專利名稱：一種生物分子的固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物傳感器識別元件的制備方法，特別是涉及一種生物分子的固
定方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器是利用生物物質(zhì)(如酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜、微生物、細(xì) 胞等)作為識別元件，將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成可定量的物理、化學(xué)信號，從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì) 和化學(xué)物質(zhì)檢測和監(jiān)控的裝置。生物傳感器對生物物質(zhì)敏感，它以生物活性單元(如酶、抗體、核酸、細(xì)胞等)作為 生物敏感單元，對目標(biāo)待測物具有高度選擇性。其識別元件通常是固定在基底材料上的固 定化生物分子(生物敏感材料，包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物 質(zhì))。為了研制價(jià)格低廉、靈敏度高、選擇性好和壽命長的生物傳感器，固定化技術(shù)已成為世 界各國競相研究和探索的目標(biāo)。目前，固定生物分子(生物活性單元)的方法主要有吸附法、 交聯(lián)法、共價(jià)鍵合法、包埋法、組合法等。但吸附法不穩(wěn)定，組合法重現(xiàn)性較差，共價(jià)鍵合法 操作過程比較復(fù)雜，交聯(lián)法戊二醛的量難以控制，這些固定方法難以讓基底物質(zhì)以均一、穩(wěn) 定、單層分散的形式存在在電極等表面，從而也難以讓生物分子在修飾電極上形成單層有 序的排列。近年來利用液液界面法來合成高度單分散的功能納米結(jié)構(gòu)或二維納米結(jié)構(gòu)組裝 體引起了一些研究者的興趣與關(guān)注。例如，第三世界科學(xué)院院長C. N. R. Rao研究小組將 含有Au (PPh3) Cl的甲苯溶液與NaOH的水溶液混合后，慢慢加入四羥甲基氯化磷(THPC) 溶液作為還原劑，得到了高質(zhì)量的Au納米薄膜。與其它合成方法相比，液液界面法不需要 昂貴的儀器和設(shè)備，操作簡單安全，在普通的化學(xué)實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行。最重要的是，利用該方 法不僅可以合成高度單分散的功能納米材料，而且通過控制反應(yīng)參數(shù)還可使其在界面上 原位組裝得到高度有序的、大面積的納米薄膜或超晶格膜(Superlattice membrane),將所 得納米薄膜有效轉(zhuǎn)移到固體基底或電極上，有利于構(gòu)建納米基電子裝置和傳感器件。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有的生物分子固定化技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種 簡便、新穎、獨(dú)特的生物分子的固定方法，通過形成生物分子-金屬復(fù)合單分散膜，生物分 子在基底材料上定向排列形成單層有序的固定。本發(fā)明直接用液液界面方法來合成金屬納米材料，然后在水相中將生物分子通過 鍵合作用固定到液液界面上，從而得到生物分子-金屬納米復(fù)合材料。通過Iangmuir技術(shù)， 或直接用固體基底(如導(dǎo)電玻璃)可以很容易地提取在液液界面上形成的薄膜。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種生物分子的固定方法，包括以下步驟
(1)、液液界面法制備納米金屬粒子；
(2)、在液液界面上生物分子與納米金屬發(fā)生鍵合作用，在界面上形成生物分子-金屬
3復(fù)合單分散膜；
(3)、通過Iangmuir技術(shù)，或直接用固體基底提取液液界面上的生物分子-金屬復(fù)合單 分散膜。所述的納米金屬粒子包括液液界面法合成的納米金屬，如Au、Ag、Pd等。在液液 界面合成法中，常用的兩相(非極性相一極性相)體系包括甲苯-水、苯-水、氯仿-水、環(huán)己 烷-水、十八碳烯-甘油和石蠟-甘油等。添加合適的表面活性劑可使納米材料在界面上 有序的排列并穩(wěn)定在界面上，常用的表面活性劑有十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、四辛基 溴化胺(TOAB)、雙十八烷基二甲基氯化銨(DODA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。在制備納米 金屬時(shí)，常用的還原劑有水合胼、抗壞血酸、檸檬酸鈉、THPC等。