專利名稱：利用在Ti表面原位合成的TiO₂納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料的技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用陽(yáng)極氧化法在Ti表面原位合成TiO2納米管覆層，進(jìn)而利用共沉淀技術(shù)對(duì)TiO2納米管進(jìn)行慶大霉素負(fù)載的方法。
背景技術(shù)：
感染是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，由于治療的長(zhǎng)期性和困難性，假體周圍感染給患者、臨床醫(yī)生和醫(yī)療機(jī)構(gòu)帶來(lái)巨大壓力。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染難以治愈的根本原因在于假體表面生物膜的形成和假體/組織界面缺乏免疫能力。生物膜的形成和假體/組織界面缺乏免疫能力共同使細(xì)菌易于在假體上定植和進(jìn)一步感染。在人工關(guān)節(jié)感染的發(fā)病機(jī)制中，細(xì)菌最初粘附到生物材料表面是最重要的步驟，因此，關(guān)鍵在于需組織最 初的細(xì)菌(主要為表皮葡萄球菌)粘附到人工關(guān)節(jié)假體表面。慶大霉素通常用于預(yù)防人工關(guān)節(jié)假體周圍的細(xì)菌感染。它是一種氨基糖苷類抗生素，能夠治療多種類型的細(xì)菌感染，同時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性，甚至在高壓滅菌后仍可有效殺菌，因此在鈦植入物涂層中得到了廣泛使用。本發(fā)明中，我們?cè)O(shè)想將慶大霉素負(fù)載到生物型假體的表面，通過控制藥物的吸附和釋放，達(dá)到抑制細(xì)菌初始粘附，減少生物膜形成的目的，同時(shí)又不影響假體周圍骨細(xì)胞粘附、增殖和分化功能，從而促進(jìn)人工關(guān)節(jié)假體與周圍骨整合，最終達(dá)到人工關(guān)節(jié)假體的長(zhǎng)期功能有效。作為一種生物相容性材料，Ti及其合金，由于高機(jī)械強(qiáng)度、重量輕和生物惰性廣泛用于齒科和骨科植入物。為了預(yù)防植入物相關(guān)感染，研究人員大都在植入物表面加載抗菌涂層。將抗生素加載到Ti植入物的多孔輕基磷灰石(hydroxyapatite,HA)涂層上[劉格芳等，水熱復(fù)合電沉積制備羥基磷灰石/TiO2涂層的方法，中國(guó)專利，CN 03104099. 3]，雖然載抗生素的HA涂層能顯著預(yù)防感染，但有些問題依然存在，比如抗生素不能摻和到磷酸鈣涂層中，以及藥物載磷酸鈣表面的物理吸附限制了加載量和釋放特性等。還有學(xué)者將萬(wàn)古霉素與Ti共價(jià)結(jié)合，設(shè)想實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效的抗菌能力，但是在體內(nèi)，抗生素與植入物共價(jià)結(jié)合的作用值得懷疑[Antoci, V. , C. S. Adams, et al. (2008). The inhibition of Staphylococcusepidermidis biofilmformation by vancomycin-modified titanium alloy andimplications for the treatment ofperiprosthetic infection. Biomaterials 29(35)4684-4690.]。對(duì)涂層中藥物的加載方法前人也進(jìn)行了大量研究。應(yīng)用共沉淀技術(shù)在室溫下將Ti植入物浸入磷酸鈣過飽和溶液中，將抗生素加入過飽和溶液，逐漸與磷酸鈣結(jié)晶共沉淀在植入物表面形成一層涂層。通過這種方法，可將大量的抗生素整合到擬生態(tài)的磷酸鈣涂層中，比通過等離子噴涂涂層上簡(jiǎn)單的物理吸附大10倍，然而，抗生素的釋放并未減慢許多[Alt, V·, A. Bitschnau, et al. (2006). The effects ofcombinedgentamicin-hydroxyapatite coating for cementI ess joint prostheses onthereduction of infection rates in a rabbit infection prophylaxis model.Biomaterials 27(26) :4627-4634.]。在Ti假體表面原位生長(zhǎng)TiO2納米管的覆層原位生長(zhǎng)法得到了高度重視。原位生長(zhǎng)的TiO2納米管不僅易于制備，而且由于TiO2納米管層與Ti的共格狀態(tài)使得兩者之間具有緊密的界面和良好的機(jī)械性能。通過陽(yáng)極氧化法，可在任何三維非平面表面上構(gòu)造TiO2納米管覆層。TiO2納米管覆層的構(gòu)建不僅致使Ti表面的粗糙度與人骨骼天然粗糙度相似，而且具有良好的親水性，這些都促進(jìn)成骨細(xì)胞的表面粘附，且與目前的植入物技術(shù)具有良好的適應(yīng)性。
