專利名稱：制備α－糖化二肽的方法和測定α－糖化二肽的量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備α-糖化二肽的方法以及測定由該制備方法獲得的α-糖化二肽的量的方法。
背景技術(shù)：
糖化蛋白是非酶促糖化蛋白。具體來說，糖化蛋白是作為糖側(cè)上的醛基(就是說在醛糖(潛在具有醛基的單糖及其衍生物)側(cè)上)與蛋白側(cè)上的氨基非酶促共價(jià)鍵合的結(jié)果而產(chǎn)生的。此外，這樣的糖化蛋白是在作為反應(yīng)中間體產(chǎn)生的席夫堿進(jìn)行阿馬多里(Amadori)重排時(shí)形成的。因此，糖化蛋白也被稱作阿馬多里化合物。
糖化蛋白存在于體液例如體內(nèi)血液或生物樣本例如毛發(fā)中。存在于血液中的糖化蛋白的濃度，主要取決于溶解于血清中的糖類例如葡萄糖的濃度。在糖尿病情況下，糖化蛋白的產(chǎn)生提高。而且，存在于紅細(xì)胞中的糖化血紅蛋白的濃度或血清中的糖化白蛋白的濃度，在一定的時(shí)間內(nèi)反映過去的平均血液葡萄糖水平。因此，測定這樣的糖化蛋白的量對于診斷或控制糖尿病癥狀是很重要的。
糖化血紅蛋白(下文縮寫為HbA1c.)是果糖基蛋白，所述果糖基蛋白具有通過葡萄糖與血紅蛋白β-亞單位的N-末端氨基酸的非酶促結(jié)合以形成席夫堿而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致通過阿馬多里重排的果糖結(jié)合。這樣的HbA1c能夠臨床反映過去1-2個(gè)月的平均葡萄糖水平。因此，HbA1c是控制糖尿病的重要指標(biāo)，并且由此需要快速而準(zhǔn)確的測定方法。
目前，作為測定HbA1c的量的方法，IFCC Practical StandardMethods(參見U.等人，Clin.Chem.43，1944-1951(1997))公開了一種測定方法，所述方法包括用內(nèi)切蛋白酶Glu-C水解(于37℃處理18小時(shí))HbA1c，用HPLC將得自其β鏈的N-末端的六肽片斷分離，并用例如毛細(xì)管電泳法或質(zhì)譜法測定所得物的量。然而，該方法是有問題的，因?yàn)樾枰獙ｉT的儀器和復(fù)雜的程序，并且是不經(jīng)濟(jì)的。
因此，酶促方法已被建議作為以簡單的程序、低成本、高度準(zhǔn)確的方式測定HbA1c的量的方法。這樣的酶促方法包括用蛋白酶將糖化蛋白變性，使果糖基氨基酸氧化酶作用于釋放的糖化氨基酸，然后測定由此產(chǎn)生的過氧化氫的量。已經(jīng)公開用于這樣的酶促測定方法的氧化酶的實(shí)例，包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌產(chǎn)生的氧化酶(參見JP專利公開(Kokoku)5-33997 B(1993)和JP專利公開(Kokoku)6-65300 B(1994))，曲霉屬(Aspergillus)菌株產(chǎn)生的氧化酶(參見JP專利公開(Kokai)3-155780 A(1991))，赤霉菌屬(Gibberella)菌株產(chǎn)生的氧化酶(參見JP專利公開(Kokai)7-289253A(1995))，鐮孢屬(Fusarium)菌株產(chǎn)生的氧化酶(參見JP專利公開(Kokai)7-289253 A(1995)和JP專利公開(Kokai)8-154672 A(1996))，青霉屬(Penicillium)菌株產(chǎn)生的氧化酶(參見JP專利公開(Kokai)8-336386 A(1996))，和酮胺氧化酶(參見JP專利公開(Kokai)5-192193 A(1993))。而且，下列方法(a)-(i)因此作為實(shí)例早已眾所周知，其中α-糖化氨基酸(氨基酸的α-氨基已被糖化)從具有糖化N-末端氨基酸的血紅蛋白中被釋放出來方法(a)，所述方法包括將8M尿素加到糖化血紅蛋白中，把混合物煮沸20分鐘以變性，進(jìn)行胰蛋白酶處理，然后用得自青霉屬菌株的果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)來測定所得物的量(參見JP專利公開(Kokai)8-336386 A(1996))；方法(b)，所述方法包括用蛋白酶處理糖化血紅蛋白，然后用得自曲霉屬菌株的FAOD來測定所得物的量(參見JP專利公開(Kokai)10-33177 A(1998)和JP專利公開(Kokai)10-33180 A(1998))；方法(c)，所述方法包括用內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶來測定糖化血紅蛋白的量(參見國際專利公開97/13872 pamphlet)；方法(d)，所述方法包括用絲氨酸羧肽酶來酶促處理具有果糖基N-末端纈氨酸的肽或蛋白(參見JP專利公開(Kokai)2001-57897A)；方法(e)，所述方法包括用能夠?qū)⒌谌齻€(gè)亮氨酸的羧基側(cè)從HbA1c的β鏈N-末端剪切的蛋白酶進(jìn)行處理，用能夠?qū)⒔M氨酰基亮氨酸從產(chǎn)生的果糖基纈氨?；?組氨酰基-亮氨酸切除下來的蛋白酶處理所得物，然后測定血紅蛋白A1c的量(參見JP專利公開(Kokai)2000-300294 A)；方法(f)，所述方法包括用得自棒狀桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)的新酶將糖化氨基酸釋放(這樣的酶能夠從糖化蛋白釋放具有糖化α-氨基的氨基酸)，然后測定所得物的量(參見國際專利公開00/50579 pamphlet)；方法(g)，所述方法包括用得自鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Mucor和青霉菌屬的新酶將糖化氨基酸釋放(這樣的酶能夠從糖化蛋白釋放具有糖化α-氨基的氨基酸)，然后測定所得物的量(參見國際專利公開0/61732 pamphlet)；方法(h)，所述方法包括在四唑 化合物存在下，用蛋白酶處理包含蛋白的樣本，使由此獲得的蛋白水解所得物與FAOX反應(yīng)，然后快速測定糖化蛋白的量(參見國際專利公開02/27012pamphlet)；和方法(i)，所述方法包括使去封閉氨基肽酶、二肽基氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、N-?；被；?肽水解酶或半纖維素酶作用于含有N-末端糖化肽或蛋白的試驗(yàn)溶液，釋放N-末端糖化氨基酸，然后測定由此產(chǎn)生的糖化氨基酸的量(參見JP專利公開(Kokai)2002-315600 A)。
然而，按照本發(fā)明者們進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，即通過使各種蛋白酶作用于HbA1c而釋放α-糖化氨基酸的實(shí)例也是沒有的。具體來說，各種蛋白酶不能將HbA1c切割成小于α-糖化肽的尺寸。幾乎沒有α-糖化氨基酸能夠被這樣的蛋白酶切割。只要使用上述果糖基氨基酸氧化酶，HbA1c的量就不能夠用良好的敏感性來測定，這已經(jīng)成為定論。如上面所述，對于HbA1c測定，以最高敏感性測定HbA1c的良好方法是涉及測定α-糖化肽或優(yōu)選測定α-糖化二肽的測定方法，所述α-糖化肽或α-糖化二肽是用氧化酶作用于作為底物的這樣的肽或二肽，通過蛋白酶處理釋放出來的。這樣的作用于α-糖化二肽的氧化酶和能夠切除糖化二肽的蛋白酶已經(jīng)被公開于JP專利公開(Kokai)2001-95598 A和JP專利公開(Kokai)2003-235585 A。然而，為了實(shí)現(xiàn)以較高敏感性進(jìn)行快速的HbA1c測定，就需要具有較高的切除α-糖化二肽的活性的蛋白酶。
