專利名稱：一種己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
一種己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法，用于對動物性食品中己烯雌酚含量的檢測。屬于酶聯(lián)免疫分析技術領域。
背景技術：
己烯雄酚(Diethylstilbestrol)是一種人工合成激素類藥物，臨床可應用于更年期綜合癥的治療。近年來“食補”保健品替代藥物漸成趨勢，愈來愈為更多的人所接受，在家禽、家畜的喂料中添加某些藥物以期在其卵和肉中含有這些微量藥物，從而實現(xiàn)以食代藥。
對己烯雌酚和其它一些甾類激素在牛肉及動物血液中含量的測定和儀器分析方法已有文獻報導，而雞蛋中己烯雌酚的測定鮮有報導。研制己烯雌酚的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，對己烯雌酚殘留進行檢測具有重要的經(jīng)濟和社會意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種靈敏度高、結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶方便的己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種樣品前處理簡單，而且簡便、快速、靈敏、準確、廉價的利用本試劑盒檢測己烯雌酚殘留的檢測方法。
本發(fā)明試劑盒主要由盒體(1)，酶標板(2)，A試劑瓶(標準液，為己烯雌酚水溶液，包括A1，A2，A3，A4，A5，A6共六瓶)(3)，B試劑瓶(己烯雌酚過氧化物酶標記物濃縮液)(4)，C試劑瓶(己烯雌酚抗體濃縮液)(5)，D試劑瓶(底物發(fā)色劑，10ml四甲基聯(lián)苯胺)(6)，E試劑瓶(反應停止液，14ml 1M硫酸)(7)，F(xiàn)試劑瓶(緩沖液，25ml，酶標記及抗體濃縮液稀釋用)(8)，海綿托架(9)所組成，海綿托架(9)上制有孔和凹槽，上述A、B、C、D、E、F試劑瓶安放在海綿托架的孔和凹槽內，海綿托架(9)和酶標板(2)安放在盒體(1)內。
酶標板(2)有96個標準檢測微孔，12條×8孔，每個檢測孔均包被有兔IgG抗體。
A試劑瓶(3)，包括A1、A2、A3、A4、A5、A6共6瓶己烯雌酚水溶液標準液，300ul/瓶，分別為0ppt、100ppt、300ppt、900ppt、2700ppt、8100ppt。
用本試劑盒檢測己烯雌酚的方法是應用抗原抗體反應。酶標板微孔包被有針對兔IgG(Diethylstilbestrol抗體)的羊抗體。Diethylstilbestrol抗體被加入，經(jīng)過孵育及洗滌步驟后，加入Diethylstilbestrol酶標記物，標準或樣品溶液。Diethylstilbestrol與Diethylstilbestrol酶標記物競爭Diethylstilbestrol抗體，沒有連接的Diethylstilbestrol酶標記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(過氧化氫尿素)和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺)加入到孔中并且孵育。結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色的產(chǎn)物。加入反應停止液后使顏色由藍轉變?yōu)辄S色。在450nm處測量，吸收光強度與樣品中的Diethylstilbestrol濃度成反比。
樣品前處理1尿樣不用處理，取20ul清亮尿樣直接測定(如果尿樣渾濁一定要過濾或離心直至得到清亮尿樣)2.1帶有低脂肪的肝，肉，或組織……5g粉碎的樣品與25ml 50mM HCL混合，振蕩15小時，以達到均質的目的。
……稱6g均質物(相當于1g肝臟)，加入離心瓶中，……離心15分鐘/4000g或更高的轉速，在10-15℃，……轉移上清液到另一個離心瓶中，加300ul 1MNaOH混合15分鐘，……加入4ml 500mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0，簡單的混合并在4℃保存至少1.5小時或過夜。
……離心15分鐘/4000g或更高的轉速，在10-15℃，分離全部上清液，使其升至室溫(20-24℃)，然后用柱純化2.2肉和組織……5g粉碎的樣品與25ml 50mM Tris緩沖液pH8.5混合，振蕩0.5小時，以達到均質的目的。
……加入15ml庚烷((n-heptane)振蕩5分鐘以溶去脂肪，……離心5分鐘/4000g或更高的轉速/10-15℃……用巴斯德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層……再用15ml庚烷((n-heptane)重復步驟2-4……向均質的肉液中加入0.5ml半濃的鹽酸，振蕩1小時……稱6g均質物(相當于1g肝臟)，加入離心瓶中，……以下從2.1的第一個離心步驟開始。像處理肝臟一樣繼續(xù)進行處理，
柱純化以下列方式所有試劑和樣品處理必須在室溫條件下(20-24℃)并嚴格控制過柱時的流速。