研究表明TiO2納米管能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度甚至達(dá)到對(duì)照組的3-4倍，掃描電鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的絲足可以長(zhǎng)入納米管狀結(jié)構(gòu)中，從而對(duì)骨細(xì)胞起到錨定作用[Chua, P. H.，K. G. Neoh, et al. (2008). Surfacefunctionalization oftitanium with hyaluronic acid/chitosan polyelectrolyte multilayersand RGD forpromoting osteoblast functions and inhibiting bacterial adhesion. Biomaterials29(10) :1412-1421.]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種加工性能、力學(xué)性能、熱學(xué)性能高、生產(chǎn)成本低的利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，首先利用陽(yáng)極氧化法在預(yù)處理后的鈦基板上制備TiO2納米管覆層，然后將制得的TiO2納米管浸到堿性溶液中，進(jìn)而通過共沉淀法在TiO2納米管覆層中負(fù)載慶大霉素。所述的鈦基板的預(yù)處理方法為先對(duì)Ti片進(jìn)行打磨，然后依次在丙酮、乙醇溶液中進(jìn)行超聲清洗、干燥。所述的陽(yáng)極氧化法是以鈦基板作為陽(yáng)極、Pt片作為陰極，在有機(jī)電解液中電解氧化。所述的有機(jī)電解液為乙二醇、H20和NH4F的混合液，其中乙二醇的體積百分比含量為50vol% -90voI%, H2O的體積百分比含量為IOvol% -50vol%,NH4F的摩爾分?jǐn)?shù)含量為O. 05-0. 15M ;所述的電解氧化的電壓為20-60V，時(shí)間O. 5_10h。所述的TiO2納米管浸到堿性溶液中之前進(jìn)行熱處理，所述的熱處理為在真空馬弗爐中從室溫升至400°C 600°C，速率為1°C -5°C /min，保溫2h_4h，然后隨爐降溫。所述的堿性溶液為1-10M的NaOH溶液，TiO2納米管浸到堿性溶液中的時(shí)間為0.5~2ho所述的共沉淀法為將堿性溶液處理后的TiO2納米管浸入慶大霉素與緩沖液組成的混合溶液中，在細(xì)胞培養(yǎng)器中孵育1-3天即得產(chǎn)品。所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 2-7. 6，混合溶液中慶大霉素的濃度為1000mg/L。本發(fā)明制備的TiO2納米管垂直于基體方向生長(zhǎng)，定向規(guī)則排列，管長(zhǎng)1-2 μ m，管內(nèi)徑110-140nm，管壁厚20_40nm。利用所制備的TiO2納米管負(fù)載慶大霉素，由掃描電鏡(SEM)圖片來(lái)看，慶大霉素成功地負(fù)載到了 TiO2納米管上；由藥物釋放結(jié)果來(lái)看，慶大霉素的釋放時(shí)間可以達(dá)到24h以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用TiO2納米管負(fù)載慶大霉素，具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明采用電化學(xué)陽(yáng)極氧化法原位合成TiO2納米管，工藝方法、合成設(shè)備簡(jiǎn)單，而且由于TiO2納米管層與Ti的共格狀態(tài)使得兩者之間具有緊密的界面和良好的機(jī)械性能。(2)本發(fā)明制備的TiO2納米管具有納米級(jí)的管狀結(jié)構(gòu)，可作為藥物負(fù)載部位和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)點(diǎn)；在Ti假體表面原位生長(zhǎng)的TiO2納米管，結(jié)構(gòu)更易調(diào)控，對(duì)藥物的負(fù)載、釋放過程也就可以進(jìn)行更好的控制。(3)本發(fā)明利用TiO2納米管負(fù)載慶大霉素，用于預(yù)防人工關(guān)節(jié)假體周圍的細(xì)菌感 染。通過控制藥物的吸附和釋放，達(dá)到抑制細(xì)菌初始粘附，減少生物膜形成的目的，同時(shí)又不影響假體周圍骨細(xì)胞粘附、增殖和分化功能，從而促進(jìn)人工關(guān)節(jié)假體與周圍骨整合，最終達(dá)到人工關(guān)節(jié)假體的長(zhǎng)期功能有效。