因此，本發(fā)明所要達(dá)到的目的是提供制備α-糖化二肽的方法，通過這種方法，α-糖化二肽(其中二肽的N-末端氨基酸的α-氨基已經(jīng)被糖化的糖化二肽)通過一種蛋白酶處理被有效地從糖化蛋白或糖化肽中釋放出來。本發(fā)明所要達(dá)到的另一目的是提供測定α-糖化二肽的量的方法。所述方法通過使用上述氧化酶測定釋放的α-糖化肽的量，能夠用簡單的程序、以高度精確的方式、在短時(shí)間內(nèi)測定糖化蛋白或糖化肽的量。
本發(fā)明公開作為深入研究達(dá)到上述目的的結(jié)果，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，通過一種蛋白酶處理，α-糖化二肽(其中二肽的N-末端氨基酸的α-氨基已經(jīng)被糖化的糖化二肽)能夠被有效地從糖化蛋白或糖化肽中釋放出來。本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，通過使用上述氧化酶測定釋放的α-糖化肽的量，可以高度精確的方法、用簡單的程序、在短時(shí)間內(nèi)測定糖化蛋白或糖化肽。這樣，本發(fā)明者們就完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供以下本發(fā)明(1)制備α-糖化二肽的方法，所述方法包括使蛋白酶作用于N-末端糖化肽或N-末端糖化蛋白；(2)按照(1)制備α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化肽是果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；(3)按照(1)制備α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化蛋白是糖化血紅蛋白；(4)按照(1)、(2)或(3)制備α-糖化二肽的方法，其中所述蛋白酶是一種或多種選自下列的蛋白酶由曲霉屬、芽孢桿菌屬(Bacillus)、根霉屬(Rhizopas)、Tritirachium、葡糖球菌屬(Staphylococcus)、鏈酶菌屬(Streptomyces)等微生物產(chǎn)生的蛋白酶，由動(dòng)物例如豬和牛產(chǎn)生的蛋白酶，以及由植物例如番木瓜屬、無花果和波蘿產(chǎn)生的蛋白酶；(5)按照(1)、(2)或(3)制備α-糖化二肽的方法，其中所述蛋白酶是一種或多種選自下列的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶、鏈酶蛋白酶、分散酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰酶、Glu-C和組織蛋白酶；(6)按照(1)至(5)制備α-糖化二肽的方法，其中所述α-糖化二肽是果糖基纈氨酰組氨酸；和(7)測定α-糖化二肽的量的方法，所述方法包括使果糖基肽氧化酶作用于按照(1)至(6)的制備方法獲得的α-糖化二肽，然后測定產(chǎn)生的過氧化氫的量。
下面將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明要求2003年9月18日提交的日本專利申請2003-326224和2003年11月19日提交的日本專利申請2003-421755的優(yōu)先權(quán)，并且包括上述專利申請的說明書中的內(nèi)容和/或附圖。
只要是通過將蛋白與醛糖例如葡萄糖非酶促結(jié)合而產(chǎn)生的，N-末端糖化蛋白可以是任何蛋白。
由活體產(chǎn)生的糖化蛋白的實(shí)例包括糖化白蛋白和HbA1c。例如，可以將本發(fā)明適宜地用于測定HbA1c的量等。而且，本發(fā)明中N-末端糖化肽，不但包括通過將樣本中所含肽與醛糖例如葡萄糖非酶促結(jié)合而產(chǎn)生的肽，而且包括通過酶促(例如蛋白酶和肽酶)或非酶促(例如物理搖晃和加熱)切割上述N-末端糖化蛋白而產(chǎn)生的肽。這樣的糖化蛋白或糖化肽通常也存在于食物例如果汁、糖果、調(diào)味品和粉狀食物中。只要含有上述糖化蛋白或糖化肽，本發(fā)明含有糖化蛋白或糖化肽的樣本可以是任何樣本。這樣的樣本的實(shí)例可以包括體內(nèi)樣本例如體液(例如食物和唾液)和毛發(fā)。這樣的樣本的另外的實(shí)例包括上面所述食物等?？梢詫⑦@些樣本直接進(jìn)行測定，或者在過濾、透析處理等后間接進(jìn)行測定。而且，例如，可以將應(yīng)當(dāng)測定量的糖化蛋白或糖化肽進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s、萃取，然后用水、緩沖液等進(jìn)行稀釋。
只要能夠作用于上述糖化蛋白或糖化肽并且然后釋放出α-糖化二肽，能夠用于本發(fā)明的蛋白酶可以是任何酶?？梢园凑毡磺懈畹奶腔鞍谆蛱腔牡念愋?，對優(yōu)選的蛋白酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇。這樣的蛋白酶或肽酶的實(shí)例包括蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶B、胰酶、組織蛋白酶、羧肽酶、內(nèi)切蛋白酶Glu-C、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶和氨肽酶。尤其是在本發(fā)明中，能夠有效地釋放α-糖化二肽的蛋白酶的實(shí)例包括得自曲霉屬的蛋白酶，例如“IP酶、AO蛋白酶、肽酶和molsin(全部由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))”、“蛋白酶A5(由KYOWAKASEI CO.，LTD.生產(chǎn))”、“umamizyme、蛋白酶A、蛋白酶M和蛋白酶P(全部由Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))”、“sumizymeMP、sumizyme LP-20、sumizyme LPL和sumizyme AP(全部由ShinNihon Chemical Co.Ltd.生產(chǎn))”和“蛋白酶6(由Fluka生產(chǎn))”；得自Rhizopas的酶，例如“肽酶R(由Amano Enzyme Inc生產(chǎn))”；得自芽孢桿菌屬的蛋白酶，例如“分散酶(由Roche生產(chǎn))”，“枯草桿菌蛋白酶(由Boehringer Mannheim Corporation生產(chǎn))”，“蛋白酶N(由Fluka生產(chǎn))”，“蛋白酶類型VII(由Sigma-AldrichCorporation生產(chǎn))”，“蛋白酶(細(xì)菌)(由Fluka生產(chǎn))”，“蛋白酶N、proleather FG-F和蛋白酶S(全部由Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))”，“蛋白酶類型X(由Sigma-Aldrich Corporation生產(chǎn))”，“嗜熱菌蛋白酶(由DAIWA KASEI K.K.