專利名稱：一種利用ssr分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物品種的分子生物學(xué)鑒定方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法。
背景技術(shù)：
芒麻(Boehmeria nivea L.Gaud),又叫“中國草”,起源于中國，為蕁麻科芒麻屬的多年生宿根性草本植物，是中國特色的天然紡織原料[1]。除傳統(tǒng)的纖維價(jià)值外，苧麻的藥用價(jià)值、飼料用途、水土保持、工業(yè)原料、生物能源等多功能用途已開始受到關(guān)注[2_5]。迄今為止，我國是收集、保存苧麻屬種質(zhì)資源最多的國家，僅國家種質(zhì)長沙苧麻圃就擁有2000多份材料，其中的栽培資源已廣泛為育種和生產(chǎn)所利用[6]。在收集種質(zhì)資源的過程中發(fā)現(xiàn)，苧麻存在同物異名和同名異物現(xiàn)象。而且，隨著選育品種的增加，面對(duì)如此多的新種質(zhì)，進(jìn)行品種鑒定不僅對(duì)苗木繁育具有重要意義，也是保護(hù)這些品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的需要。傳統(tǒng)上苧麻一般采用形態(tài)性狀進(jìn)行種質(zhì)鑒定。采用田間調(diào)查品種性狀的方法，時(shí)間長，費(fèi)用高；且苧麻為宿根性多年生植物，生命周期長，種質(zhì)資源間的形態(tài)差異性狀少，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)性狀鑒定方法區(qū)分種質(zhì)較為困難。隨著DNA分子標(biāo)記的不斷發(fā)展和完善，從分子水平上對(duì)種質(zhì)的遺傳特異性快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、不受環(huán)境條件影響的鑒定成為可能。我們課題組2010年利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了 42份苧麻種質(zhì)的分子身份證[7]以區(qū)分和鑒定品種。但是ISSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果相對(duì)不穩(wěn)定，重復(fù)性差。SSR (simplesequence repeats)分析技術(shù)具有染色體上分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性、分辨率高和易于檢測等優(yōu)點(diǎn)M，自開發(fā)以來就成為最為有效構(gòu)建許多作物指紋圖譜的工具[9]。高運(yùn)來等[10]利用43對(duì)SSR引物對(duì)黑龍江省6個(gè)積溫帶的83個(gè)大豆品種構(gòu)建了分子身份證。王黎明等[11]利用41對(duì)SSR引物構(gòu)建了 142份甜高粱的分子身份證。陳昌文等[12]利用8對(duì)SSR引物構(gòu)建了 176份桃種質(zhì)資源的分子身份證。目前，尚未有利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建苧麻分子身份證的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在創(chuàng)立一種利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法。一種利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，包括以下步驟:(I)提取各樣品芒麻種質(zhì)DNA ;(2)利用設(shè)計(jì)的8對(duì)苧麻EST-SSR引物，擴(kuò)增苧麻的基因組DNA ；(3)記錄每個(gè)樣品每對(duì)引物的DNA擴(kuò)增帶型；(4)根據(jù)DNA擴(kuò)增帶型區(qū)分鑒定苧麻品種；所述的8對(duì)苧麻EST-SSR引物序列如下:ibfc50:F:AACAATCCAGGAGTGGCAATC R:ACAAGCGAAGATCGTCTCATC ;
ibfc40F:TGTATAGAACTGAGTAAATGATTGR:CAACTTTCTTAAACCACTTTCG ；Ibfc27F:AGCCAGGTTCCAGAAGTCCR:CATAATCACAAAGTCTCGGTTCC ；IbfcIIF:GCGGAGGCTTAATTTGCTTTGR:ACTCAATACATACACGGCACTAG ； ibfc65F:ACGAACCACAACACAGAGAGR:ACGAGGGAACACCAGAGAG ；ibfc62F:GAAACTATTTCCACCAACAAAGR:ACACACATTCCTACACACC ；ibfc53F:GGCTCAAGTTTGCTCATAGATTCR:CGGCTTCGCTTTAGGATTTG ；ibfc20F:AGTGCGGAGATAACTGTTCR:GGCTACTTTATTCTAAACCAAAC。PCR 反應(yīng)體系:20 μ L，
