專利名稱：測量細胞外電勢的裝置、利用該裝置測量細胞外電勢的方法以及配有該裝置的快速篩選 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測量細胞外電勢的裝置，為了篩選藥物，利用該裝置簡單快速地對生物樣品(特別是細胞)的藥物篩選進行電生理學(xué)評估。本發(fā)明還涉及一種測定生物樣品(特別是細胞)的物理化學(xué)變化(特別是電化學(xué)變化)的方法、一種在該方法中所采用的反應(yīng)系統(tǒng)以及一種包括該反應(yīng)系統(tǒng)的裝置。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于評估由細胞所產(chǎn)生的電化學(xué)變化的方法和一種利用該方法的快速藥物篩選儀器，其中所述的電化學(xué)變化與整個細胞的常量活性有關(guān)(特別是，利用電壓變化作為指數(shù)來比較噪聲)。
背景技術(shù)：
業(yè)已利用細胞的電活性作為指數(shù)來進行藥物的篩選。通常，利用膜片鉗法(即一種采用熒光顏料或發(fā)光指示劑等的方法)來測量細胞的電活性。
在一種膜片鉗技術(shù)中，將一小部分細胞膜(膜片)固定在具有微電極探頭的微量吸移管的管尖部分上，并用來電記錄通過單個離子通道蛋白的離子轉(zhuǎn)運。這種膜片鉗技術(shù)是可用來實時探察單個蛋白質(zhì)的功能的許多細胞生物技術(shù)之一(參見例如，細胞的分子生物學(xué)，第三版，Garland Publishing，Inc.，New York，1994，Japanese Version，由Keiko Nakamura等人監(jiān)督的翻譯，pp.181-182，1995，Kyoikusha)。另外，有一種方法將響應(yīng)特定離子的濃度變化而發(fā)光的發(fā)光指示劑或熒光顏料結(jié)合到現(xiàn)代化的圖象處理方法中(例如，利用CCD攝象機等來拾取細胞的熒光圖象，以便監(jiān)測細胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運)，以便測量細胞的電活性。
在采用微電極探頭的方法例如膜片鉗(細胞內(nèi)的記錄方法)中，利用一種包括微電極探頭和專用的控制裝置的電生理學(xué)測量儀器來測量通過目標細胞的離子通道的電量，借此可測定該細胞的離子通道開或關(guān)的持續(xù)時間、計時或次數(shù)。這樣，可分析單個的離子通道。
在另一種采用熒光顏料的方法中，通過利用熒光測定方法分別測定進入細胞的離子總量來測定整個細胞的離子通道活性。
膜片鉗技術(shù)需要特殊的技術(shù)來實施微量吸移管的制備、操縱等和更多的時間來測定一個樣品。因此，膜片鉗技術(shù)不適合為了研究藥物而高速篩選大量的候補化合物。熒光測定技術(shù)為了研究藥物可高速篩選大量的候補化合物。
然而，熒光測定技術(shù)需要一個染色細胞的步驟。在測定過程中，顏料造成較高的背景噪聲并且熒光強度隨著時間而減小，從而導(dǎo)致較差的信號-噪聲比(S/N)。
JP No.2949845、USP No.5810725、USP No.5563067、日本待公開專利No.9-827318、WO01/25769A2、USP No.5187069、WO98/54294、WO99/66329、WO99/31503等公開了用于觀察生物樣品中的電化學(xué)變化的另一種技術(shù)，其中采用了配有多個電極的基片。
JP No.2949845、USP No.5810725、USP No.5563067和日本待公開專利No.9-827318公開了一種集成多電極和一種利用該多電極的測定系統(tǒng)，其中該集成多電極包括多個利用照相平版印刷術(shù)在玻璃基片上制備的并能夠測定細胞中的電變化的微電極。
WO01/25769A2公開了一種基片，其中絕緣基片配有多個通孔，將生物樣品例如含有離子通道的細胞放到通孔上，從而使吉咖封口配置在包含細胞的絕緣基片的表面上；可利用配置在由吉咖封口分開的兩個各自區(qū)域中的參比電極和測量電極來測量穿過細胞的離子通道的離子所產(chǎn)生的電流。
USP No.5187069公開了一種通過在電極上培養(yǎng)細胞并測量阻抗變化而監(jiān)測細胞生長的裝置。
WO98/54294公開了一種將細胞粘附到平面電極上并測量其中的電信號的裝置。
WO99/66329公開了一種通過測量電阻或者阻抗變化而觀察多孔材料上的細胞活性的裝置以及一種利用該裝置的分析方法。
WO99/31503公開了一種方法，在該方法中，采用一個配有多個通孔的基片，通過將細胞捕獲在通孔內(nèi)而建立膜片鉗，并且測量電流變化。
以上的常規(guī)技術(shù)的特征在于在平面電極上測量細胞的電活性，并將微小通孔配置在絕緣基片上，從而在細胞和基片之間形成膜片鉗，由此可監(jiān)測穿過離子通道的離子所產(chǎn)生的電流。然而，當采用平面電極時，從生物樣品發(fā)出的信號泄露到溶液中，從而不利地減小了測量的靈敏度。在該方法中，將小通孔配置在絕緣基片上，以便用細胞和孔形成膜片鉗，從而使形成膜片鉗的可能性降低了。而且，為了形成膜片鉗，細胞膜必須損壞或物理損傷，從而不可能測量完整細胞的活性。膜片鉗形成技術(shù)還具有調(diào)節(jié)生物樣品吸入壓力的困難。多個通道不實際地需要多個壓力調(diào)節(jié)機構(gòu)。在這些方面，常規(guī)的平面電極適合快速的藥物篩選但是靈敏度卻較差。具有小通孔的絕緣基片不適合快速的藥物篩選。由于類似的原因，自動化膜片鉗機器人需要更多的時間來處理樣品并且不適合快速的藥物篩選。
如上所述，在快速藥物篩選領(lǐng)域內(nèi)存在許多問題。
目前需要一種細胞外電勢的測量方法，利用該方法得到的數(shù)據(jù)與利用膜片鉗方法得到的數(shù)據(jù)具有基本上相同的質(zhì)量，而且該方法與熒光顏料法一樣可簡便、快速并自動化地實施。還需要一種能夠直接快速地監(jiān)測細胞活性而不用任何顏料的裝置和儀器。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是改進常規(guī)的電生理學(xué)測量裝置，以便解決上述問題。
本發(fā)明涉及一種測量細胞外電勢的裝置，該裝置包括至少一個配置在基片上的具有用于截留細胞的裝置的井、一個用于檢測每個至少一個井的電信號的測量電極，以及一個參比電極。
優(yōu)選的是，該細胞截留裝置包括至少一個配置在井內(nèi)的凹部，并且在其底表面上具有一個通孔，該通孔與用于吸入細胞的裝置相連。
優(yōu)選的是，將測量電極配置在一個空間內(nèi)，該空間通過通孔與井相通。
優(yōu)選的是，通過凹部的開口緊緊地截留細胞。
優(yōu)選的是，凹部的開口具有10-50μm的直徑，通孔具有大約2-10μm的直徑。
優(yōu)選的是，基片是由從以下物質(zhì)構(gòu)成的組合中選擇的一種材料制成的硅片、聚四氟乙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯。
優(yōu)選的是，基片是絕緣基片，并且該裝置還包括用于吸入細胞的裝置。
優(yōu)選的是，用于培養(yǎng)細胞的井是由從以下物質(zhì)構(gòu)成的組合中選擇的一種材料制成的硅氧烷、塑料、SiO2和橡膠。
優(yōu)選的是，參比電極是環(huán)形的。
優(yōu)選的是，參比電極是由導(dǎo)電材料制成的。
優(yōu)選的是，絕緣基片包括一個具有6μm直徑的通孔。
優(yōu)選的是，絕緣基片包括一個支持層，該支持層是具有至少10μm厚度的SOI基片。
優(yōu)選的是，支持層選自由以下物質(zhì)構(gòu)成的組合硅、塑料、SiO2和橡膠。