生產(chǎn))”，“鏈酶蛋白酶E(由Kaken Pharmaceutical Co.，Ltd.生產(chǎn))”和“中性蛋白酶(由TOYOBO.，LTD.生產(chǎn))”；得自鏈酶菌屬的蛋白酶，例如“鏈酶蛋白酶(由Boehringer Mannheim Corporation生產(chǎn))”，“蛋白酶XIV型(由Sigma-Aldrich Corporation生產(chǎn))”和“堿性蛋白酶(由TOYOBO.，LTD.生產(chǎn))”；得自Tritirachium的蛋白酶，例如“蛋白酶K(由Roche和Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生產(chǎn))”；得自葡糖球菌屬的蛋白酶，例如“Glu-C(由Boehringer MannheimCorporation生產(chǎn))”；得自植物的蛋白酶，例如“木瓜蛋白酶(由Roche，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.、Sigma-AldrichCorporation、Amano Enzyme Inc.和ASAHI FOOD &HEALTHCARE，LTD.生產(chǎn))”，“無花果蛋白酶(由Sigma-AldrichCorporation生產(chǎn))”，“菠蘿蛋白酶(由Enzyme Inc.和Sigma-AldrichCorporation生產(chǎn))”和得自動(dòng)物的蛋白酶，例如“胰酶(由Wako PureChemical Industries，Ltd.生產(chǎn))”和“組織蛋白酶B(由Sigma-AldrichCorporation生產(chǎn))。含有這些蛋白酶的樣本是特別優(yōu)選使用的?？梢詫⑸鲜龅鞍酌竼为?dú)使用，或者將它們的兩種或多種類型組合使用。例如，對于HbA1c來說，已經(jīng)證明使用內(nèi)切蛋白酶Glu-C可以產(chǎn)生α-糖化六肽(果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)(Kobold U.等人，Clin.Chem.1997，431944-1951)。因此，對于由HbA1c制備糖化二肽，將Glu-C與上述蛋白酶組合是非常有效的方法。
樣本的處理?xiàng)l件可以是任何條件，只要在這樣的條件下本文所用的蛋白酶能夠作用于糖化蛋白，測定其量，然后α-糖化二肽能夠在短時(shí)間內(nèi)被釋放出來即可。本文所用蛋白酶的量的大體選擇取決于樣本中糖化蛋白的含量、處理?xiàng)l件等。在實(shí)例中，將得自曲霉屬菌株的蛋白酶(例如由Amano Enzyme Inc.銷售的蛋白酶P)以0.5mg/mL-50mg/mL而優(yōu)選1mg/mL-20mg/mL的濃度加入。而且，如果需要也可以加入其它蛋白酶。使用于蛋白酶處理的pH可以是未調(diào)節(jié)的pH?；蛘?，為了達(dá)到所使用的蛋白酶作用的適宜的pH，例如，可以用適宜的pH調(diào)節(jié)劑例如鹽酸、乙酸、硫酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀將pH調(diào)節(jié)至pH 2-pH 9而優(yōu)選pH 3-pH 8。處理也可以在溫度范圍例如20℃-50℃之間進(jìn)行。根據(jù)所使用的酶，處理也可以在45℃-70℃的較高溫度范圍進(jìn)行。處理時(shí)間可以是足以使糖化蛋白變性的任何時(shí)間。具體來說，處理可以進(jìn)行1-180分鐘而優(yōu)選2-60分鐘?？梢灾苯邮褂糜纱双@得的處理溶液，或者如果需要，在進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訜?、離心、濃縮、稀釋等后間接使用。
隨后，可以對通過上述方法獲得的α-糖化二肽的量進(jìn)行測定。
只要能夠測定α-糖化二肽的量，任何方法都是可以使用的。以高度精確的方式、用簡單的程序、以低成本、在短時(shí)間內(nèi)測定α-糖化二肽的量的優(yōu)選方法的實(shí)例包括使氧化酶作用于α-糖化二肽的方法和使用HPLC的方法。
首先，描述使氧化酶作用于α-糖化二肽的方法。
使氧化酶作用于上述α-糖化二肽，然后測定由所述作用獲得的產(chǎn)物或所消耗的產(chǎn)物的量，由此使得能夠通過酶促方法測定糖化二肽的量。作為氧化酶，任何酶都是可以使用的，條件是其特異性地作用于α-糖化二肽以催化產(chǎn)生過氧化氫的反應(yīng)。
這樣的酶的實(shí)例包括由公開于JP專利公開(Kokai)2001-95598 A的由大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α(pFP1)(FERM P-17576)制備的果糖基肽氧化酶，和公開于JP專利公開(Kokai)2003-235585 A的果糖基肽氧化酶。
除了上述實(shí)例以外，通過研究自然界中的微生物或通過研究得自由動(dòng)物或植物的酶，可以獲得特異性地作用于α-糖化二肽以催化產(chǎn)生過氧化氫的反應(yīng)的酶。而且，通過研究獲得的這樣的酶可以用基因重組技術(shù)獲得，并且由此獲得的重組酶也可以適當(dāng)?shù)挠枰允褂?。而且，通過修飾已知的果糖基氨基酸氧化酶等也可以獲得這樣的酶。這樣的已知的果糖基氨基酸氧化酶等的實(shí)例包括由棒狀桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的氧化酶(JP專利公開(Kohyo)5-33997 B(1993)和JP專利公開(Kohyo)6-65300 B(1994))，由曲霉屬菌株產(chǎn)生的氧化酶(JP專利公開(Kokai)3-155780 A(1991))，由赤霉菌屬菌株產(chǎn)生的氧化酶(JP專利公開(Kokai)7-289253 A(1995))，由鐮孢屬菌株產(chǎn)生的氧化酶(JP專利公開(Kokai)7-289253 A(1995)和JP專利公開(Kokai)8-154672 A(1996))，由青霉菌屬菌株產(chǎn)生的氧化酶(JP專利公開(Kokai)8-336386 A(1996))，和酮胺氧化酶(JP專利公開(Kokai)5-192193 A(1993))。
為了通過修飾已知的果糖基氨基酸氧化酶等獲得作用于α-糖化二肽的氧化酶，將能夠產(chǎn)生上述已知果糖基氨基酸氧化酶等的微生物暴露于紫外線、X射線、放射等?；蛘撸惯@樣的氧化酶與突變劑例如甲磺酸乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸接觸，以進(jìn)行突變處理。產(chǎn)生作用于α-糖化二肽的氧化酶的微生物選自由此獲得的突變微生物。然而，一般說來，作用于α-糖化二肽的氧化酶可以通過將突變引入基因(下文稱作野生型基因)例如上述已知的果糖基氨基酸氧化酶的基因等獲得。任何野生型基因同樣可以被用于引入突變，條件是所述野生型基因是上述果糖基氨基酸氧化酶或所屬氧化酶類似物的野生型基因，例如，所述野生型基因能夠通過引入突變獲得作用于α-糖化二肽的氧化酶。