體系組成終濃度
Mg2+2.0mmol/L
Taq BufferIX
dNTP Mix200umol/L~
Taq EnzymeIU
Primers0.25 μ mol/L
DNA90ng體系中余量為水。PCR擴(kuò)增程序:951:預(yù)變性51^11，941:變性lmin，根據(jù)引物的退火溫度復(fù)性50sec，72°C延伸lmin, 29次循環(huán)后72°C延伸IOmin ；引物ibfc50、ibfc40、ibfc27、ibfcll、ibfc65、ibfc62、ibfc53、ibfc20 的退火溫度分別為:50° C、52° C、56° C、51° C、60° C、54° C、56° C、54° C。步驟(4)是對(duì)每個(gè)樣品不同的DNA擴(kuò)增帶型賦值，構(gòu)建苧麻SSR分子標(biāo)記身份證，以區(qū)分苧麻品種。首先將每個(gè)樣品分別加入I個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增，即每對(duì)引物擴(kuò)增出來的帶型均不超過9種，然后將每對(duì)引物擴(kuò)增出來的所有帶型種類均從I開始按序編號(hào)，擴(kuò)增的條帶模糊不清，無法正確辨別帶型以O(shè)表示，最后將每個(gè)樣品的每對(duì)引物的帶型編號(hào)依次組合在一起，形成8位的分子身份證。上述方法根據(jù)所述的8對(duì)引物可以區(qū)分108個(gè)苧麻品種。
本發(fā)明方法中，相對(duì)于我們實(shí)驗(yàn)室以前利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的苧麻分子身份證具有以下優(yōu)勢(shì)。首先，分子身份證編碼原則方面，直接規(guī)定了第N個(gè)標(biāo)記引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)應(yīng)分子身份證的第N位，因此省略對(duì)標(biāo)記名稱的表述；同時(shí)，由于每個(gè)標(biāo)記的引物擴(kuò)增的帶型總數(shù)不超過9，從I開始按序編號(hào)，擴(kuò)增的條帶模糊不清，無法正確辨別帶型以O(shè)表示，因此保證了分子身份證每I位上也只有I位數(shù)，相比以前的苧麻分子身份證，書寫非常簡潔。其次，篩選的EST-SSR引物好，實(shí)驗(yàn)操作過程簡單，易操作，擴(kuò)增帶型清晰穩(wěn)定，重復(fù)性好。苧麻SSR分子標(biāo)記身份證方法的確立，為準(zhǔn)確鑒別苧麻種質(zhì)資源，尤其是同物異名和同名異物現(xiàn)象奠定了基礎(chǔ)，也為新品種保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。


圖1為引物ibfc50在1-46種質(zhì)中的擴(kuò)增圖；其中前5個(gè)泳道分別代表5個(gè)帶型，第7個(gè)泳道為第6個(gè)帶型，第15個(gè)泳道為第7個(gè)帶型，第18個(gè)泳道為第8個(gè)帶型，第26個(gè)泳道為第9個(gè)帶型；圖2為引物ibfc65擴(kuò)增的6種帶型示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1I材料與方法1.1 材料108份苧麻種質(zhì)資源。原產(chǎn)地來自于中國、日本、印度尼西亞、緬甸4個(gè)國家。其中國外種質(zhì)資源5份，國內(nèi)種質(zhì)資源103份。國內(nèi)種質(zhì)資源包括部分主栽地區(qū)的地方品種和全國各苧麻育種單位育成的品種(品系)。以上材料均種植于國家長沙苧麻種質(zhì)圃。
權(quán)利要求