優(yōu)選的是，支持層具有1μm或以上的厚度。
優(yōu)選的是，細胞吸入裝置是由硅氧烷、塑料、SiO2和橡膠制成的并且細胞吸入部分的厚度在10μm或以上。
優(yōu)選的是，處理凹部的內(nèi)壁以變成親水性的。
一方面，本發(fā)明涉及一種測量細胞外電勢的方法。該方法包括以下步驟配備一種用于測量生物樣品的電特性的反應(yīng)系統(tǒng)，然后將所述完整細胞置于反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)并檢測所述細胞的電特性。該反應(yīng)系統(tǒng)可以是一種細胞外電勢的測量裝置，該裝置包括至少一個配置在基片上的具有用于截留細胞的裝置的井、一個用于檢測每個至少一個井的電信號的測量電極，以及一個參比電極。
優(yōu)選的是，該電特性檢測步驟包括至少兩次檢測所述細胞的電特性，并且將所檢測的電特性的至少兩個值進行比較。
優(yōu)選的是，配有測量電極的區(qū)域電容小于配有參比電極的區(qū)域電容。
優(yōu)選的是，參比電極的表面積小于測量電極的表面積。
優(yōu)選的是，測量電極的阻抗低于參比電極的阻抗。
優(yōu)選的是，在10Hz-10kHz的測量電極的阻抗小于在10Hz-10kHz的參比電極的阻抗。
優(yōu)選的是，基片是絕緣基片；細胞截留裝置是一個浸在電解質(zhì)中的通孔；當將所述的細胞置于通孔上時，將參比電極放置在具有所述的細胞的絕緣基片的第一側(cè)面附近，而將測量電極放置在與第一側(cè)面相反的絕緣基片的第二側(cè)面上，并且浸漬參比電極的電解質(zhì)的量不同于浸漬測量電極的電解質(zhì)的量。
優(yōu)選的是，浸漬參比電極的電解質(zhì)的量是浸漬測量電極的電解質(zhì)的量的5倍或者更多。
優(yōu)選的是，基片是絕緣基片；細胞截留裝置是一個置于絕緣基片上的通孔；當將所述的細胞置于通孔上時，將參比電極放置在具有所述的細胞的絕緣基片的第一側(cè)面附近，而將測量電極放置在與第一側(cè)面相反的絕緣基片的第二側(cè)面上，并且參比電極的電極面積不同于測量電極的電極面積。
優(yōu)選的是，參比電極的電極面積是測量電極的電極面積的1/5或者更少。
優(yōu)選的是，基片是絕緣基片；細胞截留裝置是一個置于絕緣基片上的通孔；當將所述的細胞置于通孔上時，將參比電極放置在具有所述的細胞的絕緣基片的第一側(cè)面附近，而將測量電極放置在與第一側(cè)面相反的絕緣基片的第二側(cè)面上，并且參比電極的阻抗不同于測量電極的阻抗。
優(yōu)選的是，參比電極的阻抗是測量電極的阻抗的5倍或者更多。
優(yōu)選的是，參比電極與所述細其特征在于參比電極與所述細胞的距離大于測量電極與所述細胞的距離。
優(yōu)選的是，在所述的細胞外電勢的測量裝置中，參比電極的面積與測量電極的面積之比為1∶5，而參比電極的阻抗與測量電極的阻抗之比為5∶1，或者浸漬參比電極的電解質(zhì)體積與浸漬測量電極的電解質(zhì)體積之比為5∶1。
優(yōu)選的是，細胞外電勢是與細胞的離子通道或受體活性相關(guān)的信號，或者是與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的作用相關(guān)的信號。
優(yōu)選的是，在具有對所述細胞具有已知作用的標準化學(xué)物質(zhì)的情況下以及在具有目標化學(xué)物質(zhì)的情況下實施電特性檢測步驟，并且所述方法還包括以下步驟將在具有標準化學(xué)物質(zhì)的情況下和在具有目標化學(xué)物質(zhì)的情況下所得到的電特性進行比較，并檢定目標化學(xué)物質(zhì)對生物樣品的作用。
優(yōu)選的是，所述細胞的放置步驟包括將測量溶液引入到井內(nèi)，從而在井和與井相對的通孔開口之間產(chǎn)生一個壓力差，該通孔與井之間是相通的，并且使壓力差的大小在1/10或以下。
優(yōu)選的是，通過減小通過該開口的壓力而產(chǎn)生壓力差。
優(yōu)選的是，通過將壓力施加到井上而產(chǎn)生壓力差。
優(yōu)選的是，通過減小通過該開口的壓力并將該壓力施加到井上而產(chǎn)生壓力差。
優(yōu)選的是，壓力差在0.01-0.5atm之間。
一方面，本發(fā)明涉及一種快速的藥物篩選儀器，該儀器包括上述的細胞外電勢的測量裝置、與細胞外電勢測量裝置的測量電極相連的電信號檢測部分以及用于處理信號的裝置，其中信號處理裝置處理大量的來自電信號檢測部分的電信號并顯示細胞的活性狀態(tài)。
優(yōu)選的是，這種快速的藥物篩選儀器還可包括用于注射或排放目標藥物溶液的裝置和用于傳遞細胞外電勢測量裝置的設(shè)備。
優(yōu)選的是，檢測感興趣生物樣品的電特性的步驟包括(a)將由所述生物樣品發(fā)出的物理化學(xué)信號記錄為時序信號值，(b)采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)，并計算每一組的標準偏差，(c)計算每一個標準偏差的平均值，以及(d)基于標準偏差的平均值檢測所述的細胞的電特性變化。
優(yōu)選的是，檢測所述細胞的電特性的步驟包括(a)將由所述的細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值，(b)采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)，并計算每一組的標準偏差，(c)將這些標準偏差分成將預(yù)定大小的標準偏差作為一個單位的許多類，并獲得一個分布曲線，該曲線指示出屬于這些類的許多組提取數(shù)據(jù)的電特性，(d)使該分布曲線接近于正常的分布曲線，(e)計算所得到的正常分布曲線的平均值和半寬度，(f)任意地重復(fù)(b)-(e)的步驟，以及(f)基于該平均值和半寬度檢測所述的細胞的電特性變化。
優(yōu)選的是，重復(fù)(b)-(e)的步驟并且在每次重復(fù)中改變要采集的時序信號值的數(shù)目。
優(yōu)選的是，在步驟(b)之前，該方法還包括將由許多配置在反應(yīng)系統(tǒng)中的所述細胞發(fā)出的時序信號值相加。
優(yōu)選的是，在步驟(a)之前，該方法還包括同時刺激許多所述的細胞。
優(yōu)選的是，檢測所述細胞的電特性的步驟包括(a)將由所述的細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值；(b)采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)，并計算每一組的標準偏差；(c)將這些標準偏差分成將預(yù)定大小的標準偏差作為一個單位的許多類，并獲得一個分布曲線，該曲線指示出屬于這些類的許多組提取數(shù)據(jù)的電特性；(d)利用從由以下分析構(gòu)成的組合中選擇的曲線逼近分析接近該分布曲線指數(shù)減小分析、指數(shù)增大分析、高斯分布、洛倫茲分布、δ分析、多個峰的分析和非線性分析；以及(e)基于由步驟(d)得到的近似曲線上的峰前后的梯度檢測生物樣品的電特性變化。
可以時序方式或隨機地完成步驟(b)中的采集。
優(yōu)選的是，步驟(b)中的采集可由時序方式中的初始數(shù)據(jù)a來完成許多次以及由在時序方式中的初始數(shù)據(jù)a之后的預(yù)定時間記錄的數(shù)據(jù)b來完成許多次。
優(yōu)選的是，步驟(b)中的采集可由時序方式中的初始數(shù)據(jù)a來完成許多次以及由在時序方式中的初始數(shù)據(jù)a之后的預(yù)定時間記錄的數(shù)據(jù)b來完成許多次。