通過下述方法，可以測定作用于α-糖化二肽的果糖基肽氧化酶的效價(jià)。這樣的效價(jià)也可以通過其它方法加以測定。
(1)試劑的制備試劑1(R1)把1.0kU過氧化物酶(下文縮寫為POD，由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))和100mg 4-氨基安替比林(下文縮寫為4AA，由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))溶解于0.1M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)中。將所得溶液制備成1L的恒定體積。
試劑2(R2)把500mg TOOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-間甲苯胺，由DOJINDO LABORATORIES生產(chǎn))溶解于離子交換水中。將所得溶液制備成100mL的恒定體積。
試劑3(R3)將1.25g果糖基Val-His(MW416，其制備將在下面描述)溶解于離子交換水中。將所得溶液制備成10mL的恒定體積。
(2)測定把100μL R2加到2.7mL R1中。另外加入100μL含有果糖基肽氧化酶的酶溶液并將溶液充分混合，然后在37℃預(yù)熱5分鐘。
隨后，加入100μL R3并與溶液充分混合。用分光光度計(jì)(U-2000A，由Hitachi，Ltd.生產(chǎn))測量在555nm的吸收度變化(在37℃與R3反應(yīng)前和反應(yīng)5分鐘后測定的吸收度之間的差異)。另外，進(jìn)行對照溶液的類似程序，只是加入100μL離子交換水代替100μLR3。通過繪制反映在先前制備的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液的各種濃度下產(chǎn)生的色素的量的吸收度，獲得曲線圖。以這樣的曲線圖為基礎(chǔ)，獲得與吸收度變化相對應(yīng)的過氧化氫的量。這些數(shù)值被用作酶溶液中的活性單位。在1分鐘產(chǎn)生1μmol過氧化氫的量被確定為1U。
通過使上述果糖基肽氧化酶作用于通過本發(fā)明蛋白酶處理而釋放出的α-糖化肽，可以測定樣本中α-糖化肽的量。而且，通過測定樣本中α-糖化肽的量，可以比較蛋白酶切除α-糖化肽的效率。本文使用的果糖基肽氧化酶的量取決于處理溶液中所含的α-糖化肽的量。例如，可以將果糖基肽氧化酶以0.1U/mL-50U/mL，優(yōu)選1U/mL-10U/mL的最終濃度加入。使氧化酶產(chǎn)生作用時(shí)所使用的pH例如可以為pH 3-pH 11，優(yōu)選pH 5-pH 9?？紤]到果糖基肽氧化酶的最適宜的pH，優(yōu)選用緩沖液調(diào)節(jié)pH以達(dá)到適合用于測定的pH。然而，只要pH能夠使這樣的氧化酶產(chǎn)生作用，pH不限于這樣的pH。調(diào)節(jié)pH的方法沒有特別限制。這樣的緩沖劑的實(shí)例包括N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸、磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、三(羥基甲基)-氨基甲烷、硼酸鹽、檸檬酸鹽、谷氨酸二甲酯、三羥甲基甘氨酸和HEPES。而且，如果需要，也可以將蛋白酶處理后的處理溶液的pH調(diào)節(jié)在上述pH。
例如，作用時(shí)間范圍在1-120分鐘，優(yōu)選1-30分鐘之間，并且取決于被用作底物的糖化肽的量。只要足以使果糖基肽氧化酶作用于這樣的肽，任何時(shí)間都是可以使用的。例如，作用溫度范圍在20℃-45℃之間。可以適宜地選擇用于一般酶促反應(yīng)的溫度。
也可以用任何方法測定通過果糖基肽氧化酶的作用產(chǎn)生的過氧化氫的量。這樣的方法的實(shí)例包括使用氧電極的電方法，和優(yōu)選使用過氧化物酶和適當(dāng)?shù)纳孜锏拿复俜椒?。例如，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用程序簡單且時(shí)間短的酶促方法進(jìn)行測定。用酶促方法測定過氧化氫的量的試劑的實(shí)例是由5mM-500mM而優(yōu)選50mM-100mM緩沖劑(優(yōu)選pH 4-pH 10)、0.01 mM-50mM而優(yōu)選0.1mM-20mM作為生色底物的4-氨基安替比林、0.1U/mL-50U/mL而優(yōu)選1U/mL-20U/mL過氧化物酶等組成的。
用于本發(fā)明的緩沖劑的實(shí)例包括N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸、磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、三(羥基甲基)-氨基甲烷、硼酸鹽、檸檬酸鹽、谷氨酸二甲酯、三羥甲基甘氨酸和HEPES。生色底物的實(shí)例，除了4-氨基安替比林以外，包括ADOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-間茴香胺)、ALOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)苯胺)、10-(羧基甲基-氨基羰基)-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪(DA-67)、N-(羧基甲基-氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)二苯基胺(DA-64)。而且，如果需要，在不損害本發(fā)明目的的范圍內(nèi)，可以適當(dāng)?shù)丶尤敫鞣N添加劑，包括增溶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑(例如triton X-100、bridge 35、Tween80或膽酸鹽)、還原劑例如(例如二硫蘇糖醇、巰基乙醇或L-半胱氨酸)、牛血清白蛋白、糖類(例如甘油、乳糖或蔗糖)等。
當(dāng)進(jìn)行過氧化氫的量的測定時(shí)，一般情況下，優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行通過氧化酶的作用產(chǎn)生過氧化氫的步驟。在本發(fā)明中，例如，優(yōu)選將果糖基肽氧化酶以0.1U/mL-50U/mL，優(yōu)選1U/mL-10U/mL的量加到上述測定過氧化氫的量的試劑中。
