檢測(cè)葫蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的樣品制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所屬領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)領(lǐng)域，涉及一種攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的萌蘆科種 子樣品的處理，以及血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)于 1935 年 在英國(guó)首次報(bào)道，隨著萌蘆科作物在各國(guó)間的交流引種日益頻繁，隨后歐洲的德國(guó)、芬蘭、 丹麥、俄羅斯、希臘等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼報(bào)道出現(xiàn)該病毒的危害。
[0003] 黃瓜綠斑駁花葉病毒是蕪菁花葉病毒科（Tymoviridae)煙草花葉病毒屬 (Tobamovirus)的成員。主要侵染萌蘆科作物，可引起萌蘆、黃瓜、西瓜、南瓜等葉片黃化 畸形，生長(zhǎng)緩慢，結(jié)果延時(shí)，果實(shí)大部分黃化變白并產(chǎn)生黑綠色水疤狀的壞死斑，產(chǎn)量下 降。CGMMV是世界上許多國(guó)家和地區(qū)萌蘆科作物上的重要檢疫性病毒，在一些地區(qū)已造成大 田瓜類(lèi)作物的毀滅性損失，嚴(yán)重威脅萌蘆科作物安全生產(chǎn)。近年來(lái)，在我國(guó)一些地區(qū)出現(xiàn) 進(jìn)口源性的黃瓜綠斑駁花葉病毒，引起農(nóng)業(yè)部、質(zhì)檢總局等相關(guān)部門(mén)的高度重視。2002年 我國(guó)口岸檢疫部門(mén)曾從日本引進(jìn)的種苗中截獲到該病毒，目前該病毒主要分布在我國(guó)的河 北新樂(lè)、甘肅酒泉、北京平谷、遼寧蓋州以及廣西等部分地區(qū)。2006年12月21日，農(nóng)業(yè)部 發(fā)布788號(hào)公告，將黃瓜綠斑駁花葉病毒確定為全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。
[0004] CGMMV寄主范圍比較窄，自然侵染寄主主要是萌蘆科作物，通過(guò)人工汁液摩擦接 種可侵染蔓陀羅、莧色藜、昆諾藜、珊西煙、三生煙及矮牽牛。CGMMV是一種RNA病毒，典型 的種傳病毒，帶毒種子是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要侵染源。病毒粒子附于種子的表皮和內(nèi) 種皮上，種植后形成初侵染源。種傳寄主有黃瓜、西瓜、甜瓜和瓠瓜等，新鮮黃瓜種子傳毒率 為8% ;西瓜種子傳毒率為1 %~5%，其中外表皮帶毒量是內(nèi)表皮或胚乳的20倍；甜瓜種 傳毒率為10%~52%;瓠瓜種子帶毒率高達(dá)84%。此外，CGMMV也可通過(guò)病株的汁液接觸、 授粉和人工嫁接等方式傳播。
[0005] 種子帶毒是黃瓜綠斑駁花葉病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑，一旦田間出現(xiàn)種子帶 毒的病苗，便會(huì)以此為初侵染源，通過(guò)非介體因素傳播開(kāi)來(lái)，造成嚴(yán)重?fù)p失。此外，萌蘆 是我國(guó)很多西瓜產(chǎn)區(qū)用于嫁接防治枯萎病的主要砧木，萌蘆種子帶毒很容易通過(guò)嫁接傳 染接穗西瓜苗，從而擴(kuò)散到大田引起嚴(yán)重的后果。
[0006] 建立健全的種子病毒檢測(cè)方法，對(duì)種傳傳播為主的CGMMV快速、準(zhǔn)確、高靈敏度的 鑒定及檢疫檢測(cè)，加強(qiáng)進(jìn)境萌蘆科種子的檢驗(yàn)檢疫工作，以及防止該病毒的傳入具有十分 重要的意義，也對(duì)從源頭上控制該病毒的擴(kuò)散蔓延有重要指導(dǎo)意義。
[0007] CGMMV早期的檢測(cè)方法主要依靠生物學(xué)鑒定和電鏡觀察，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展， 該病毒的檢測(cè)技術(shù)逐漸從傳統(tǒng)的檢測(cè)方法向基于核酸的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展。目前對(duì)CGMMV的檢 測(cè)方法有：生物學(xué)方法、電子顯微鏡技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等。其中比較常用的 檢測(cè)方法是血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)。
[0008] 生物學(xué)鑒定方法雖然簡(jiǎn)單易行，但所需時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，且僅靠肉眼觀察，穩(wěn)定 性和可信性不高。
[0009] 利用電子顯微鏡技術(shù)可觀察受侵染細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化以及病毒粒體的大小和形態(tài)。 由于電子顯微技術(shù)檢測(cè)需要很高的硬件要求，非專(zhuān)業(yè)人員難以完成，因而該方法只適合于 輔助鑒定。
[0010] 分子生物學(xué)技術(shù)是從病毒核酸水平來(lái)檢測(cè)病毒，常用的分子生物學(xué)技術(shù)主要是 RT-PCR檢測(cè)，RT-PCR技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)且所需樣品少。但是由于帶毒萌 蘆科種子本身脂肪含量過(guò)高所以難于提取高質(zhì)量的RNA或CGMMV的病毒含量太低不足以產(chǎn) 生足夠的模板，所以使用常規(guī)的液氮研磨方法提取帶毒的萌蘆科種子的RNA，并用RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，往往不能擴(kuò)增到目的條帶。所以本發(fā)明對(duì)帶毒的萌蘆科種子樣品進(jìn)行處理 能夠提高病毒模板的濃度。