優(yōu)選的是，檢測所述細胞的電特性變化的步驟包括(a)將由所述的細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值；(b)采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)，并計算每一組的標準偏差；(c)采集所獲得的標準偏差以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)，并計算每一組提取標準偏差的平均值，以及(e)當該平均值達到一個預(yù)定臨界值時，基于時序信號出現(xiàn)的時間得到一個檢測所述細胞的電特性變化的指數(shù)值。
電信號可以是與細胞的離子通道或受體的活性有關(guān)的信號，或者是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的作用。
一方面，本發(fā)明涉及一種測量目標化學(xué)物質(zhì)對所述細胞的作用的裝置，該裝置包括一個用于測量所述細胞的電特性的反應(yīng)系統(tǒng)、用于將由所述細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值的裝置、用于采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)并計算每一組標準偏差的裝置、用于計算每一個標準偏差的平均值的裝置，以及基于每一個標準偏差的平均值用于檢測所述細胞的電特性變化的裝置。
一方面，本發(fā)明涉及一種測量目標化學(xué)物質(zhì)對所述細胞的作用的裝置，該裝置包括一個用于測量所述細胞的電特性的反應(yīng)系統(tǒng)、用于將由所述細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值的裝置、用于采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)并計算每一組標準偏差的裝置、用于將這些標準偏差分成將預(yù)定大小的標準偏差作為一個單位的許多類并獲得一個分布曲線(該曲線指示出屬于這些類的許多組提取數(shù)據(jù)的電特性)的裝置、用于使該分布曲線接近于正常分布曲線的裝置、用于計算所得到的正常分布曲線的平均值和半寬度的裝置，以及基于該平均值和半寬度用于檢測所述細胞的電特性變化的裝置。
一方面，本發(fā)明涉及一種測量目標化學(xué)物質(zhì)對所述細胞的作用的裝置，該裝置包括一個用于測量所述細胞的電特性的反應(yīng)系統(tǒng)、用于將由所述細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值的裝置、用于采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)并計算每一組標準偏差的裝置、用于將這些標準偏差分成將預(yù)定大小的標準偏差作為一個單位的許多類并獲得一個分布曲線(該曲線指示出屬于這些類的許多組提取數(shù)據(jù)的電特性)的裝置、利用從由以下分析構(gòu)成的組合中選擇的曲線逼近分析接近該分布曲線的裝置指數(shù)減小分析、指數(shù)增大分析、高斯分布、洛倫茲分布、δ分析、多個峰的分析和非線性分析，以及基于所得到的近似曲線上的峰前后的梯度用于檢測所述細胞的電特性變化的裝置。
一方面，本發(fā)明涉及一種測量目標化學(xué)物質(zhì)對所述細胞的作用的裝置，該裝置包括一個用于測量所述細胞的電特性的反應(yīng)系統(tǒng)、用于將由所述細胞發(fā)出的電信號記錄為時序信號值的裝置、用于采集時序信號值以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取數(shù)據(jù)并計算每一組標準偏差的裝置、用于采集所獲得的標準偏差以便得到許多組由大量值構(gòu)成的提取標準偏差并計算每一組提取標準偏差的平均值的裝置，以及當該平均值達到一個預(yù)定臨界值時，基于時序信號出現(xiàn)的時間用于獲得一個檢測所述細胞的電特性變化的指數(shù)值的裝置。
附圖簡述

圖1示出了按照本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的一個井結(jié)構(gòu)，將它與采用常規(guī)微電極的裝置的井進行比較。(A)示出了本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的井結(jié)構(gòu)。(B)示出了采用常規(guī)微型平面電極的裝置的井。
圖2示出了用于制備按照本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的示范性方法。
圖3是配置在本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的基片上的凹部和通孔的電子微型圖。
圖4粗略地示出了本發(fā)明的細胞外電勢的測量裝置。
圖5示出了本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的變型實例。
圖6粗略地示出了按照本發(fā)明的快速藥物篩選儀器。
圖7粗略地示出了本發(fā)明的快速藥物篩選儀器的檢測部分。
圖8示出了利用本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置進行實驗的結(jié)果。
圖9示出了利用本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置進行實驗的結(jié)果。
注意，圖1-9中所示的數(shù)字標號分別代表以下部件。
1基片；2井；3凹部；5通孔開口；7通孔；8電線；9測量電極；10，13，33SiO2層；11，12 Si層；15 Al層；20環(huán)形參比電極；22井的側(cè)壁；24電線；29測量電極；31，32保護膜。
圖10粗略地示出了本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的一個變型實例。
圖11粗略地示出了本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的另一個變型實例。
圖12粗略地示出了本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的另一個變型實例。
圖13粗略地示出了按照本發(fā)明的一種裝置。
圖14粗略地示出了按照本發(fā)明的另一種裝置。
圖15粗略地示出了按照本發(fā)明的另一種裝置。
圖16粗略地示出了按照本發(fā)明的另一種裝置。
圖17示出了由本發(fā)明的裝置測量的椎實螺(Lymnaea Stagnalis)神經(jīng)原與碳酰膽堿(Carbachol)的依賴于濃度的反應(yīng)。
圖18示出了由本發(fā)明的裝置測量的、在向其中施加碳酰膽堿前后的椎實螺屬神經(jīng)原的測量結(jié)果。
圖19示出了利用常規(guī)的細胞內(nèi)方法測量的、在向其中施加碳酰膽堿前后椎實螺屬神經(jīng)原的測量結(jié)果。
圖20示出了一種按照本發(fā)明對藥物的效果進行分類的方法。
注意，圖10-20中所示的數(shù)字標號分別代表以下部件。
51，60基片；52SOI基片；53井；54測量電極；55培養(yǎng)基；56凹部；57通孔；58參比電極；62 Si層；63 SiO2層；64支持基片；69細胞；81與吸入線相通的空間；85吸入線裝置；87細胞的吸入線；101信號源；102單位偏差計算部分；103正常分布近似部分；104觸發(fā)信號生成部分；105平均值計算部分；106平均值/半寬計算部分；107信號相加部分；108活性計算部分；109活性分類部分；110數(shù)據(jù)顯示部分；111樣品分類部分。