這些試劑可以干燥的形式或以溶解狀態(tài)使用，或者也可以薄膜上的載體例如浸漬以試劑的紙(例如可浸漬的紙片)的形式使用。也可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法將用于測定試劑中的酶固定然后重復(fù)使用。例如，用于測定的溫度范圍在20℃-45℃之間。這樣的溫度可以適宜地選自用于一般酶促反應(yīng)的溫度。測定所要求的時(shí)間可以根據(jù)各種測定條件適宜地加以選擇。例如，用于測定的這樣的時(shí)間范圍可在0.1-60分鐘，優(yōu)選1-10分鐘之間。用分光光度計(jì)測定上述測定試劑的顏色顯色程度(吸收度的變化量)。將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)吸收度對比。如此，樣本中所含的糖化肽或糖化蛋白的量就得以測定。也可以將通用的自動(dòng)分析儀用于測定。
隨后，將描述通過HPLC測定釋放的糖化肽的量的方法。
如果需要，在將處理溶液離心過濾或薄膜過濾，然后適當(dāng)?shù)貪饪s和/或稀釋之后，將含有釋放的糖化肽的處理溶液直接或間接地用于HPLC測定。只要能夠測定上述糖化肽的量，本發(fā)明中使用的HPLC可以是任何HPLC。
本文使用的反相HPLC柱的實(shí)例包括CAPCEL-PAK C-18(由Shiseido Co.，Ltd.生產(chǎn))、TSKgel ODS80Ts(由TOSOHCORPORATION生產(chǎn))、和Shodex RSpak RP18-415(由SHOWADENKO K.K.生產(chǎn))。本文使用的離子交換HPLC柱包括TSKgelSP-2SW和TSKgel CM-2SW(由TOSOH CORPORATION生產(chǎn))。
在蛋白酶處理溶液被吸附到這樣的柱上后，將目標(biāo)糖化肽用洗脫劑洗脫。只要在本發(fā)明中適合于測定，洗脫劑可以是任何洗脫劑。用于反相柱的這樣的洗脫劑的實(shí)例，包括含有三氟乙酸的乙腈與水的混合溶液、磷酸鹽緩沖液與乙腈的混合溶液以及氨水溶液與乙腈的混合溶液。用于離子交換柱的這樣的洗脫劑的實(shí)例，包括磷酸鹽緩沖液與NaCl溶液的混合溶液以及乙酸鹽緩沖液與乙腈的混合溶液。通過使用這樣的洗脫液，可以進(jìn)行分段或梯度洗脫。優(yōu)選的洗脫劑的實(shí)例包括0.1％TFA(三氟乙酸)/水至0.1％TFA/30％乙腈的梯度洗脫劑等。用于本發(fā)明的柱、洗脫劑、洗脫條件(例如洗脫方法、洗脫劑的流速和溫度)等是適當(dāng)組合的。因此，優(yōu)選對條件進(jìn)行這樣的設(shè)置，以便在所述條件下目標(biāo)α-糖化肽的洗脫峰與其它組分的峰盡可能的遠(yuǎn)。
只要能夠測定糖化肽，可以使用任何方法測定用洗脫劑洗脫的糖化肽。本文使用的這樣的方法的實(shí)例包括探測在210nm、215nm等的波長的吸收度的方法，抽樣每一探測峰然后將所得物進(jìn)行質(zhì)譜分析以確定目標(biāo)分子量的峰的方法，將洗脫的產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜分析的方法，和按時(shí)間取樣洗脫級分然后用茚三酮法或糖染色法進(jìn)行比色分析的方法。例如，當(dāng)使用探測吸收度的方法時(shí)，計(jì)算由監(jiān)測器探測的糖化肽的洗脫峰面積。將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的洗脫峰面積進(jìn)行比較，然后可以測定糖化肽和糖化蛋白的量。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式通過參考制備實(shí)施例和實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的具體描述。然而，本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)施例的限制。
(制備實(shí)施例)制備糖化二肽通過下面方法制備用于本發(fā)明的α-糖化二肽。
把7.0g(27.6mmol)市售二肽(纈氨?；M氨酸(Val-His)，由BACHEM，Switzerland生產(chǎn))溶解于14mL水中。將5.8mL乙酸加到該溶液中，然后在約50℃溶解，繼之讓其澄清。隨后，加入120mL乙醇并與溶液混合，然后加入14g(77.8mmol)葡萄糖并與溶液充分混合。
隨后，將溶液在封閉的容器中于80℃加熱6小時(shí)，在此過程中將溶液偶爾攪拌。反應(yīng)溶液隨時(shí)間而變成棕色。將反應(yīng)溶液隨時(shí)間抽樣。適當(dāng)稀釋后，將溶液進(jìn)行反相高效液相色譜法分析、薄層色譜法分析或質(zhì)譜分析。由此檢測目標(biāo)糖化二肽的產(chǎn)生。一般情況下，通過6-10小時(shí)的熱處理可以以較好的產(chǎn)率獲得糖化二肽。隨后，收集反應(yīng)溶液然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮15-30倍。將濃縮物吸附到用99.5％乙醇平衡的硅膠柱(體積2000mL)上。將柱用二倍柱體積的99.5％乙醇洗滌，以便除去混雜的組分例如未反應(yīng)的葡萄糖。然后相繼用3倍柱體積的95％乙醇、3倍柱體積的90％乙醇、3倍柱體積的85％乙醇以及3倍柱體積的80％乙醇進(jìn)行洗脫。將每一洗脫級分用薄層色譜法、反相高效液相色譜法等進(jìn)行分析。收集含有目標(biāo)果糖基Val-His的95％-90％乙醇洗脫的級分。將收集的產(chǎn)物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮并干燥，由此獲得大約3g部分純化的產(chǎn)物。作為質(zhì)譜分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)純化的產(chǎn)物的分子量為MW 416，其與果糖基Val-His的分子量一致。而且，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為核磁共振光譜法分析所確認(rèn)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，用離子交換樹脂提高純化度，將部分純化的產(chǎn)物吸附并脫吸。將所得物用于隨后的試驗(yàn)。而且，通過與上述使用Val的類似方法，獲得果糖基Val的部分純化的產(chǎn)物。
實(shí)施例(實(shí)施例1)由糖化六肽釋放糖化二肽為了篩選能夠有效切除α-糖化二肽的蛋白酶，使表1所列蛋白酶作用于α-糖化六肽(果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu；由PEPTIDEINSTITUTE，INC.生產(chǎn))。使用果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶測定由此產(chǎn)生的產(chǎn)物的量。
<制備蛋白酶反應(yīng)樣本>
