專利名稱：實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)牛羊源性成分探針序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的擴(kuò)增與檢測(cè)，特別涉及牛、羊源性成份的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)探針序列及試劑盒。
背景技術(shù)：
歐洲自1996年發(fā)生和傳播瘋牛病(Bovine SpongiformEncephalopathy，BSE)后，在國際上引起了廣泛的重視。由于該病的發(fā)展與人類健康密切相關(guān)，科學(xué)界對(duì)此進(jìn)行了大量和深入地研究?，F(xiàn)已證實(shí)，瘋牛病的病原體是一種“朊蛋白”，它導(dǎo)致綿羊患上一種被稱“癢病”的慢性神經(jīng)機(jī)能病，癢病傳播到牛身上即導(dǎo)致了瘋牛病。由于瘋牛病至今尚無有效的治療方法，免疫接種也不能預(yù)防這類疾病，因此許多國家陸續(xù)制定政策和法規(guī)，采取緊急措施，開展對(duì)瘋牛病的普查和監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)對(duì)瘋牛病的預(yù)防控制和管理，禁止從瘋牛病疫區(qū)的國家或地區(qū)進(jìn)口含牛、羊成份的制品(如飼料、血液制品、化妝品等)，以防范瘋牛病的傳入或控制其蔓延。
目前，動(dòng)物源性成份的檢測(cè)鑒別方法有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法(即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR法)。其中尤其以分子生物學(xué)方法最為快速、靈敏。PCR方法又分為定性PCR和定量PCR方法。定性PCR已廣泛應(yīng)用于基于核酸的研究和臨床診斷等領(lǐng)域，但這種檢測(cè)方法依賴于不同程度的PCR后處理，容易因污染而產(chǎn)生假陽性，凝膠電泳使用的染色劑溴化乙錠(EB)為強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，若操作不當(dāng)，會(huì)危害實(shí)驗(yàn)人員的健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有定性PCR技術(shù)的不足而提供一種高特異性、高靈敏性和高精確性、閉管檢測(cè)、操作快速重現(xiàn)性好、抗污染且進(jìn)一步降低假陽性率的牛、羊源性成份的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)探針序列和試劑盒。
本發(fā)明的原理是在定量PCR體系中，不僅有兩條普通的引物，而且還加有一條熒光標(biāo)記探針。這條探針的5’端和3’端分別標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)。當(dāng)這條探針保持完整時(shí)，R基團(tuán)的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所淬滅；一旦探針被切斷，淬滅作用消失，R基團(tuán)的熒光信號(hào)就可以被檢測(cè)到。熒光的強(qiáng)度與PCR成正相關(guān)，收集熒光信號(hào)，從而可以檢測(cè)出待測(cè)樣品的初始拷貝數(shù)，判定待測(cè)樣品中是否含有牛、羊源性成份。還可通過加入一系列已知濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，還可對(duì)待測(cè)樣品中的牛、羊成份進(jìn)行定量檢測(cè)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的所有探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
用于檢測(cè)牛源性成份的熒光PCR檢測(cè)探針的優(yōu)選序列是5’-caatccagaactgacaccaac-3’，該探針的最大序列是5’-cttttatcacaatccagaactgacaccaacaaaaatat-3’，該探針最小序列是5’-ccagaactgacacc-3’。按上述探針序列生產(chǎn)制成的用于檢測(cè)牛源性成份的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒。
用于檢測(cè)羊源性成份的熒光PCR檢測(cè)探針的優(yōu)選序列是5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’，該探針的最小序列是5’-ctttggtgttat-3’，該探針用于檢測(cè)山羊成份的最大序列是5’-gttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatt-3’，用于檢測(cè)綿羊成份的最大序列是5’-ctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatt-3’。按上述探針序列生產(chǎn)制成的用于檢測(cè)羊源性成份的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)時(shí)熒光PCR采用完全閉管檢測(cè)，無需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
用于檢測(cè)牛、羊成份的實(shí)時(shí)熒光PCR探針序列即可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。當(dāng)作定性檢測(cè)時(shí)，以陽性對(duì)照物為準(zhǔn)，判定結(jié)果為陰性(未檢出)或陽性(檢出)；當(dāng)作定量檢測(cè)時(shí)，通過已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可定量檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1用于檢測(cè)牛源性成份的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，檢測(cè)牛源性成份。