具體實施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人利用微量切削加工技術(shù)在多滴定板(96、384、1536個井)的每個井的底面上形成許多微小凹部，這通常用于快速藥物篩選方法。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將細胞截留在凹部內(nèi)，可獲得與常規(guī)的膜片鉗方法得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量接近的數(shù)據(jù)。本發(fā)明就是如此獲得的。
本發(fā)明解決了已有技術(shù)領(lǐng)域中的上述問題。本發(fā)明提供了一種包括一個傳感器基片的細胞外電勢的測量裝置，該基片能夠簡便和高度可靠地檢測由生物樣品發(fā)出的利用常規(guī)的細胞外記錄方法檢測不到的微小電信號，本發(fā)明還提供了一種利用該裝置的測量生物樣品的電化學(xué)變化的方法和儀器。本發(fā)明的一個目的是提供一種用于測量整個細胞的常量通道活性(即由細胞產(chǎn)生的物理化學(xué)變化)的方法和一種采用該方法的快速藥物篩選方法，該測量方法包括利用一個簡單的傳感器基片而不特別需要專門的控制裝置，由此通過將細胞放在室內(nèi)的井上而無需在絕緣基片上形成吉咖封口(gigaseal)，就可容易地在短時間內(nèi)測量細胞，并且由于不用化合物，因此不必考慮熒光靈敏度的長期副作用或變化。
圖1(A)示意性地示出了按照本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的一個井結(jié)構(gòu)。井2含有培養(yǎng)基。在圖1(A)的中部用橢圓形表示的目標細胞被基片1上配置的細胞截留裝置所捕獲或截留。該細胞截留裝置包括在基片1上形成的凹部3，以及通過開口5與凹部3相通的通孔7。
在圖1(A)中，將作為傳感器裝置的測量電極9放置在與細胞相反的通孔7的那一面上。測量電極9通過電線8與信號檢測部分相連。通孔7構(gòu)成與吸入裝置(例如真空泵)相通的吸入部的一部分并與細胞吸入裝置(未示出)相連。細胞吸入裝置牢牢地捕獲并吸入由凹部3和基片1所截留的細胞的細胞膜，從而避免通過凹部3內(nèi)的細胞膜獲得的電信號泄露到井內(nèi)的培養(yǎng)基中(如圖1(A)的箭頭所示)。
在圖1(A)中，將一部分細胞配合到凹部3的開口內(nèi)。細胞膜與基片1之間的緊密度形成了對測量細胞外電勢的有效電密封，從而改進了所檢測的電信號的質(zhì)量。
在本發(fā)明中，一種分析系統(tǒng)包括配有參比電極的第一區(qū)域、作為完整細胞的第二區(qū)域以及配有測量電極的第三區(qū)域。利用該分析系統(tǒng)測量完整細胞的細胞膜電勢或者完整細胞中發(fā)生的細胞膜電勢的變化，將其作為由于細胞外電勢的變化而導(dǎo)致的電壓變化。
為了進行比較，圖1(B)示意性地示出了當利用常規(guī)的平面微電極測量細胞外電勢的情況。在這種情況中，由細胞發(fā)出的大部分電信號泄露到培養(yǎng)基內(nèi)，由此導(dǎo)致信號檢測的靈敏度明顯降低。
圖1(A)所示的井配有參比電極10。利用測量電極9參照參比電極10的參比電勢來測量細胞的電信號。通常，參比電極10是一根其截面直徑為大約100μm-大約1000μm并且由諸如金、鉑和銀-氯化銀這些材料制成的電線。參比電極10可以具有任何尺寸和形狀(正如所需的那樣)。而且，每個井內(nèi)可配有一個或多個參比電極10(正如所需的那樣)，由此可改善細胞外電勢的測量精度。
利用常規(guī)的微量切削加工技術(shù)制備包括如上所述的一個或多個井的測量細胞活性的裝置。圖2示出了一個示范性制備工藝過程。
開始，對包括兩個Si層11和12(夾有SiO2層10)的SOI層20的相反兩面進行熱氧化，以形成SiO2層13和14。其后，在SiO2層13的表面上，通過沉積形成Al層15并且用保護膜31(抗光蝕劑PR)覆蓋Al層15。然后，利用照相平版印刷術(shù)將保護膜31加工成圖案，然后利用保護膜31作為將Al層15加工成圖案的掩模(圖1(a))。
其次，用保護膜32覆蓋在基片的后表面上形成的SiO2層14，然后利用照相平版印刷術(shù)將保護膜32加工成圖案，并利用保護膜32作為除去SiO2層14而留下其中一部分的掩模(圖2(b))。在除去保護膜31和32之后，利用SiO2層14作為利用氫氧化四甲基銨鹽(TMAH)對基片后表面上的Si層12進行濕蝕刻的掩模(圖2(c))。另外，利用反應(yīng)離子蝕刻法(RIE)對基片前表面上的SiO2層14和Si層11進行干蝕刻，其中利用Al層15作為掩模(圖2(d))。其次，在從基片的前表面上除去Al層15之后(圖2(e))，通過利用前表面的RIE進行干蝕刻，而對基片20中間的SiO2層10進行蝕刻，其中利用Si層11作為掩模，從而形成從基片的前表面到后表面的孔(圖2(f))。對整個基片20進行熱氧化，以便將SiO2層33沉積到裝置的一個表面和最外部的表面上(圖2(g))。其后，利用真空沉積或濺射在后表面的SiO2層14上摹制一個電極。該優(yōu)選材料的例子包括金、鉑、鉑黑、鈀和銀。另外，為了將上述材料沉積到最外部的表面上，也可以將另一層金屬沉積在該材料和SiO2層14之間。用于該目的的優(yōu)選材料包括鎳、鉻、ITO、鎢、鈦、錫、錳、鉛以及這些金屬的合金。另外，在基片20上，在摹制電極之后，在電極層上而不是在電極部分上還可以形成絕緣層。優(yōu)選材料的例子包括聚酰亞胺樹脂、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、丙烯酸樹脂、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、環(huán)氧樹脂、使這些材料對光敏感的材料，以及光敏抗光蝕劑。
注意，雖然在圖2中，在基片上形成一個凹部，但是通過在圖2的步驟(a)和(b)中選擇所需的圖案可制備一個或多個凹部。
圖3(A)示出了當每個井中制備總共25個凹部并將這些凹部布置成星號形狀時的情形。
圖3(B)是如此制備的一個凹部的電子微型圖。該圖右下部的標尺表示的是5μm。在這個例子中，凹部3的開口基本上是直徑大約為20μm的圓形，并且在凹底的中間基本上觀察到直徑大約為7μm的一個孔。注意，點劃線代表沉積有細胞的位置。圖3(C)是取自基片后面的電子微型圖。該圖右下部的標尺表示的是250μm。在這個例子中，在圖的中心可觀察到一個通過蝕刻形成的大約100μm×大約150μm的長方形。在該區(qū)域配有如上所述的25個通孔。
將基片上的上述凹部組一體固定或粘附到具有許多孔的板上，該板是按照通常用于快速藥物篩選方法的多滴定板(95、384、1356孔板等)的形狀制備的(如圖4(A)所示，其后稱作板)。在這種情形下，以這樣一種方式在基片上形成一個凹部組即，使凹部容納在板上許多孔的每一個內(nèi)(圖4(B))。在圖4所示的這個實例中，以與板匹配的方式形成24×16(＝384)組凹部。板上的孔的大小基本上與通常所用的微滴定板的孔相同，從而在大約4mm2的區(qū)域上形成一組凹部(圖4(B))。通常，各個凹部的間距為10-100μm。
將上述板緊密放置或粘附到最終的基片上，從而獲得具有許多井的細胞電勢的測量裝置。該井由一個側(cè)壁(板上的一個孔)和一個底面(基片)組成。利用單組分RTV橡膠(ShinEtsu Silicones KE42T)或類似物使板與基片粘合在一起。
另外，可以用低胞毒材料(例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚對苯二甲酸乙二醇酯)制備符合多滴定板形狀的具有許多孔的板，并利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如擠壓方法)來形成這樣的板。