……用3ml甲醇(100％)洗滌柱子，流速為1滴/每秒……用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0)……樣品進柱(肝，肉，或組織的全部上清液)……用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0)……用正壓去除殘留的流體并且用空氣或氮氣吹2分鐘干燥柱子……用1ml甲醇(100％)洗脫樣品。流速為15滴/分鐘……在50-60℃并且在弱空氣或氮氣流下完全蒸發(fā)溶劑……用1ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，取20ul進行分析樣品的保存……未處理的樣品冷凍保存……HCL均質后的樣品在2-8℃穩(wěn)定3天……以磷酸二氫鉀緩沖液提取后的樣品(RIDAC18柱純化之前)在2-8℃穩(wěn)定2天，使用前離心……柱純化步步驟6所獲得的甲醇洗脫物可以冷凍保存數(shù)周，在2-8℃穩(wěn)定2周……用蒸餾水溶解的干燥殘留物(步驟8)在2-8℃穩(wěn)定1周3牛眼……冷凍樣品(-20℃)……解凍樣品(破壞細胞)并且小心的切割眼球，在兩邊切破視網(wǎng)膜……收留解凍液滴(約0.5ml)……用蒸餾水1∶1稀釋(一份蒸餾水加—份解凍液)，取20ul測定保存解凍液應該立即冷凍保存，4周內可以繼續(xù)使用酶標免疫檢測1測定之前注意事項1)使用之前將所有試劑回升至室溫20-24℃。
2)使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3)在使用中不要讓微孔干燥4)在EIA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的冼板順序操作是EIA測定程序中的要點。
5)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。
2 Diethylstilbestrol酶標記物提供的Diethylstilbestrol酶標記物(B試劑瓶)為濃縮液，由于稀釋的酶標記物穩(wěn)定性不好，所以只稀釋實際需用量的酶標記物。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，用緩沖液以1∶10的比例稀釋酶標記物濃縮液。
3 Diethylstilbestrol抗體提供的Diethylstilbestrol抗體(C試劑瓶)為濃縮液，由于稀釋的Diethylstilbestrol抗體穩(wěn)定性不好，所以只稀釋實際需用量的Diethylstilbestrol抗體。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖。用緩沖液以1∶10的比例稀釋抗體濃縮液(400ul濃縮液斗4.0ml緩沖液，足夠4個微孔板條32孔用)4包被有抗體的微孔板條錫箔袋沿橫向邊壓皺外沿剪開。取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
5標準液提供的Diethylstilbestrol標準液濃度為標準液1(A1)…………0ppt(O)標準液2(A2)…………100ppt標準液3(A3)…………300ppt標準液4(A4)…………900ppt標準液5(A5)…………2700ppt標準液6(A6)…………8100ppt6測定程序(室溫20-24℃條件下操作)1)將足夠標準和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。
2)加入100ul稀釋后的抗體溶液到每個微孔中底部。在室溫孵育15分鐘。
3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩遍。
4)加入20ul的標準或處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行實驗。
5)加入100ul稀釋的酶標記物到微孔底部，室溫孵育30分鐘，
6)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩次。
7)加入100ul底物發(fā)色試劑(D試劑瓶)到微孔中，在室溫暗處孵育15分鐘。
8)加入100ul反應停止液(E試劑瓶)到微孔中混合好，用酶標儀在450nm處測量吸光度值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內讀取吸光度值。
結果所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準(0標準)的吸光度值再乘以100。因此0標準等于100％并且以百分比的形式給出吸光度值。
標準(或樣品)的吸光度值/0標準的吸光度值×100＝％吸光度值計算的標準值繪成為一個對應Diethylstilbestrol濃度(ng/kg)的半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000ng/kg(ppt)范圍內應當成為線性。相對應每一個樣品的濃度(ng/kg)可以從校正曲線上讀出。
為了獲得樣品中的Diethylstilbestrol的實際濃度(ng/kg)，從標準曲線上讀出的濃度值必須乘以相對應的稀釋系數(shù)。當樣品處理過程是按指示進行的，稀釋系數(shù)如下；尿液(沒有樣品處理)………………1組織…………………………………1牛眼…………………………………2靈敏度試劑盒的平均檢測下限約為100ng/kg，根據(jù)樣品處理記錄，尿液中的Diethylstilbestrol檢測下限為100ng/kg(100ppt)，組織中的檢測下限為100ng/kg(100ppt)，牛眼中的檢測下限為200ng/kg(200ppt)。
特異性試劑盒的特異性通過對相應的物質進行交叉反應性分析而得到。
再現(xiàn)性由獲得的標準吸收值的變異系數(shù)(％CV)對相應Diethylstilbestrol濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
回收率以尿液樣品為例，回收率為90％±12％。
本發(fā)明的優(yōu)點是該試劑盒是競爭酶標免疫法試劑盒，用于定量測定尿、肌肉、肝臟及牛眼中的己烯雌酚殘留。檢測前對于樣品的前處理簡單，利用本試劑盒檢測己烯雌酚殘留，是簡便、快速、靈敏、準確、廉價的檢測方法。最低檢測限為己烯雌酚0.1ppb。


