫也不能迅速地與POD反應(yīng)，結(jié)果相反地吸光度下降。與此相對，實施例1即便改變FAOD的添加比例，也未特別發(fā)現(xiàn)與此相伴的吸光度變化，因此測定體系不受FAOD添加量的影響，能夠以充分的精度進行測定。
實施例2對本發(fā)明中的2試劑系統(tǒng)試劑盒的變量進行確認(rèn)。
(試樣)使用1.8mL精制水溶解被冷凍干燥的糖化血紅蛋白對照血液，制備試樣。作為上述冷凍干燥品，使用了低濃度(Hb＝2.4g/L、HbAlc％＝4.3％)、中濃度(Hb＝3.5g/L、HbAlc％＝9.0％)、高濃度(Hb＝3.1g/L、HbAlc％＝11.7％)3種。
(試劑)分別將下述表3所示的第1試劑(2-1、2-2、2-3)和第2試劑(2-1、2-2、2-3)按照下述表4所示的組合進行使用。
表3


(測定方法)將13μL的上述試樣與76μL第1試劑混合，在37℃下培育5分鐘。接著混合28μL第2試劑，在37℃下培育10分鐘后，通過上述自動分析器測定波長為751nm的吸光度。其結(jié)果示于下述表4。
表4

如上述表4所示，在第1試劑中含有POD和顯色性基質(zhì)的實施例2-1、在第2試劑中含有顯色性基質(zhì)的實施例2-2、以及在第2試劑含有POD和在第1試劑中含有顯色性基質(zhì)的實施例2-3，分別顯示同樣的結(jié)果，對應(yīng)于試樣中的HbAlc(％)吸光度上升。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的測定方法，即便在試樣中含有與FAOD反應(yīng)的非測定對象的糖化胺時，也能夠充分地排除其影響，因此能夠?qū)崿F(xiàn)測定精度優(yōu)異的糖化胺測定。特別是，在以往的測定方法中，為了除去非測定對象糖化胺，通常需要3個工序或更多個工序的處理，而根據(jù)本發(fā)明的測定方法，如上所述，即便僅用2個工序處理，也顯示比以往更優(yōu)異的除去影響的能力。因此，例如如果適用于紅血球中糖化Hb的測定，則測定精度比以往有所提高，且作為糖尿病診斷等指標(biāo)物質(zhì)的重要性也進一步提高。
權(quán)利要求
1.一種糖化胺的測定方法，其包含在試樣中添加蛋白酶，并通過所述蛋白酶分解所述試樣中作為測定對象的糖化胺的工序；在所述試樣中添加果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)，并使所述FAOD作用于糖化胺的分解物而進行氧化還原反應(yīng)的工序；測定所述氧化還原反應(yīng)的工序；通過所述氧化還原反應(yīng)的測定結(jié)果來決定所述糖化胺的量的工序，該測定方法的特征在于，其還進一步包含在添加所述蛋白酶的分解工序之前，在所述試樣中添加所述FAOD，并使所述FAOD作用于與所述測定對象糖化胺不同且存在于所述試樣中作為非測定對象的糖化胺的工序，以除去所述非測定對象糖化胺的影響，而且，通過在所述分解工序之前添加的FAOD來進行所述分解工序后的所述氧化還原反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中同時進行所述分解工序、所述氧化還原工序和測定所述氧化還原反應(yīng)的工序。
3.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述氧化還原反應(yīng)工序為使所述FAOD作用于所述糖化胺分解物從而產(chǎn)生過氧化氫的工序。
4.如權(quán)利要求3所述的測定方法，其中測定所述氧化還原反應(yīng)的工序包含在所述試樣中添加氧化酶和通過氧化而顯色的基質(zhì)，并利用所述氧化酶使所述產(chǎn)生的過氧化氫與所述基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的工序。
5.如權(quán)利要求4所述的測定方法，其中在使所述FAOD作用于所述非測定對象糖化胺的工序后，在所述試樣中同時添加蛋白酶、氧化酶和通過氧化而顯色的基質(zhì)，由此同時進行所述分解工序、所述氧化還原反應(yīng)工序和所述氧化還原反應(yīng)的測定工序。
6.如權(quán)利要求4所述的測定方法，其中在所述分解工序之前將所述氧化酶與所述FAOD一起添加在所述試樣中，進而在所述試樣中同時添加蛋白酶和通過氧化而顯色的基質(zhì)，由此在使所述FAOD作用于所述非測定對象糖化胺的工序后，同時進行所述分解工序、所述氧化還原工序和所述氧化還原反應(yīng)的測定工序。
7.如權(quán)利要求4所述的測定方法，其中在所述分解工序之前將所述通過氧化而顯色的基質(zhì)與所述FAOD一起添加在所述試樣中，進而在所述試樣中同時添加蛋白酶和氧化酶，由此在使所述FAOD作用于所述非測定對象糖化胺的工序后，同時進行所述分解工序、所述氧化還原反應(yīng)工序和所述氧化還原反應(yīng)的測定工序。
8.如權(quán)利要求4所述的測定方法，其中所述氧化酶為過氧化物酶。
9.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述FAOD為特異性地作用于氨基酸殘基的被糖化的α-氨基的酶、特異性地作用于氨基酸殘基的被糖化的側(cè)鏈的酶或者特異性地作用于氨基酸殘基的被糖化的α-氨基和氨基酸殘基的被糖化的側(cè)鏈的酶。
10.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述非測定對象糖化胺為糖化氨基酸。
11.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述測定對象糖化胺為糖化肽或糖化蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述測定對象糖化胺為血球內(nèi)糖化胺。
13.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述測定對象糖化胺為糖化血紅蛋白。
14.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中在所述分解工序前，在所述試樣中進一步添加四唑鎓化合物。
15.如權(quán)利要求14所述的測定方法，其中所述四唑鎓化合物含有2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓或其鹽。
16.如權(quán)利要求1所述的測定方法，其中在所述分解工序前，在所述試樣中進一步添加表面活性劑。
17.如權(quán)利要求16所述的測定方法，其中所述表面活性劑為兩性表面活性劑、陰離子性表面活性劑和陽離子性表面活性劑之中的至少一種。
18.一種在權(quán)利要求1所述的測定方法中使用的試劑盒，其特征在于，其由第1試劑和第2試劑構(gòu)成，所述第1試劑至少含有果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)，所述第2試劑至少含有蛋白酶，而且，過氧化物酶和通過氧化而顯色的基質(zhì)之中的任一個包含在所述第1試劑中、另一個包含在所述第2試劑中、或者所述過氧化物酶和所述基質(zhì)兩者都包含在第2試劑中。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述第1試劑進一步含有四唑鎓化合物。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述四唑鎓化合物含有2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓或其鹽。
21.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述第1試劑進一步含有表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠進行可靠性優(yōu)異的糖化胺的測定方法。在試樣中添加果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)，將上述試樣中存在的與測定對象糖化胺不同且作為非測定對象物的糖化胺除去后，在上述試樣中添加蛋白酶使上述測定對象糖化胺分解，并使上述分解物與已經(jīng)添加的上述FAOD反應(yīng)，測定該氧化還原反應(yīng)，由此測定糖化胺的量。
文檔編號G01N33/72GK1890379SQ20048003656
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者平井香 申請人:愛科來株式會社