1.8mMα-糖化六肽12μl20mg/ml蛋白酶溶液(當(dāng)該濃度不能夠達(dá)到時(shí)，以盡可能高的濃度制備該溶液，或者當(dāng)?shù)鞍酌甘且后w狀態(tài)時(shí)使用同樣的濃度)8μl100mM磷酸鉀緩沖液pH 8.0(將pH按照最佳蛋白酶pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)馗淖?4μl將上述組分充分混合，然后使其在37℃反應(yīng)2小時(shí)。將所得物在90℃加熱處理3分鐘，然后離心，由此獲得被分離成蛋白酶反應(yīng)樣本的上清液。此外，用蒸餾水代替底物進(jìn)行類似的程序，由此制備空白樣本。
<用于測定蛋白酶反應(yīng)樣本中的糖化二肽和糖化氨基酸的反應(yīng)的溶液>
100mM磷酸鉀緩沖液pH 8.045mM 4AA0.5mM TOOS1U/ml POD(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))0.1U/ml果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶把145μl用于測定糖化二肽和糖化氨基酸的量的上述反應(yīng)溶液分配到微量滴定板的孔中。加入5μl上述蛋白酶反應(yīng)樣本并與該溶液充分混合。將所得物在555nm(A0)進(jìn)行測定。隨后，在30℃溫育20分鐘，然后將所得物在555nm(A1)進(jìn)行測定。用空白樣本代替蛋白酶反應(yīng)樣本進(jìn)行類似的程序，由此獲得A0空白和A1空白。下式表示作為吸收變化的蛋白酶對α-糖化六肽的作用。
ΔA＝(A1-A0)-(A1空白-A0空白)
另外，下面四種氧化酶被用于測定糖化產(chǎn)物的量的上述反應(yīng)中作為果糖基肽氧化酶的FPOX-C和FPOX-E(兩者皆由KIKKOMANCORPORATION生產(chǎn))；作為果糖基氨基酸氧化酶的FAOX(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))；和FLOD(由Asahi KaseiCorporation生產(chǎn))。這些氧化酶在底物特異性方面是不同的。具體說來，F(xiàn)POX-C和FPOX-E作用于果糖基Val-His和果糖基Val，而FAOX和FLOD只作用于果糖基Val。因此，可以斷定，當(dāng)果糖基Val-His通過上述蛋白酶處理被切除時(shí)，將會(huì)觀察到FPOX-C和FPOX-E的吸收度變化。還可以斷定，如果果糖基Val被切除，將會(huì)觀察到FPOX-C、FPOX-E、FAOX和FLOD的吸收度變化。
表1 顯示結(jié)果(單位；mAbs)

346677為具有磷酸酯主鏈和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe21mer。從5’端開始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16、18和20上為2’OMe。
346678為具有磷酸酯(P＝O)主鏈和5’末端磷酸的未修飾核糖21mer。
346680為具有磷酸酯(P＝O)主鏈和5’末端磷酸的未修飾核糖21mer。
346679為具有磷酸酯主鏈和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe21mer。從5’端開始在核苷1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21上為2’OMe。
346681為具有磷酸酯主鏈和5’末端磷酸的交互核糖和2’-OMe21mer。從5’端開始在核苷2、4、6、8、10、12、14、16、18和20上為2’OMe。
表15HeLa細(xì)胞中交互2’-Ome修飾平端21mer siRNA-在eIF4E_1(341887)周圍微步移


當(dāng)用FAOX或FLOD通過探測產(chǎn)生的產(chǎn)物來評估蛋白酶的活性時(shí)(探測果糖基Val)，獲得的所有蛋白酶情況的吸收度變化大約都是0。這表明，被認(rèn)為從糖化蛋白或糖化肽切除果糖基Val的各種蛋白酶具有非常弱的切除果糖基Val活性。這樣的各種蛋白酶是亮氨酸氨肽酶、脫封閉氨肽酶、N-酰基氨基?；?肽水解酶和組織蛋白酶C(全部公開于JP專利公開(Kokai)2002-315600 A)；氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、賴氨酰內(nèi)肽酶、proleather和菠蘿蛋白酶(全部公開于國際專利公開97/13872單行本)；和絲氨酸羧肽酶(公開于JP專利公開(Kokai)2001-57897 A)。
相反，當(dāng)用FPOX-C或FPOX-E進(jìn)行探測時(shí)(探測果糖基Val-His)，在下列酶的情況下觀察到強(qiáng)烈的吸收度變化作為得自曲霉屬的酶的IP酶、AO蛋白酶、肽酶、蛋白酶A5、umamizyme、蛋白酶A、蛋白酶M、蛋白酶P、sumizyme MP、sumizyme LP-20和蛋白酶6；作為得自Rhizopas的酶的肽酶R；作為得自芽孢桿菌屬的酶的分散酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶N、蛋白酶VII型、蛋白酶(Bacterial)、蛋白酶N、蛋白酶X型、嗜熱菌蛋白酶、鏈酶蛋白酶E和中性蛋白酶；作為得自鏈酶菌屬的酶的鏈酶蛋白酶、蛋白酶XIV型和堿性蛋白酶；作為得自Tritirachium的酶的蛋白酶K；作為得自植物的酶的木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶；和得自動(dòng)物的酶的胰酶和組織蛋白酶B。
在下列酶的情況下，觀察到較弱的吸收度變化作為得自曲霉屬的酶的molsin、sumizyme LPL和sumizyme AP；作為得自芽孢桿菌屬的酶的proleather FG-F；作為得自葡糖球菌屬的酶的Glu-C；和作為得自植物的酶的菠蘿蛋白酶。如上面所述，證明通過上述蛋白酶處理，α-糖化二肽能夠被有效地從α-糖化六肽切除。
(實(shí)施例2)蛋白酶以較短的反應(yīng)時(shí)間切除糖化二肽的活性為了篩選在較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)能夠有效地切除α-糖化二肽的蛋白酶，進(jìn)行與實(shí)施例1類似的不改變其各種條件的試驗(yàn)。然而，將蛋白酶的反應(yīng)時(shí)間由2小時(shí)縮短至5分鐘。反應(yīng)后測定α-糖化二肽和α-糖化氨基酸的量。結(jié)果由下列等式表示(類似于實(shí)施例1)ΔA＝(A1-A0)-(A1空白-A0空白)同時(shí)將結(jié)果概括于表2(單位；mAbs)。
表2

作為與JP專利公開(Kokai)2003-235585A中公開的得自曲霉屬的蛋白酶(AO蛋白酶、肽酶和molsin)比較的結(jié)果，得自曲霉屬的蛋白酶(蛋白酶P和sumizyme MP)顯示比AO蛋白酶情況下高大約5倍的吸收度變化，得自芽孢桿菌屬的蛋白酶(分散酶、蛋白酶N和蛋白酶S)顯示比AO蛋白酶情況下高4-5倍的吸收度變化，得自Tritirachium的蛋白酶(蛋白酶K)顯示幾乎與AO蛋白酶情況下相等的吸收度變化，而得自植物的蛋白酶(木瓜蛋白酶)顯示比AO蛋白酶情況下高大約4倍的吸收度變化。因此，證明使用上述蛋白酶能夠在較短的時(shí)間內(nèi)有效地切除糖化二肽。這表明以較高的敏感性在較短的時(shí)間內(nèi)測定糖化蛋白或糖化肽的量是可能的。