圖1試劑盒的直觀示意2酶標板的直觀示意圖(重疊三層，僅畫出其中一層)
圖中盒體(1)，酶標板(2)，A試劑瓶(3)，B試劑瓶(4)，C試劑瓶(5)，D試劑瓶(6)，E試劑瓶(7)，F(xiàn)試劑瓶(8)，海綿托架(9)。
具體實施例方式
實施例11、按前述方法進行樣品處理。
2、試劑配制Diethylstilbestrol抗體稀釋溶液，(Diethylstilbestrol抗體濃縮液∶稀釋液＝1∶10)，Diethylstilbestrol過氧化物酶標記物稀釋溶液，(酶標記物濃縮液∶稀釋液＝1∶10)。
3、加抗體，室溫孵育加入100ul稀釋后的抗體溶液到每個微孔中底部。在室溫孵育15分鐘。
4、洗滌倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩遍。
5、加標準液或待測樣品加入20ul的標準或處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行實驗。
6、加酶標記物，孵育加入100ul稀釋的酶標記物到微孔底部，室溫孵育30分鐘。
7、洗滌倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩次。
8、加發(fā)色劑反應加入100ul底物發(fā)色試劑到微孔中，在室溫暗處孵育15分鐘。
9、終止加入100ul反應停止液到微孔中混合好。
10、測定用酶標儀在450nm處測量吸光度值以空氣為空白，必須在加入停止液后60分鐘內讀取吸光度值。
權利要求
1.一種己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征是由盒體(1)，酶標板(2)，A試劑瓶，標準液，為己烯雌酚水溶液，包括A1，A2，A3，A4，A5，A6共六瓶(3)，B試劑瓶，己烯雌酚過氧化物酶標記物濃縮液(4)，C試劑瓶，己烯雌酚抗體濃縮液(5)，D試劑瓶，底物發(fā)色劑，四甲基聯(lián)苯胺(6)，E試劑瓶，反應停止液，1M硫酸(7)，F(xiàn)試劑瓶，緩沖液，酶標記及抗體濃縮液稀釋用(8)，海綿托架(9)所組成，海綿托架(9)上制有孔和凹槽，上述A、B、C、D、E、F試劑瓶安放在海綿托架的孔和凹槽內，海綿托架(9)和酶標板(2)安放在盒體(1)內。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征是所述的酶標板(2)上檢測微孔均包被有IgG抗體。
3.一種己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測己烯雌酚的方法，先進行樣品處理，其特征是應用抗原抗體反應，酶標板微孔包被有兔IgG抗體，Diethylstilbestrol抗體被加入，經(jīng)過孵育及洗滌后，加入Diethylstilbestrol酶標記物，標準或樣品溶液，Diethylstilbestrol與Diethylstilbestrol酶標記物競爭Diethylstilbestrol抗體，沒有連接的Diethylstilbestrol酶標記物在洗滌步驟中被除去，發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺)加入到孔中并且孵育，結合的酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色的產(chǎn)物，加入反應停止液后使顏色由藍轉變?yōu)辄S色，在450nm處測量，吸收光強度與樣品中的Diethylstilbestrol濃度成反比。
4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征是Diethylstilbestrol酶標記物濃縮液的稀釋，只稀釋實際需用量的酶標記物，在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，用緩沖液10份稀釋1份酶標記物濃縮液的比例進行稀釋。
5.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征是Diethylstilbestrol抗體濃縮液的稀釋，只稀釋實際需用量的Diethylstilbestrol抗體。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖。用緩沖液10份稀釋1份抗體濃縮液的比例進行稀釋。
6.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征是加抗體室溫孵育為15分鐘，加酶標記物后，室溫孵育30分鐘，加底物發(fā)色劑后，室溫暗處孵育15分鐘。
7.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征是測定吸光度A450nm，以空氣為空白，在加入停止液后60分鐘內讀取光度值。
全文摘要
一種己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯(lián)免疫分析技術領域。本發(fā)明配制的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)競爭法檢測己烯雌酚。酶標板上包被兔IgG抗體，Diethylstilbestrol抗體加入后經(jīng)孵化、洗滌，加入樣品稀釋液及酶標抗原，使兩者反應，洗滌，加酶底物顯色，用酶標儀檢測A
文檔編號G01N33/74GK1456894SQ0313185
公開日2003年11月19日 申請日期2003年6月9日 優(yōu)先權日2003年6月9日
發(fā)明者胥傳來, 李相前, 王武康, 邵蔚藍, 徐保國, 賀鐵明, 胡擁明 申請人:江南大學