1.一種利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取各樣品芒麻種質(zhì)DNA； (2)利用設(shè)計(jì)的8對(duì)苧麻EST-SSR引物，擴(kuò)增苧麻的基因組DNA； (3)記錄每個(gè)樣品每對(duì)引物的DNA擴(kuò)增帶型； (4)根據(jù)DNA擴(kuò)增帶型區(qū)分鑒定苧麻品種； 所述的8對(duì)苧麻EST-SSR引物序列如下: ibfc50:F:AACAATCCAGGAGTGGCAATCR:ACAAGCGAAGATCGTCTCATC ；ibfc40F:TGTATAGAACTGAGTAAATGATTGR:CAACTTTCTTAAACCACTTTCG ；Ibfc27F:AGCCAGGTTCCAGAAGTCCR:CATAATCACAAAGTCTCGGTTCC ；IbfcIIF:GCGGAGGCTTAATTTGCTTTGR:ACTCAATACATACACGGCACTAG ；ibfc65F:ACGAACCACAACACAGAGAGR:ACGAGGGAACACCAGAGAG ；ibfc62F:GAAACTATTTCCACCAACAAAGR:ACACACATTCCTACACACC ；ibfc53F:GGCTCAAGTTTGCTCATAGATTCR:CGGCTTCGCTTTAGGATTTG ；ibfc20F:AGTGCGGAGATAACTGTTCR:GGCTACTTTATTCTAAACCAAAC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系:20 μ L，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，其特征在于， PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，根據(jù)引物的退火溫度復(fù)性50sec，72°C延伸lmin，29次循環(huán)后72°C延伸IOmin ； 引物 Ibfc50、ibfc40、ibfc27、ibfcll、ibfc65、ibfc62、ibfc53、ibfc20 的退火溫度分別為:50。C、52。C、56。C、51。C、60。C、54。C、56。C、54。C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，其特征在于，步驟(4)具體是對(duì)每個(gè)樣品不同的DNA擴(kuò)增帶型賦值，構(gòu)建苧麻SSR分子標(biāo)記身份證，以區(qū)分苧麻品種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，其特征在于，首先將每個(gè)樣品分別加入I個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增，即每對(duì)引物擴(kuò)增出來的帶型均不超過9種，然后將每對(duì)引物擴(kuò)增出來的所有帶型種類均從I開始按序編號(hào)，擴(kuò)增的條帶模糊不清，無法正確辨別帶型以O(shè)表示，最后將每個(gè)樣品的每對(duì)引物的帶型編號(hào)依次組合在一起，形成8位的分子身份證。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4或5所述的利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，其特征在于，根據(jù)所述的8對(duì)引物區(qū)分108個(gè) 苧麻品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用SSR分子標(biāo)記鑒定苧麻品種的方法，首先提取苧麻種質(zhì)資源的DNA，然后通過EST-SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增帶型構(gòu)建苧麻的分子身份證，以區(qū)分和鑒定苧麻品種。本發(fā)明方法具有以下優(yōu)勢(shì)首先，分子身份證編碼原則方面，直接規(guī)定了第N個(gè)標(biāo)記引物的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)應(yīng)分子身份證的第N位，省略對(duì)標(biāo)記名稱的表述；同時(shí)，由于每個(gè)標(biāo)記的引物擴(kuò)增的帶型不超過9，因此保證了分子身份證每1位上也只有1位數(shù)，書寫非常簡潔。其次，EST-SSR引物形成和實(shí)驗(yàn)操作過程簡單，易操作，擴(kuò)增帶型清晰穩(wěn)定，重復(fù)性好。該方法為準(zhǔn)確鑒別苧麻種質(zhì)資源，尤其是同物異名和同名異物現(xiàn)象奠定了基礎(chǔ)，也為新品種保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103194539SQ20131012054
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者陳建華, 欒明寶, 王曉飛, 許英, 孫志民, 鄒自征 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所