(實(shí)施例3)用HPLC確認(rèn)糖化二肽的釋放把上述α-糖化六肽溶解于水中以制備5 mM溶液。加入0.01mL蛋白酶溶液(木瓜蛋白酶(由Roche生產(chǎn))、無花果蛋白酶(由Sigma-Aldrich Corporation生產(chǎn))或分散酶(由Roche生產(chǎn)))和0.09mL緩沖液(0.1M)并與0.1mL每一種上述溶液混合。這樣，進(jìn)行蛋白酶處理。將上述混合物在37℃反應(yīng)60分鐘。隨后，將每一處理的溶液適當(dāng)濃縮并稀釋，然后進(jìn)行HPLC測定。為了進(jìn)行HPLC(反相高效液相色譜法)，使用CAPCEL-PAK C-18(由Shiseido Co.，Ltd.生產(chǎn))。將所得物用0.1％TFA(三氟乙酸)/水至0.1％TFA/30％乙腈作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用α-糖化二肽(果糖基Val-His)。作為結(jié)果，確認(rèn)通過用處理溶液中的每一種蛋白酶(木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或分散酶)處理，α-糖化二肽(果糖基Val-His)已經(jīng)被釋放出來。
(實(shí)施例4)用蛋白酶和氧化酶測定糖化六肽的量通過下面的試驗(yàn)，確定是否能夠用實(shí)施例1和2中篩選的蛋白酶和果糖基肽氧化酶測定糖化六肽的量。
<蛋白酶反應(yīng)>
1.8mMα-糖化六肽3U/ml木瓜蛋白酶(由Roche生產(chǎn))8μl水(至總體積24μl)用于反應(yīng)的上述α-糖化六肽的量分別為0、1、2、3、4、5、6和7μl樣本。加入8μl木瓜蛋白酶和水至總體積為24μl。讓溶液在37℃反應(yīng)10分鐘，在90℃進(jìn)行熱處理5分鐘，然后進(jìn)行離心，由此獲得作為蛋白酶反應(yīng)樣本的上清液。此外，用蒸餾水代替底物進(jìn)行類似的程序，由此制備空白樣本。
<用于測定蛋白酶反應(yīng)樣本中糖化二肽的反應(yīng)的溶液>
100mM磷酸鉀緩沖液pH 8.045mM 4AA0.5mM TOOS1U/mlPOD(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))0.1U/ml果糖基肽氧化酶，F(xiàn)POX-C(由KIKKOMANCORPORATION生產(chǎn))把145μl用于測定上述糖化二肽的反應(yīng)的溶液分配到微量滴定板的孔中。將5μl上述蛋白酶反應(yīng)樣本加到每一孔中。充分混合后，將所得物在555nm(A0)進(jìn)行測定。隨后，在30℃溫育20分鐘，繼之在555nm(A1)進(jìn)行測定。此外，用空白樣本代替蛋白酶反應(yīng)樣本進(jìn)行類似的程序，由此獲得A0空白和A1空白。當(dāng)將蛋白酶對α-糖化六肽的作用用吸收度變化表示時(shí)，獲得下式。
ΔA＝(A1-A0)-(A1空白-A0空白)

圖1顯示在每一濃度α-糖化六肽的量的測定結(jié)果。如圖1所示，在ΔA與α-糖化六肽的濃度之間存在線性關(guān)系。具體說來，表明通過上述蛋白酶處理切除α-糖化二肽，能夠以高度精確的方式在短時(shí)間內(nèi)測定α-糖化六肽的量。
如上所述，表明關(guān)于已知通過對HbA1c進(jìn)行內(nèi)切蛋白酶Glu-C處理獲得的α-糖化六肽，通過對α-糖化六肽進(jìn)行本發(fā)明蛋白酶處理而不用進(jìn)行毛細(xì)電泳或質(zhì)譜法分析，使酶促更方便的HbA1c測定成為可能。
(實(shí)施例5)通過用Glu-C和中性蛋白酶處理HbA1c來制備α-糖化二肽通過下面的試驗(yàn)證明通過使Glu-C和中性蛋白酶作用于HbA1c是否能夠產(chǎn)生α-糖化二肽。
<蛋白酶反應(yīng)>
14.4％HbA1c溶液(由KYOWA MEDEX CO.，LTD.生產(chǎn))44μl0.5mg/ml Glu-C(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn))36μl150Mm乙酸銨(pH 4.0)8μl將混合的溶液在37℃溫育過夜。隨后，把352μl中性蛋白酶(2.4U/ml分散酶；由Roche生產(chǎn))加到溶液中，然后將溶液攪拌。而且，將溶液在37℃溫育過夜。然后將溶液在92℃加熱處理5分鐘，之后以12,000rpm離心5分鐘，由此獲得作為樣本的上清液。此外，用蒸餾水代替Glu-C或分散酶進(jìn)行類似的程序，由此制備空白樣本。
<測定蛋白酶反應(yīng)樣本中所含α-糖化二肽的反應(yīng)>
如下制備用于測定反應(yīng)的溶液。另外，使用R1中的FAOX和過氧化氫酶以除去摻雜在樣本中的糖化氨基酸。
R150mM POPSO緩沖液(pH 7.5)(由DOJINDO LABORATORIES生產(chǎn))
5U/ml FAOX(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))300U/ml過氧化氫酶(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))R2100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)由Nacalai Tesque，Inc.生產(chǎn))0.1mM DA-64(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生產(chǎn))10mM Ca-EDTA(由DOJINDO LABORATORIES生產(chǎn))150U/ml POD(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))0.15％NaN3(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生產(chǎn))40U/ml果糖基肽氧化酶，F(xiàn)POX-E(由KIKKOMANCORPORATION生產(chǎn))把216μl R1加到30μl樣本中。反應(yīng)5分鐘后，加入80μl R2并與溶液混合。讓溶液在37℃反應(yīng)5分鐘。用Hitachi自動(dòng)分析儀(型號7070)測定在750 nm的增加的吸收度(ΔAbs)(與R2反應(yīng)前和反應(yīng)后測定的吸收度之間的差別)。這樣，增加的吸收度發(fā)現(xiàn)為0.007。相反，在空白樣本的情況下ΔAbs為0。此外，甚至當(dāng)將FPOX-C(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))用作果糖基肽氧化酶時(shí)也獲得類似的結(jié)果。