圖1是本發(fā)明TiO2納米管覆層的制備路徑圖；圖2是本發(fā)明慶大霉素的負(fù)載路徑圖；圖3是未負(fù)載慶大霉素的TiO2納米管的掃描電鏡(SEM)圖；圖4是負(fù)載慶大霉素后的TiO2納米管的掃描電鏡(SEM)圖；圖5是釋放慶大霉素后的TiO2納米管的掃描電鏡(SEM)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1如圖1-2所述，一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，首先利用陽(yáng)極氧化法在預(yù)處理后的鈦基板上制備TiO2納米管覆層，然后將制得的TiO2納米管浸到堿性溶液中，進(jìn)而通過共沉淀法在TiO2納米管覆層中負(fù)載慶大霉素，具體步驟如下I) TiO2納米管的制備:將純鈦片(純度>99. 9%)剪切為1. 5cmXl. 5em大小，Imm厚的基片，依次用400目、1000目、1500目的金相砂紙進(jìn)行打磨，然后放在乙醇、丙酮超聲清洗，干燥備用。將磨好并清洗好的Ti片連到陽(yáng)極，將Pt片連到陰極，將20ml蒸餾水，180ml乙二醇，O. 09M NH4F混合作為電解液，在20V的氧化電壓下反應(yīng)30min，整個(gè)電解反應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，將電解槽放在磁力攪拌儀進(jìn)行10r/min的磁力攪拌。反應(yīng)結(jié)束之后將Ti片取出進(jìn)行，用蒸餾水清洗，得到TiO2納米管(見圖3)。2)樣品的熱處理在真空馬弗爐中從室溫升至500°C，速率為2°C /min，保溫3h，然后隨爐降溫。3)慶大霉素的加載將制得的樣品浸到6. OM的NaOH溶液中Ih在其表面形成鈦酸鈉，進(jìn)而浸到1000mg/L的慶大霉素與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合液中，在細(xì)胞培養(yǎng)器中孵育48h，獲得負(fù)載慶大霉素的納米管(見圖4)。將加載好慶大霉素的樣品轉(zhuǎn)移到新的組織培養(yǎng)板上，浸到O. 5ml的PBS液中，37°C培養(yǎng)。經(jīng)過12h收集緩沖液，用含量測(cè)定試劑盒分析標(biāo)本表面釋放的藥物總量。結(jié)果顯示，緩沖液中的藥物量為148. 4mg/L，釋放慶大霉素后的TiO2納米管的掃描電鏡(SEM)圖如圖5所示。實(shí)施例2I) TiO2納米管的制備:將純鈦片(純度> 99.9%)剪切為1. 5cmX1. 5cm大小，Imm厚的基片，依次用400目、1000目、1500目的金相砂紙進(jìn)行打磨，然后放在乙醇、丙酮超聲清洗，干燥備用。將磨好并清洗好的Ti片連到陽(yáng)極，將Pt片連到陰極，將20ml蒸餾水，180ml乙二醇，O. 05M NH4F混合作為電解液，在30V的氧化電壓下反應(yīng)120min，整個(gè)電解反應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，將電解槽放在磁力攪拌儀進(jìn)行10r/min的磁力攪拌。反應(yīng)結(jié)束之后將Ti片取 出進(jìn)行，用蒸餾水清洗。2)樣品的熱處理在真空馬弗爐中從室溫升至550°C，速率為5°C /min，保溫2h，然后隨爐降溫。3)慶大霉素的加載將制得的樣品浸到5. OM的NaOH溶液中2h在其表面形成鈦酸鈉，進(jìn)而浸到1000mg/L的慶大霉素與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合液中，在細(xì)胞培養(yǎng)器中孵育72h，獲得負(fù)載慶大霉素的納米管。將加載好慶大霉素的樣品轉(zhuǎn)移到新的組織培養(yǎng)板上，浸到O. 5ml的PBS液中，37°C培養(yǎng)。經(jīng)過24h收集緩沖液，用含量測(cè)定試劑盒分析標(biāo)本表面釋放的藥物總量。結(jié)果顯示，緩沖液中的藥物量為127. 5mg/L。實(shí)施例3I) TiO2納米管的制備:將純鈦片(純度>99. 9%)剪切為1. 5cmXl. 5cm大小，Imm厚的基片，依次用400目、1000目、1500目的金相砂紙進(jìn)行打磨，然后放在乙醇、丙酮超聲清洗，干燥備用。將磨好并清洗好的Ti片連到陽(yáng)極，將Pt片連到陰極，將60ml蒸餾水，140ml乙二醇，O. 13M NH4F混合作為電解液，在60V的氧化電壓下反應(yīng)30min，整個(gè)電解反應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，將電解槽放在磁力攪拌儀進(jìn)行10r/min的磁力攪拌。反應(yīng)結(jié)束之后將Ti片取出進(jìn)行，用蒸餾水清洗。2)樣品的熱處理在真空馬弗爐中從室溫升至450°C，速率為2°C /min，保溫4h，然后隨爐降溫。3)慶大霉素的加載將制得的樣品浸到6. OM的NaOH溶液中O. 5h在其表面形成鈦酸鈉，進(jìn)而浸到1000mg/L的慶大霉素與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合液中，在細(xì)胞培養(yǎng)器中孵育24h，獲得負(fù)載慶大霉素的納米管。將加載好慶大霉素的樣品轉(zhuǎn)移到新的組織培養(yǎng)板上，浸到O. 5ml的PBS液中，37°C培養(yǎng)。經(jīng)過12h收集緩沖液，用含量測(cè)定試劑盒分析標(biāo)本表面釋放的藥物總量。結(jié)果顯示，經(jīng)過12h后，緩沖液中的藥物量為39. 4mg/L。