實(shí)施例中采用的納米金，可按下述方法由液液界面法制得將氯金酸與三苯基磷 (摩爾比為1:1)超聲混合并溶解于甲苯中形成有機(jī)相，再將氫氧化鈉與十六烷基三甲基溴 化銨分別溶于二次蒸餾水中形成水相，待兩相分別穩(wěn)定后將有機(jī)相加入到水相形成液液界 面，待穩(wěn)定后向水相中加還原劑水合胼。待反應(yīng)結(jié)束后即可在液液界面上得到單層的金納 米粒子。將含有特殊官能團(tuán)的生物分子與納米金屬發(fā)生相互作用，可在界面上形成生 物-金屬復(fù)合單分散膜。所述的生物分子包括含有特定官能團(tuán)如-SH，-S-S-, -C00H, -NH2 等的目標(biāo)生物大分子，如辣根過氧化物酶(HRP)，血紅蛋白(Hb)，肌紅蛋白(Mb)，抗原，抗 體，DNA等。如HRP可以制成納米金與HRP復(fù)合膜，方法是向制備好金納米粒子的水相中加 入HRP，然后將其放置在4 0C條件下M小時(shí)，在此過程中，HRP被吸附到界面上并且形成單 層有序的陣列進(jìn)而形成了金與HRP的復(fù)合納米材料。設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊阂航缑娣磻?yīng)體系，選擇合適的反應(yīng)原料，可控合成金屬納米粒子 (如=Au, Ag，Pd等)薄膜后，注入含特定官能團(tuán)(如-SH，-S-S-，-C00H, -NH2等)的目標(biāo)生 物大分子，使之組裝到金屬納米粒子薄膜上，將得到生物分子一金屬納米粒子復(fù)合薄膜。采 用液液界面自組裝成膜然后轉(zhuǎn)移至電極等固體基底上，金屬納米粒子高度有序排列，其密 度和粒子間距可通過調(diào)節(jié)合成參數(shù)加以控制；生物活性分子可在高度密集的金屬納米粒子 薄膜上定向富集。除了生物分子與金屬納米粒子間配位作用的驅(qū)動(dòng)外，生物分子自身之間 的靜電相互作用、氫鍵、η - η堆積(stacking)以及親疏水相互作用都將驅(qū)使生物分子在 界面上高度取向排列，有利于協(xié)同和集合性質(zhì)的體現(xiàn)。液液界面上的生物分子-金屬復(fù)合單分散膜可以采用Iangmuir技術(shù)來提拉，或直 接用固體基底(如導(dǎo)電玻璃)也可以很容易地提取在液液界面上形成的薄膜。本發(fā)明提供了一種生物分子的固定方法，通過液液界面法制備納米金屬粒子，將 生物分子在液液界面上與納米金屬鍵合并固定，形成生物-金屬復(fù)合單分散膜。由于液液 界面法合成的納米材料能夠單層、有序的分散，使得生物分子也能有序地固定，所以用本發(fā) 明方法構(gòu)建的生物傳感器檢測的靈敏度大大提高，同時(shí)達(dá)到簡便、快速、穩(wěn)定地固定生物分 子的目的。本發(fā)明方法具有反應(yīng)迅速、條件溫和，工藝簡單，產(chǎn)率高，生物分子定向排列和重 現(xiàn)性好等特點(diǎn)。更具體地說，本發(fā)明的效果有
1.液液界面法合成納米材料通常只需一個(gè)合成過程，不需要復(fù)雜的后期處理過程；
2.液液界面可以很好的讓反應(yīng)生成的納米粒子形成有序的單層膜；
43、液液界面為生物分子有序的自組裝提供一個(gè)良好的環(huán)境；
4.液液界面法合成的單層有序的納米粒子薄膜可以使生物分子被有序的固定從而制 備生物傳感器。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以具體實(shí)施 方式為限，而是由權(quán)利要求加以限定。


圖1為本發(fā)明所用液液界面法合成金納米粒子的實(shí)驗(yàn)裝置圖2為本發(fā)明所用液液界面法合成HRP-金納米復(fù)合膜的掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1辣根過氧化物酶(HRP)的固定方法 (1)、制備納米級金
超聲條件下將AuCl3. HCl. 4H20(2. 49 mg，6. 05 mmoL)與三苯基磷(1. 6 mg, 6. 05 mmoL) 混合，混合后加甲苯(5 mL)超聲下分散溶解得有機(jī)相A; CTAB (0.8 mg, 2. 2 mmoL)加8 mL 二次蒸餾水，溶解后，加入NaO!K2 mg，50 mmoL)完全溶解得水相B ；將有機(jī)相A緩慢倒入 水相B中，待其穩(wěn)定后，向水相B中加入還原劑水合胼(25 mg, 515 mmoL ),反應(yīng)立即發(fā) 生，將其在30°C條件下放置M小時(shí)后界面有明顯的紫黑色物質(zhì)生成即納米金，如圖1所示。(2)、金與HRP復(fù)合膜的制備