另外，當利用容易進行微量切削加工的硅片作為基片材料時，還可以直接在硅片基底上形成圖1(A)所示的井形狀，而無需酷似多滴定板的板。
圖5示出了作為本發(fā)明的一個變型實例的、在井的側(cè)壁22上包括環(huán)形參比電極20的細胞外電勢測量裝置。圖5(A)是該裝置的平面圖。圖5(B)是沿圖5(A)所示的5’線的該裝置的剖面圖。在這個變型實例中，由于參比電極是環(huán)形的，因此參比電勢均勻地分布在井內(nèi)，借此改善了測量精度。環(huán)形電極20例如是由寬度為約1μm-約1000μm的電線形成的，該電線是由金、鉑、銀-氯化銀等制成。數(shù)字標號24代表將參比電極連接到電源上的電線。測量電極29通過一根電線(未示出)與信號檢測部分相連(諸如在圖1所示的裝置中)。
圖6示意性地示出了內(nèi)部結(jié)合有本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的快速藥物篩選儀器的示范結(jié)構(gòu)。以下描述圖6的結(jié)構(gòu)。A表示容納細胞外電勢測量裝置并根據(jù)目標物保持適合細胞培養(yǎng)的環(huán)境的培養(yǎng)裝置。B表示用于將細胞外電勢測量裝置從培養(yǎng)裝置轉(zhuǎn)移到信號檢測裝置的裝置。例如，可以利用機械手作為轉(zhuǎn)移裝置。C表示結(jié)構(gòu)在圖7中所詳細示出的信號檢測裝置。D表示信號拉線。E表示信號處理裝置(計算機)。
圖7示意性地示出了圖6的信號檢測裝置的示范結(jié)構(gòu)。以下描述圖7的結(jié)構(gòu)。A表示用于注射或排放目標藥液的裝置(例如試劑分配多量吸移管)。B表示上述的細胞外電勢測量裝置。C表示吸入部分。D表示抽吸泵。E至H表示試劑。I表示信號拉線。J表示前置放大器。K表示主放大器。L表示與信號處理裝置(計算機)相連的信號拉線。
注意，利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)連接以上的部件，并且該連接并不是特別專業(yè)的。
其次，參照圖10和11來描述本發(fā)明的一個變例。圖10是表示本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的一個變例的粗略附圖。傳感器基片51在其頂表面上配有通過SOI基片52的井53(將細胞放置在井內(nèi))，而在其底表面上配有用于檢測信號的一般由金制成的測量電極54。在井53內(nèi)含有大約50μl的培養(yǎng)基55。而在SOI基片52上的通孔57內(nèi)含有大約1μl或更少的培養(yǎng)基55。在井53內(nèi)形成凹部56，以便具有截留細胞的最佳結(jié)構(gòu)，其中開口的直徑一般大約為10μm。在井53內(nèi)，將參比電極58(一般由Ag-AgCl制成)浸漬在培養(yǎng)基55內(nèi)。
正如本文所采用的，容納參比電極58的井53、浸漬參比電極58的培養(yǎng)基55以及凹部56一起被稱作參比電極布置設(shè)施。測量電極54附近的培養(yǎng)基和通孔57內(nèi)所含的培養(yǎng)基一起被稱作測量電極布置設(shè)施。
凹部56的尺寸可根據(jù)所述生物樣品來改變，并且不受特別的限制，只要能保持所述生物樣品即可。通常，凹部56的開口具有10-500μm的直徑和1-500μm的深度。典型的是，凹部56的開口具有10-100μm的直徑和2-100μm的深度。作為優(yōu)選的圖示凹部而舉的例子是，具有20μm直徑和10μm深度的開口的凹部以及具有20μm直徑和20μm深度的開口的另一凹部。而且，通孔57的尺寸不受特別的限制，只要所述生物樣品不通過通孔57并保持在凹部56內(nèi)即可。通常，通孔57的開口具有5-100μm的直徑和10nm-100μm的深度。例如，作為圖示通孔而舉的例子是，具有5μm直徑和1.5μm深度的通孔。
圖10還示出了在其下部的凹部56的放大平面圖。
圖11是表示本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置的另一個變例的粗略附圖。圖11中示出的傳感器基片60不同于圖10中示出的傳感器基片51，其中傳感器基片60配有許多凹部56和通孔57。如圖11所示，每個凹部56內(nèi)含有一個橢圓形細胞。絕緣基片62-64是由SOI制成的。SiO2層63配置在Si層62的下面，而支持基片64配置在SiO2層63的下面。測量電極54配置在傳感器基片60的底表面上并且沿支持基片64的表面和SiO2層63的表面的一部分(在此處測量電極54接觸細胞69)，或者位于細胞69附近，優(yōu)選的是與細胞69的距離為10μm或更小。
在本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置中，在測量電極54附近僅僅含有由細胞吸入裝置吸入的電解質(zhì)。因此，在本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置中，在基片60的與放置所述生物樣品的另一面(即傳感器基片60的底表面)相對的那一面附近所含有的電解質(zhì)溶液不超過大約1-10μl，其中還包括填充通孔57的電解質(zhì)溶液。而且，并不特別需要用電解質(zhì)填充整個細胞吸入系統(tǒng)，只要可以用測量電極54檢測細胞中的電變化即可。
如圖10和11所示，每個測量電極可以配有一個凹部56和一個通孔57，或者每個測量電極可以配有許多凹部56和通孔57。
圖12是表示當利用圖11所示的傳感器基片60測量細胞中的電變化時所任選使用的吸入線裝置85的粗略附圖。如圖12所示，吸入線裝置85構(gòu)成配置在傳感器基片60的底表面上的細胞吸入裝置85的一部分。吸入裝置85由諸如丙烯酸、PMDS或硅橡膠這樣的材料制成，并且相對于傳感器基片中所配置的許多通孔57，其形狀形成了與吸入線相通的空間81。利用硅橡膠作為介質(zhì)將吸入線裝置85安裝到傳感器基片的底表面上。而且，可以將吸入線裝置85一體安裝到傳感器基片上。如圖12所示，當測量細胞中的電變化時，優(yōu)選的是，用由細胞吸入系統(tǒng)線87產(chǎn)生的吸入壓力將細胞緊緊附著在絕緣基片上。注意，在圖12中，忽略細胞實體，而以簡化的方式表示凹部和通孔的結(jié)構(gòu)。
圖13是表示用于測量目標化學(xué)物質(zhì)對生物樣品的作用的裝置的結(jié)構(gòu)規(guī)劃圖，該裝置包括本發(fā)明的傳感器基片。這種裝置還包括包括本發(fā)明的傳感器基片的測量部分(信號源)101、用于從測量部分101采集信號并計算標準偏差的單位標準偏差計算部分102、用于計算所獲得的標準偏差的平均值的平均值計算部分105、用來根據(jù)平均值計算部分105的平均標準偏差輸出值計算細胞的離子通道活性的活性計算部分108以及用于顯示所獲得的活性的數(shù)據(jù)顯示部分110。用圖4中的點劃線或?qū)嵕€來表示每一部分之間的聯(lián)系。注意，通常，單位標準偏差計算部分102、平均值計算部分105和活性計算部分108是存儲在裝入計算機內(nèi)的硬盤中的、用于執(zhí)行計算的程序。數(shù)據(jù)顯示部分110是CRT。
注意，在圖13中，數(shù)字標號103、104、106和109表示以下所述的正常分布近似部分、模擬生成部分、平均值/半寬計算部分和活性分類部分。
實例下面將以舉例的方式來描述本發(fā)明。以下的實例是為了闡述本發(fā)明，并不是對本發(fā)明的限定。