檢測(cè)基因牛線粒體DNA。
引物序列上游5’-gccatatactctccttggtgaca-3’，下游5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’。
探針序列5’-caatccagaactgacaccaac-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針序列制成的用于檢測(cè)牛源性成份的試劑盒。
實(shí)施例2用于檢測(cè)羊源性成份的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列和試劑盒，檢測(cè)羊源性成份。
檢測(cè)基因羊線粒體DNA。
引物序列上游 5’-tattaggcctcccccttgtt-3’，下游5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’。
探針序列5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’。
試劑盒應(yīng)用該探針序列制成的用于檢測(cè)牛源性成份的試劑盒。
檢測(cè)主要儀器超凈工作臺(tái)、消毒滅菌鍋、制冰機(jī)、核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式小型離心機(jī)，Mini個(gè)人離心機(jī)、低溫冰箱，冷藏冷凍冰箱、純水器、雙蒸水器、旋渦震蕩器、微量進(jìn)樣器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
檢測(cè)主要試劑10×PCR緩沖液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、引物和探針(按探針序列制成試劑盒)等。
提取DNA
(1)試劑盒法按說明書操作步驟進(jìn)行。
(2)SDS法稱2g樣品于10ml離心管中，加入8m110％SDS和10ul/ml蛋白酶K提取液，56℃振蕩消化1hr。2000rpm離心5min；取離心上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混勻，靜置5min；8000rpm離心5min；小心取離心上清液，加等體積氯仿/異戊醇(24∶1)混勻，靜置5min；8000rpm離心理5min；取離心上清液加0.65倍體積的異丙醇，混勻，12000rpm4℃離心10min；棄去上清液，加500ul70％冰乙醇；12000rpm4℃離心5min；取沉淀，吹干(37℃約10 min)。加50ulddH2O溶解白色沉淀，此即為總DNA抽提物。4℃過夜，或37℃保溫1hr后直接用于PCR或電泳測(cè)試。
實(shí)時(shí)熒光PCR檢驗(yàn)所用引物和探針序列如實(shí)施例1、2所述。
實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)為50℃/2min，預(yù)變性95℃/10min；95℃/15s，60℃/1min，40個(gè)循環(huán)(注不同儀器應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整)。
權(quán)利要求
1.用于牛源性成份檢測(cè)的熒光PCR檢測(cè)探針序列，其特征是該探針的優(yōu)選序列是5’-caatccagaactgacaccaac-3’，探針的最大序列是5’-cttttatcacaatccagaactgacaccaacaaaaatat-3’，探針的最小序列是5’-ccagaactgacacc-3’。
2.用于羊源性成份檢測(cè)的熒光PCR檢測(cè)探針序列，其特征是該探針的優(yōu)選序列是5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’，最小序列是5’-ctttggtgttat-3’；用于檢測(cè)山羊源性成份的熒光PCR探針的最大序列是5’-gttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatt-3’，用于檢測(cè)綿羊源性成份的熒光PCR探針的最大序列是5’-ctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatt-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2、所述的用于牛、羊源性成份實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的探針序列，其特征是熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在探針的5′端，熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記在探針的3′端，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3所述的探針序列，其特征是可以制成用于牛、羊源性成份實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測(cè)牛、羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR探針序列和試劑盒，給出檢測(cè)牛、羊線粒體DNA基因的探針序列(包括最大、最小及優(yōu)選序列)，按探針序列生產(chǎn)制成的試劑盒，用于牛、羊源性成分的定性和定量檢測(cè)。本發(fā)明采用的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)采用完全閉管檢測(cè)，無需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、核酸雜交的特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速和敏感性，使得本方法具有操作簡單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1490609SQ0213495
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2002年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月15日
發(fā)明者曹際娟, 覃文 申請(qǐng)人:曹際娟, 覃文