[0011] 血清學(xué)方法是利用專(zhuān)化性抗血清來(lái)檢測(cè)該病毒，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作 簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)1~10ng/mL病毒.血清學(xué)檢測(cè)方法有許多形式，目前也常用ELISA 檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)萌蘆科種子的帶毒情況。
[0012] 防止CGMMV通過(guò)種子貿(mào)易和遠(yuǎn)距離調(diào)運(yùn)而擴(kuò)散是控制該病毒傳入的前提，加強(qiáng)萌 蘆科作物種子的檢測(cè)，是防止該病害從種子源頭擴(kuò)散流行的關(guān)鍵。從源頭控制該病害的蔓 延，對(duì)保護(hù)西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供檢測(cè)萌蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉 病毒的樣品制備方法及其應(yīng)用。
[0014] 一種檢測(cè)萌蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的樣品制備方法，包括如下步驟：
[0015] 1)種子樣品種仁和種殼的分離：將每顆萌蘆科種子用眼科剪刀沿側(cè)面剖開(kāi)，剝除 種仁部分，收集剩余的種殼；
[0016] 2)樣品的研磨：以1粒種子分離的種殼作為1個(gè)樣品放入已放3-5顆直徑 2. 5mm實(shí)心鋼珠的I. 5-2ml印pendorf離心管中，蓋上離心管蓋子，在離心管上做好標(biāo)記 后將其丟入液氮中冷凍處理1分鐘后撈出，然后放入上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司貨號(hào)為 TissueIyser-48的全自動(dòng)樣品快速研磨儀中以頻率60HZ研磨60秒，使樣品呈粉末狀，如果 樣品沒(méi)有呈粉末狀可重復(fù)研磨一次；
[0017] 3)該步驟包括黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取或黃瓜綠斑駁花葉病毒RNA的提取 兩種處理：
[0018] 黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取步驟為：研磨好的樣品中加入0.1 -Iml ρΗ7· 40. 01mol/L PBS 磷酸鹽緩沖液，在 Scientific Industries 公司的 VortexGenie2 禍旋 混合器上混勻0. 5-5分鐘，然后5000rpm離心3分鐘后取上清液作為黃瓜綠斑駁花葉病毒 的粗提取液進(jìn)行血清學(xué)方法檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒；
[0019] 或黃瓜綠斑駁花葉病毒RNA的提取步驟為：研磨好的樣品中加入lmlTRIzol試劑 后用常規(guī)TRIzoI試劑法提取病毒RNA，提取的病毒RNA用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子檢 測(cè)。
[0020] 在上述樣品制備方法基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開(kāi)了一種使用該方法制備的樣品的用 途，具體為將該方法制備的黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取液和RNA分別用于萌蘆科種子中 黃瓜綠斑駁花葉病毒的血清學(xué)和分子方法檢測(cè)。
[0021] 所述的血清學(xué)方法包括 dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA 和 TAS-ELISA。
[0022] 所述的dot-ELISA血清學(xué)檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0023] 1)吸取權(quán)利要求書(shū)1中獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取液2. 5 μ 1，點(diǎn)樣于硝酸 纖維素膜，并設(shè)置陽(yáng)性陰性對(duì)照，室溫靜置晾干10分鐘；
[0024] 2)硝酸纖維素膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST封閉液中37°C封閉30分鐘；
[0025] 3)上述硝酸纖維素膜放入含1:5000倍稀釋的抗黃瓜綠斑駁花葉病毒鼠單抗中， 37°C孵育1-2小時(shí)；
[0026] 4)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動(dòng)洗滌3次，每次3-5分鐘；
[0027] 5)硝酸纖維素膜放入含1:8000倍稀釋的Sigma公司貨號(hào)為A3562的堿性磷酸酶 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG二抗中，37°C孵育1-2小時(shí)；
[0028] 6)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動(dòng)洗滌4次，再用PBS洗1次，每次3-5分鐘；
[0029] 7)在IOml的顯色緩沖液中加入Promega公司貨號(hào)為S3771的BCIP 33ul，NBT 66ul，將其混勻，硝酸纖維素膜晾干后浸入其中室溫避光顯色5-15分鐘；
[0030] 8)待陽(yáng)性樣品呈現(xiàn)紫色而陰性對(duì)照未顯色時(shí)，再將顯色完全的硝酸纖維素膜移至 去離子水中漂洗終止顯色反應(yīng)，記錄結(jié)果。
[0031 ] 所述的分子方法檢測(cè)包括RT-PCR和定量RT-PCR。
[0032] 所述的RT-PCR檢測(cè)