(例1)在硅基片上形成具有一個通孔的25個凹部，這些凹部的間隔為100μm(孔的每個中心之間的距離)、形狀為圖3所示的星號。每個凹部具有直徑為20μm、深度為10μm的開口。將直徑為3μm的通孔配置在凹部的中心部分。將具有足夠尺寸從而具有多個可包含凹部的孔的一個板(寬度×長度×厚度＝12.7×8.1×7mm)被粘附在基片上。將所獲得的細胞外電勢測量裝置并入圖6所示的裝置中。
用妊娠17天的SD大鼠胚胎的大腦皮層制備神經(jīng)原，然后將神經(jīng)原懸浮到濃度為1×105個細胞/ml的由Dulbecco改進的培養(yǎng)基中并分配到井內(nèi)。用每個凹部截留這些細胞并用吸入注射器輕輕吸入細胞，以便改善細胞與硅基片之間的緊密性。在這種情形中，在CO2溫育器(34℃，5％CO2)內(nèi)將細胞培養(yǎng)30分鐘。其后，將Ca拮抗劑(ω-芋螺毒素GVIA)加入到井內(nèi)并使?jié)舛葹?0nM，然后使細胞反應(yīng)5分鐘。其次，加入谷氨酸，使?jié)舛葹?0μM。將產(chǎn)生噪音的結(jié)果與沒有Ca拮抗劑時所產(chǎn)生的噪音結(jié)果進行比較。結(jié)果如圖8所示。
圖8(A)是在Ca拮抗劑缺乏時被測對照細胞中所觀察到的噪音圖(水平軸代表時間，垂直軸代表電壓(指示出細胞活性的電勢強度))，以及通過對噪音進行FFT(快速傅里葉變換式)(水平軸代表噪音頻率，垂直軸代表噪音振幅的平方值(所謂的功率譜))而得到的噪音的頻率特征圖。圖8(B)是Ca拮抗劑存在時所測量的噪音圖和噪音的頻率特征圖。
如圖8所示，在Ca拮抗劑存在時噪音具有大約4Hz的最大值，而在Ca拮抗劑缺乏時具有大約10Hz的最大值。對于強度，據(jù)觀察，Ca拮抗劑缺乏時的噪音大約是Ca拮抗劑存在時的噪音的1.5倍?？擅黠@檢測到Ca拮抗劑對細胞的影響。
(例2)制備具有96個井的細胞外電勢測量裝置，每個井與例1具有相同的結(jié)構(gòu)。具體地說，將一組具有直徑為20μm的開口的25個凹部以星號的形狀配置在硅片基底上。在8×12的矩陣上星號組之間彼此間隔大約10mm。將由聚苯乙烯制成的96孔板(寬度×長度×厚度＝12.7×8.1×7mm)粘附到硅片基底上，以便使板的每個孔含有一組凹部。將所獲得的96井細胞外電勢測量裝置并入圖6所示的裝置中。注意，每個凹部在其中心配有一個直徑為3μm的通孔。
正如例1中所述，將用妊娠17天的大鼠胚胎的大腦皮層制備的神經(jīng)原分配到每個井中，使其濃度為1×105個細胞/ml。而且，在井的頂部和裝置的通孔下面以分段的方式重復(fù)施加壓力和吸入，借此改善細胞與硅片基底之間的緊密度。在這種情形中，在CO2溫育器內(nèi)將細胞培養(yǎng)30分鐘。其后，將兩種Ca拮抗劑(ω-芋螺毒素和ω-agatoxin)加入到細胞中，使其最終濃度為1、3、10和30nM并且反應(yīng)5分鐘。加入谷氨酸，使其濃度為20μm。將產(chǎn)生的噪音結(jié)果與Ca拮抗劑缺乏時產(chǎn)生的噪音結(jié)果進行比較。利用信號處理軟件檢測Ca拮抗劑存在或缺乏時對細胞的影響。
圖9示出了在計算機屏幕上所顯示的結(jié)果。矩陣型屏幕顯示具有與細胞外電勢測量裝置的井矩陣一一對應(yīng)的關(guān)系。圖9左邊的數(shù)字代表加入矩陣的每一行上的井中的Ca拮抗劑的濃度。注意，B表示沒有加入Ca拮抗劑的一行對照井。在圖9中，以白色或黑色密度顯示這些井。用信號處理軟件處理檢測信號，以便顯示與不同密度的對照井中所觀察的噪音信號對應(yīng)的井之間的噪音差。
如圖9所示，發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的細胞外電勢測量裝置，在每個井中獲得取決于Ca拮抗劑濃度的反應(yīng)，借此檢測Ca拮抗劑在多個井中的作用。
(例3)測量部分(信號源)101包括圖12中所示的傳感器基片。利用具有圖13中所示結(jié)構(gòu)的裝置測量神經(jīng)原對化學(xué)物質(zhì)碳酰膽堿的作用，其中利用椎實螺(Lymnaea Stagnalis)來制備神經(jīng)原。碳酰膽堿是一種公稱為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿類似物的化學(xué)物質(zhì)。將碳酰膽堿(由Sigma生產(chǎn))溶解在人造腦脊髓液中，使其濃度為0、0.1、0.3、1、3、10、30和100μM。利用具有這些濃度的溶液來測量由神經(jīng)原發(fā)出的電信號。對于每個碳酰膽堿濃度，從包括傳感器基片的測量部分(信號源)101獲得10秒鐘的時序數(shù)據(jù)，并以100微秒的間隔采集這些數(shù)據(jù)，然后計算所采集的數(shù)據(jù)的標準偏差。在圖17中繪出了標準偏差的平均值。
正如從圖17中所看到的，碳酰膽堿的濃度越大，每10微秒的標準偏差的平均值就越大。該結(jié)果表明椎實螺(Lymnaea Stagnalis)神經(jīng)原的離子通道的活性取決于碳酰膽堿的濃度。
(例4)圖14是按照本發(fā)明檢測目標化學(xué)物質(zhì)對生物樣品的作用的裝置結(jié)構(gòu)規(guī)劃圖。該裝置與圖13的裝置相同，只是用正常分布近似部分103、平均值/半寬計算部分106和活性分類部分109代替平均值計算部分105和活性計算部分108。在圖13中用虛線或?qū)嵕€來表示每個部分之間的聯(lián)系。
正常分布近似部分103將單位標準偏差計算部分102所獲得的多個標準偏差值分成多個以標準偏差的預(yù)定寬度為一個單位的類別，繪出標準偏差值，其中X軸代表類別，Y軸代表屬于該類別的標準偏差值的數(shù)目，然后將所獲得的圖近似成正常分布。平均值/半寬計算部分106計算所獲得的正常分布的平均值和半寬。活性分類部分109基于獲得的平均值和半寬對離子通道活性進行分類。注意，與圖1 3的裝置類似，單位標準偏差計算部分102、正常分布近似部分103、平均值/半寬計算部分106和活性分類部分109一般可以是記錄在計算機硬盤中的軟件程序。數(shù)據(jù)顯示部分110可以是CRT。
測量部分(信號源)101包括圖12中所示的傳感器基片。利用具有圖14所示結(jié)構(gòu)的裝置來測量碳酰膽堿對神經(jīng)原的作用，其中用椎實螺(Lymnaea Stagnalis)制備神經(jīng)原。
在將50μM濃度的碳酰膽堿加入到椎實螺(Lymnaea Stagnalis)神經(jīng)原的前后，從測量部分(信號源)101獲得信號，以與例1相同的方式來計算信號的標準偏差。正常分布近似部分103將標準偏差繪成圖(如圖18所示)。
圖18(A)示出了用施加碳酰膽堿之前10秒鐘的電信號時序數(shù)據(jù)計算的每5毫秒的標準偏差值的直方圖。圖18(B)示出了用施加碳酰膽堿之后10秒鐘的電信號時序數(shù)據(jù)計算的每5毫秒的標準偏差值的直方圖。如圖18(A)和(B)所示，施加碳酰膽堿前后的直方圖近似于正常分布圖。所獲得的正常分布圖的平均值和半寬在施加碳酰膽堿之前分別為0.478和0.109，而在施加碳酰膽堿之后分別為0.783和0.175。這樣，可以肯定，從施加碳酰膽堿之前到施加碳酰膽堿之后，每5毫秒的標準偏差的平均值是增大了。這是因為所施加的碳酰膽堿激活了椎實螺(Lymnaea Stagnalis)神經(jīng)原的離子通道，而被激活的離子通道的開或關(guān)導(dǎo)致動作電勢的變化。
圖19示出了每5毫秒的標準偏差值的直方圖，其中對利用常規(guī)的細胞內(nèi)記錄方法獲得的數(shù)據(jù)進行信號處理(如上所述)。正如從圖19中所看到的，細胞外記錄方法的測量結(jié)果與細胞內(nèi)記錄方法的測量結(jié)果相同。