因此，證明通過用Glu-C和中性蛋白酶處理HbA1c能夠產(chǎn)生α-糖化二肽。同時(shí)還證明用FPOX-E和-C能夠測定產(chǎn)生的α-糖化二肽的量。
(實(shí)施例6)通過用中性蛋白酶處理HbA1c來制備α-糖化二肽使Glu-C和中性蛋白酶作用于實(shí)施例5中的HbA1c。在本實(shí)施例中，用下面的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)通過使中性蛋白酶單獨(dú)作用于HbA1c是否能夠產(chǎn)生α-糖化二肽。
<蛋白酶反應(yīng)>
14.4％HbA1c溶液(由KYOWA MEDEX CO.，LTD.生產(chǎn))88μl2.4U/ml中性蛋白酶(分散酶；由Roche生產(chǎn))352μl將混合的溶液在37℃溫育過夜。然后將溶液在92℃加熱處理5分鐘，然后以12,000rpm離心5分鐘，由此獲得作為樣本的上清(此中所用HbA1c的量是實(shí)施例5中所用量的2倍)。此外，用蒸餾水代替中性蛋白酶進(jìn)行類似的試驗(yàn)，由此制備空白樣本。
<測定蛋白酶反應(yīng)樣本中所含α-糖化二肽的反應(yīng)>
此中所用R1和R2與實(shí)施例5中所用相同。
把216μl R1加到30μl樣本中。處理5分鐘后，加入80μl R2并與溶液混合。讓溶液在37℃反應(yīng)5分鐘。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在750nm測定的增加的吸收度(ΔAbs)(與R2反應(yīng)前和反應(yīng)后所測定的吸收度之間的差別)為0.007。相反，在空白樣本的情況下ΔAbs為0。該蛋白酶處理中所用HbA1c的量是實(shí)施例5中所用量的2倍。然而，觀察到ΔAbs(＝0.007)與實(shí)施例5中的ΔAbs相等。而且，甚至當(dāng)FPOX-C(由KIKKOMAN CORPORATION生產(chǎn))被用作果糖基肽氧化酶時(shí)也觀察到類似的結(jié)果。因此，證明通過單獨(dú)使用中性蛋白酶處理HbA1c能夠產(chǎn)生α-糖化二肽。同時(shí)還證明用FPOX-E和-C能夠探測產(chǎn)生的α-糖化二肽。
(實(shí)施例7)用FPOX測定HbA1c的量把HbA1c對照(用于測定因子HbA1c的量的校準(zhǔn)物；由KYOWAMEDEX CO.，LTD.生產(chǎn))溶解于標(biāo)本(specimen)(由KYOWAMEDEX CO.，LTD.生產(chǎn))的稀釋的溶液中。制備不同濃度(0.0％、4.1％、7.8％、11.3％和14.4％)的五種HbA1c溶液。用這些溶液進(jìn)行下面的步驟。
<蛋白酶反應(yīng)>
每一HbA1c溶液44μl2.4U/ml中性蛋白酶(分散酶；由Roche生產(chǎn))176μl把混合的溶液在37℃溫育過夜。將溶液在92℃熱處理5分鐘，然后以12,000 rpm離心5分鐘，由此獲得作為樣本的上清液。此外，用蒸餾水代替中性蛋白酶進(jìn)行類似的步驟，由此制備空白樣本。
<測定蛋白酶反應(yīng)樣本中所含α-糖化二肽的反應(yīng)>
此中所用R1和R2與實(shí)施例5中所用相同。
把216μl R1加到30μl每一樣本中。處理5分鐘后，加入80μl R2并與溶液混合。讓該溶液在37℃反應(yīng)5分鐘。作為結(jié)果，在750nm測定增加的吸收度(ΔAbs)(與R2反應(yīng)前和反應(yīng)后所測定的吸收度之間的差別)。圖2顯示HbA1c的濃度與通過該方法獲得的ΔAbs之間的關(guān)系。圖2顯示HbA1c濃度與產(chǎn)生的過氧化氫的量之間存在相關(guān)性。另外，在空白樣本中通過類似步驟獲得的ΔAbs總是0，在空白樣本中是將蒸餾水代替中性蛋白酶加到不同濃度的HbA1c溶液中。
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工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明，提供了制備α-糖化二肽的方法，所述方法能夠簡單、快速且高效地由糖化蛋白或糖化肽制備α-糖化二肽。而且，按照本發(fā)明，提供了測定α-糖化二肽的量的方法，所述方法能夠以高度精確的方式在短時(shí)間內(nèi)測定α-糖化二肽的量。這樣的測定方法在N-末端糖化肽、蛋白、蛋白亞單位等例如HbA1 c的量的測定方面是特別有效的。
附圖的簡要描述圖1顯示了測定α-糖化六肽的量的結(jié)果。
圖2顯示了測定HbA1c的量的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.制備α-糖化二肽的方法，所述方法包括使蛋白酶作用于N-末端糖化肽或N-末端糖化蛋白。
2.權(quán)利要求1的制備α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化肽是果糖基Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu。
3.權(quán)利要求1的制備α-糖化二肽的方法，其中所述N-末端糖化蛋白是糖化血紅蛋白。
4.權(quán)利要求1、2或3的制備α-糖化二肽的方法，其中所述蛋白酶是一種或多種選自下列的蛋白酶由曲霉屬、芽孢桿菌屬、根霉屬、Tritirachium、葡糖球菌屬、鏈酶菌屬等微生物產(chǎn)生的蛋白酶，由動(dòng)物例如豬和牛產(chǎn)生的蛋白酶，以及由植物例如番木瓜屬、無花果和波蘿產(chǎn)生的蛋白酶。
5.權(quán)利要求1、2或3的制備α-糖化二肽的方法，其中所述蛋白酶是一種或多種選自下列的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶、鏈酶蛋白酶、分散酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰酶、Glu-C和組織蛋白酶。
6.權(quán)利要求1-5的制備α-糖化二肽的方法，其中所述α-糖化二肽是果糖基纈氨酰組氨酸。
7.測定α-糖化二肽的量的方法，所述方法包括使果糖基肽氧化酶作用于按照權(quán)利要求1-6的制備方法獲得的α-糖化二肽，然后測定產(chǎn)生的過氧化氫的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備α－糖化二肽的方法，其特征在于，使蛋白酶作用于N－末端糖化肽或N－末端糖化蛋白。本發(fā)明還涉及測定α－糖化二肽的方法，其特征在于，使果糖基肽氧化酶作用于通過上述方法獲得的α－糖化二肽，然后測定由此產(chǎn)生的過氧化氫的量。本發(fā)明提供的制備α－糖化二肽的方法，能夠簡單、快速且高效地由糖化蛋白或糖化肽制備α－糖化二肽。本發(fā)明提供的制備測定α－糖化二肽的方法，能夠以高度精確的方式在短時(shí)間內(nèi)定量測定α－糖化二肽。
文檔編號C12Q1/26GK1852987SQ200480027120
公開日2006年10月25日 申請日期2004年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者廣川浩三, 黑澤惠子, 梶山直樹 申請人:龜甲萬株式會(huì)社