HRP (1.5 mg)溶于ImL PBS(pH 7. 0)中，然后將其加入到制備好的納米金的水相中， 放置在4 0C條件下M小時(shí)，在此過程中，HRP通過金與二硫鍵的結(jié)合被吸附到界面上并且 形成單層有序的陣列進(jìn)而形成了金與HRP的復(fù)合膜，其掃描電鏡圖如圖2所示。(3)、生物分子-金屬復(fù)合膜提取
用預(yù)處理好的ITO電極(納米銦錫金屬氧化物)來提取上述制好的復(fù)合膜，將其置于室 溫條件下干燥，待其干燥好后，在電極上滴涂5 μ 殼聚糖，晾干，老化。實(shí)施例2 DNA的固定方法 (1)、制備納米級銀
將溶有(PPh3) 4C12的甲苯溶液作為有機(jī)相，堿性溶液作為水相，將有機(jī)相加入到水 相，待兩相穩(wěn)定后將四羥甲基氯化磷(THPC)溶液用注射器注入到水層，靜置一段時(shí)間，便可 在液液界面上得到納米銀。具體方法參見文獻(xiàn)(C. N. R. Rao, G. U. Kulkarni, Ved Varun Agrawal, Ujjal K. Gautam, Moumita Ghosh, Usha Tumkurkar. Use of the liquid -liquid interface for generating ultrathin nanocrystalline films of metals, chalcogenides, and oxides. Journal of Colloid and Interface Science 289 (2005) 305 - 318)。(2)、銀與DNA復(fù)合膜的制備
DNA溶于PBS中，然后將其加入到制備好的納米銀的水相中，放置，在此過程中，DNA與 銀結(jié)合被吸附到界面上并且形成單層有序的陣列進(jìn)而形成了銀與DNA的復(fù)合膜。(3)、生物分子-金屬復(fù)合膜提取
用預(yù)處理好的ITO電極(納米銦錫金屬氧化物)來提取上述制好的復(fù)合膜，將其置于室溫條件下干燥，待其干燥好后，在電極上滴涂5 μ 殼聚糖，晾干，老化。
權(quán)利要求
1.一種生物分子的固定方法，包括以下步驟(1)、液液界面法制備納米金屬粒子；(2)、在液液界面上生物分子與納米金屬發(fā)生鍵合作用，在界面上形成生物分子-金屬 復(fù)合單分散膜；(3)、通過Iangmuir技術(shù)，或直接用固體基底提取液液界面上的生物分子-金屬復(fù)合單 分散膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的納米金屬包括Au、 Ag 和 Pd。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的納米金屬為納米金。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的液液界面法制備 納米金的方法是，將氯金酸與三苯基磷按摩爾比為1:1超聲混合并溶解于甲苯中形成有機(jī) 相，再將氫氧化鈉與十六烷基三甲基溴化銨分別溶于二次蒸餾水中形成水相，將有機(jī)相加 入到水相形成液液界面，待穩(wěn)定后向水相中加還原劑水合胼；反應(yīng)結(jié)束后在液液界面上得 到單層的金納米粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的生物分子含有官能 團(tuán)-SH、-S-S-、-COOH 或-NH2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的生物分子包括辣根 過氧化物酶、血紅蛋白、肌紅蛋白、抗原、抗體或DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的生物分子為辣根過 氧化物酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的辣根過氧化物酶制 成與納米金的復(fù)合膜，方法是向制備好金納米粒子的水相中加入辣根過氧化物酶，然后將 其放置在4 0C條件下M小時(shí)，辣根過氧化物酶被吸附到界面上并且形成單層有序的陣列， 制得納米金與辣根過氧化物酶的復(fù)合膜。
全文摘要
本發(fā)明提出一種簡單、新穎的生物分子的固定方法，先用液液界面法合成金屬納米材料，然后將生物分子加到水相中通過鍵合作用固定到液液界面上，得到金屬納米材料與生物分子的復(fù)合膜，最后采用langmuir技術(shù)，或直接用固體基底提取液液界面上的生物分子-金屬復(fù)合單分散膜。本發(fā)明方法固定生物分子形成的生物分子-金屬納米復(fù)合材料制備過程簡單，具有生物分子單層有序分散、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
文檔編號B01D67/00GK102091541SQ20101058819
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉倩, 包建春, 戴志暉, 韓敏 申請人:南京師范大學(xué)