如上所述，按照本發(fā)明的技術(shù)，無需利用常規(guī)的細胞內(nèi)記錄方法就能夠測量與離子通道的開或關(guān)相關(guān)的細胞活性以及其中的變化。因此，本發(fā)明通過以下方式使得藥物作用或效果的定性或定量分類成為可能即測量離子通道的活性，并且比較將藥物施加到細胞內(nèi)前后的離子通道活性的絕對值或增加值或減小值或者根據(jù)藥量對這些值進行比較。
(例5)細胞內(nèi)記錄的研究等已經(jīng)證實，當用10μM的去甲腎上腺素刺激細胞時，以依賴濃度的方式利用硝苯吡啶來抑制平滑肌細胞的Ca離子通道的活性。在利用細胞內(nèi)記錄法所得到的數(shù)據(jù)中，用兩個值(即圖20中的來自參考值(相對移位值)的標準偏差的正常分布的平均值偏差和來自參考值(相對傳播)的其半寬的平均值偏差)表示和繪出硝苯吡啶的抑制作用。在圖20中，圓圈表示具有變化濃度(0.03-30μM)的硝苯吡啶。
利用由細胞內(nèi)記錄方法記錄的硝苯吡啶對Ca離子通道的作用作為對抑制Ca離子通道的兩種藥物A和B的效果進行分類的數(shù)據(jù)庫，利用與例4相同的細胞外記錄方法來記錄藥物A和B的效果。利用與例4相同的方法(只是藥物A和B的濃度在0.03-30μM的范圍內(nèi)變化)來記錄細胞的離子通道活性。與硝苯吡啶類似，用兩個值(即圖20中的來自參考值(相對移位值)的標準偏差的正常分布的平均值偏差和來自參考值(相對傳播)的其半寬的平均值偏差)來表示和繪出最終的效果。在圖20中，三角形表示化合物A，而正方形表示化合物B。如圖20所示，化合物A(三角形)以與上述濃度范圍內(nèi)的硝苯吡啶(圓圈)基本上相同的方式即依賴于濃度的方式起作用。因此，將化合物A稱作與硝苯吡啶類似的Ca離子通道抑制劑。相反，化合物B在上述的相對移位和相對傳播方面基本上不改變，從而化合物B不可能是平滑肌細胞中所存在的Ca離子通道的高度阻斷劑。
如上所述，本發(fā)明的方法可推斷未知藥物的效果。而且，例如，可利用虛圓表示的臨界值來評估藥物，該虛圓表示上述的相對移位和相對傳播每個都在如圖20所示的大約5％之內(nèi)(具體地說，在圓圈內(nèi)所繪出的給定測量值的濃度沒有任何藥效，而在圓圈內(nèi)沒有繪出的給定測量值的濃度具有藥效)，借此能夠有效地篩選藥物。
在上述實例中，采用來自參考值的正常分布的平均值偏差和來自參考值的其半寬的偏差。另外，還可以利用標準偏差和方差的相應(yīng)參數(shù)來評估藥物的效果。
如上所述，在本發(fā)明中，參比電極和測量電極的布置和環(huán)境或者特性適合鑒定生物樣品的電特性變化。因此，無需在細胞(或組織)和測量裝置之間形成較高的電阻密封(吉咖封口)就能夠測量生物樣品中的電變化。而且，在本發(fā)明中，檢測生物樣品的電特性變化的步驟一般擁有以恒定的采集速度捕獲的數(shù)字信號(預(yù)定的時序數(shù)據(jù))，從而從噪音中能夠提取明顯的代表離子通道的開或關(guān)的信號，并對該信號進行測量和分類。
注意，在以上的實例中采用圖13或14所示的裝置，但是也可以利用圖15或16所示的裝置來代替圖13或14中的裝置。
圖15所示的裝置除了圖14的裝置外，還包括用數(shù)字標號111表示的樣品數(shù)分類部分。
圖16所示的裝置與圖14的裝置相同，只是圖16的裝置包括許多含有本發(fā)明的傳感器基片的信號源101以及用于模擬信號源101的信號生成部分104。
注意，以上的例1-5僅僅表明本發(fā)明的裝置和方法的用途，而并不是用來限定所用的化合物、氧的濃度等。
雖然參照以上的實例對本發(fā)明進行了描述，但是本發(fā)明并不局限于這些例子?？梢杂镁哂胁煌冃?、改進和變化的實施方案來實施本發(fā)明，而不脫離本發(fā)明的范圍和精髓。
工業(yè)實用性通過采用本發(fā)明的裝置，可提供一種能夠簡便快速并自動地對細胞進行電生理評估的儀器?？梢岳眠@種儀器進行藥物篩選等。
本發(fā)明的裝置克服了常規(guī)的膜片鉗方法的缺陷，而常規(guī)的膜片鉗方法需要高水平的專業(yè)技術(shù)人員或者包括許多實驗步驟并具有較差的S/N比的常規(guī)的熒光顏料方法。利用本發(fā)明的裝置，可提供一種能夠簡便快速地篩選藥物候補化合物的儀器，并且明顯減小了常規(guī)的藥物篩選所需的長時間。而且，由于這樣的裝置不需要高水平的專業(yè)技術(shù)人員并且能夠自動收集數(shù)據(jù)和處理信號，因此任何人都能夠容易地測量細胞外電勢。
本發(fā)明提供了一種能夠從由細胞外記錄的信號中提取與細胞的離子通道的開或關(guān)相關(guān)的電變化(作為明顯的信號，而常規(guī)上不可能檢測到)的測量方法和裝置。通過利用無需專用的控制裝置的簡單測量探頭(傳感器基片)，提供了一種能夠在短時間內(nèi)同時測量大批生物樣品的方法和裝置。在這種裝置和方法中，為了進行測量，無需采用化學(xué)物質(zhì)或熒光物質(zhì)，因此無需長期考慮化學(xué)物質(zhì)的副作用或者熒光靈敏度的變化。細胞外記錄可以為整個細胞的常量通道活性提供一種指示并且可用于快速的藥物篩選中。
權(quán)利要求
1.一種用于測量細胞外電勢的裝置，包括至少一個井，所述井包括配置在基片上的用于截留細胞的裝置；一個用于檢測每個至少一個井的電信號的測量電極；以及一個參比電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述細胞截留裝置包括至少一個配置在所述井內(nèi)的凹部，并且在其底表面上具有一個通孔，所述通孔與吸入細胞的裝置相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于所述測量電極位于一個空間內(nèi)，所述空間通過所述通孔與所述井相連。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于細胞被所述凹部的開口緊緊截留。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于所述凹部的所述開口具有10-50μm的直徑，而所述通孔具有大約2-10μm的直徑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述基片是從由以下物質(zhì)構(gòu)成的組合中選擇的材料制成的硅片、聚四氟乙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述基片是絕緣基片，而所述裝置還包括吸入細胞的裝置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于用于培養(yǎng)細胞的所述井是從由以下物質(zhì)構(gòu)成的組合中選擇的材料制成的硅氧烷、塑料、SiO2和橡膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述參比電極是環(huán)形的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于所述參比電極是由導(dǎo)電材料制成的。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征在于所述絕緣基片包括一個直徑為6μm的通孔。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于所述絕緣基片包括一個支持層，而所述支持層是一個厚度至少為10μm的SOI基片。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于從由以下物質(zhì)構(gòu)成的組合中選擇所述支持層硅、塑料、SiO2和橡膠。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于所述支持層具有1μm或更大的厚度。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征在于所述細胞吸入裝置是由硅氧烷、塑料、SiO2和橡膠制成，而所述細胞吸入部分的厚度為10μm或更厚。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述凹部的內(nèi)壁被處理成親水性的。