實(shí)施例4I) TiO2納米管的制備:將純鈦片(純度> 99.9%)剪切為1. 5cmX1. 5cm大小，Imm厚的基片，依次用400目、1000目、1500目的金相砂紙進(jìn)行打磨，然后放在乙醇、丙酮超聲清洗，干燥備用。將磨好并清洗好的Ti片連到陽(yáng)極，將Pt片連到陰極，將IOOml蒸餾水，IOOml乙二醇，O. 09M NH4F混合作為電解液，在20V的氧化電壓下反應(yīng)10h，整個(gè)電解反應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，將電解槽放在磁力攪拌儀進(jìn)行10r/min的磁力攪拌。反應(yīng)結(jié)束之后將Ti片取出進(jìn)行，用蒸餾水清洗。2)樣品的熱處理在真空馬弗爐中從室溫升至500°C，速率為4°C /min，保溫2h，然后隨爐降溫。3)慶大霉素的加載將制得的樣品浸到6. OM的NaOH溶液中Ih在其表面形成鈦酸鈉，進(jìn)而浸到1000mg/L的慶大霉素與磷酸鹽緩沖液(PBS)混合液中，在細(xì)胞培養(yǎng)器中孵育48h，獲得負(fù)載慶大霉素的納米管。
將加載好慶大霉素的樣品轉(zhuǎn)移到新的組織培養(yǎng)板上，浸到0. 5ml的PBS液中，37°C培養(yǎng)。經(jīng)過12h收集緩沖液，用含量測(cè)定試劑盒分析標(biāo)本表面釋放的藥物總量。結(jié)果顯示，經(jīng)過12h后，緩沖液中的藥物量為442. 2mg/L。
權(quán)利要求
1.一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，首先利用陽(yáng)極氧化法在預(yù)處理后的鈦基板上制備TiO2納米管覆層，然后將制得的TiO2納米管浸到堿性溶液中，進(jìn)而通過共沉淀法在TiO2納米管覆層中負(fù)載慶大霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的鈦基板的預(yù)處理方法為先對(duì)Ti片進(jìn)行打磨，然后依次在丙酮、乙醇溶液中進(jìn)行超聲清洗、干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的陽(yáng)極氧化法是以鈦基板作為陽(yáng)極、Pt片作為陰極，在有機(jī)電解液中電解氧化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的有機(jī)電解液為乙二醇、H2O和NH4F的混合液，其中乙二醇的體積百分比含量為50vol% -90voI%, H2O的體積百分比含量為IOvol% -50vol%,NH4F的摩爾分?jǐn)?shù)含量為O. 05-0. 15M ;所述的電解氧化的電壓為20-60V，時(shí)間O. 5_10h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的TiO2納米管浸到堿性溶液中之前進(jìn)行熱處理，所述的熱處理為在真空馬弗爐中從室溫升至400°C 600°C，速率為1°C -5°C /min，保溫2h_4h，然后隨爐降溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的堿性溶液為1-10M的NaOH溶液，TiO2納米管浸到堿性溶液中的時(shí)間為O. 5-2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的共沉淀法為將堿性溶液處理后的TiO2納米管浸入慶大霉素與緩沖液組成的混合溶液中，在細(xì)胞培養(yǎng)器中孵育1-3天即得產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，其特征在于，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 2-7. 6，混合溶液中慶大霉素的濃度為1000mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用在Ti表面原位合成的TiO2納米管覆層負(fù)載慶大霉素的方法，首先利用陽(yáng)極氧化法在預(yù)處理后的鈦基板上制備TiO2納米管覆層，然后將制得的TiO2納米管浸到堿性溶液中，進(jìn)而通過共沉淀法在TiO2納米管覆層中負(fù)載慶大霉素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明建立了一種工藝簡(jiǎn)單、具有良好生物相容性的TiO2納米管覆層的制備路徑和利用TiO2納米管進(jìn)行藥物負(fù)載/釋放的模式，為人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體相關(guān)感染的預(yù)防和治療提供了新方法。
文檔編號(hào)C25D11/26GK103007347SQ20121048740
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者李華, 劉忠堂, 王珮, 劉河洲, 王立強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 上海市第六人民醫(yī)院