17.一種用于測量細胞外電勢的方法，包括以下步驟提供一種用于測量生物樣品的電特性的反應(yīng)系統(tǒng)；將所述完整細胞放置到所述的反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)；以及檢測所述細胞的電特性，其中所述反應(yīng)系統(tǒng)包括至少一個井，所述井包括配置在基片上用于截留細胞的裝置；一個用于檢測至少一個井中的每一個井的電信號的測量電極；以及一個參比電極。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述電特性檢測步驟包括至少兩次檢測所述細胞的電特性并比較檢測出的至少兩個電特性值。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于配有測量電極的區(qū)域的電容小于配有參比電極的區(qū)域的電容。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于參比電極的表面積小于測量電極的表面積。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于測量電極的阻抗低于參比電極的阻抗。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于10Hz-10kHz的測量電極的阻抗小于10Hz-10kHz的參比電極的阻抗。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述基片是絕緣基片；所述細胞截留裝置是一個浸漬在電解質(zhì)中并位于所述絕緣基片上的通孔；當將所述的細胞放到通孔上時，所述參比電極位于絕緣基片的具有所述細胞的第一側(cè)面附近，而所述測量電極位于絕緣基片的與第一側(cè)面相對的第二側(cè)面上，并且浸漬參比電極的電解質(zhì)量不同于浸漬測量電極的電解質(zhì)量。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于浸漬參比電極的電解質(zhì)量是浸漬測量電極的電解質(zhì)量的5倍或者更多。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述基片是絕緣基片；所述細胞截留裝置是一個位于所述絕緣基片上的通孔；當將所述的細胞放到通孔上時，所述參比電極位于具有所述細胞的絕緣基片的第一側(cè)面附近，而所述測量電極位于絕緣基片的與第一側(cè)面相對的第二側(cè)面上，并且參比電極的電極面積不同于測量電極的電極面積。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于參比電極的電極面積是測量電極的電極面積的1/5或者更少。
27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述基片是絕緣基片；所述細胞截留裝置是一個位于所述絕緣基片上的通孔；當將所述的細胞放到通孔上時，所述參比電極位于具有所述細胞的絕緣基片的第一側(cè)面附近，而所述測量電極位于絕緣基片的與第一側(cè)面相對的第二側(cè)面上，并且參比電極的阻抗不同于測量電極的阻抗。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于參比電極的阻抗是測量電極的阻抗的5倍或者更多。
29.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于參比電極與所述細胞的距離大于測量電極與所述細胞的距離。
30.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于在所述的細胞外電勢的測量裝置中，參比電極的面積與測量電極的面積之比為1∶5，而參比電極的阻抗與測量電極的阻抗之比為5∶1，或者浸漬參比電極的電解質(zhì)體積與浸漬測量電極的電解質(zhì)體積之比為5∶1。
31.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述的細胞外電勢是與細胞的離子通道或受體活性相關(guān)的信號，或者是與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的作用相關(guān)的信號。
32.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于在具有對所述細胞具有已知作用的標準化學(xué)物質(zhì)的情況下以及在具有目標化學(xué)物質(zhì)的情況下實施電特性檢測步驟，并且所述方法還包括以下步驟將在具有標準化學(xué)物質(zhì)的情況下和在具有目標化學(xué)物質(zhì)的情況下所得到的電特性進行比較，并檢定目標化學(xué)物質(zhì)對生物樣品的作用。
33.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述細胞的放置步驟包括以下步驟將測量溶液引入到所述井內(nèi)；在所述井以及與所述井相對的通孔開口之間產(chǎn)生一個壓力差，所述通孔與所述井相通；以及使壓力差為1/10或更小的幅度。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于通過減小通過開口的壓力來產(chǎn)生所述的壓力差。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于通過將壓力施加到所述井上來產(chǎn)生所述壓力差。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于通過減小通過開口的壓力并將壓力施加到所述井上來產(chǎn)生所述壓力差。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于所述壓力差為0.01-0.5atm。
38.一種快速藥物篩選裝置，包括權(quán)利要求1所述的細胞外電勢測量裝置；與所述細胞外電勢測量裝置的測量電極相連的電信號檢測部分；以及用于處理信號的裝置，其中所述的信號處理裝置處理多個來自電信號檢測部分的電信號并顯示細胞的活性狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠簡便和高度可靠地檢測由生物樣品發(fā)出的微小電信號的變化的細胞外電勢測量裝置，以及一種采用該裝置的細胞外電勢測量方法和包括該裝置的一種儀器。細胞外電勢測量裝置用較大的精度和較高的輸出測量細胞外的電勢。該裝置包括至少一個井，所述井包括配置在基片上用于截留細胞的裝置；一個用于檢測每個至少一個井的電信號的測量電極；以及一個參比電極。細胞截留裝置包括至少一個配置在井內(nèi)的凹部并在其底表面上具有一個通孔，該通孔與吸入細胞的裝置相連。
文檔編號G01N33/487GK1458972SQ02800602
公開日2003年11月26日 申請日期2002年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月9日
發(fā)明者岡弘章, 小川竜太, 行政哲男, 杉原宏和, 小西聡, 慈幸秀保, 尾崎亙彥, 江本文昭 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社